In Vitro Análise Funcional de Células T Reguladoras: Foco na Proliferação e Diferenciação

Resumo

Esse protocolo fornece uma estratégia de co-cultura in vitro para investigar os efeitos das células T reguladoras na proliferação e diferenciação das células T efetoras.

Resumo

As células T reguladoras (Treg) desempenham papéis-chave na manutenção da homeostase imunológica. Anomalias na função das células Treg estão associadas a várias doenças, incluindo doenças autoimunes, rejeição de transplante de órgãos, infecção e câncer. Manipular células Treg é considerado uma estratégia terapêutica potencial para tratar doenças inflamatórias, incluindo distúrbios autoimunes, rejeição de transplante de órgãos sólidos, doenças do enxerto contra hospedeiro e doenças alérgicas. Ensaios clássicos de supressão de células Treg in vitro avaliam principalmente o efeito inibitório das células Treg na proliferação das células efetoras T (Teff). No entanto, além da proliferação, a diferenciação das células T é importante para que as células T desempenhem suas funções imunológicas. Portanto, esse protocolo fornece um ensaio modificado in vitro de supressão de células Treg para investigar os efeitos das células Treg na proliferação e diferenciação das células Teff. Neste protocolo, a preparação de células Treg de camundongos e células T naïves é introduzida primeiro, seguida pela estratégia de co-cultura para estudar os efeitos regulatórios das células Treg na proliferação e diferenciação das células Teff, incluindo células Th1 e Th17, e, finalmente, a estratégia de coloração para citometria de fluxo após co-cultura. Essa análise funcional in vitro das células Treg pode ser usada para investigar os efeitos das células Treg na proliferação e polarização das células T.

Introdução

As células T (Treg⁾ reguladoras CD4⁺CD25⁺Foxp3+ são mediadores importantes da homeostase^{imunológica 1}. As células Treg suprimem ativamente respostas imunes excessivas e mantêm tolerância autoimune, prevenindo assim que reações imunes danificem tecidos e órgãos^{normais 2}. Manipular células Treg é considerado uma estratégia terapêutica potencial para tratar doenças inflamatórias como distúrbios autoimunes, rejeição de transplante de órgãos sólidos, doença enxerto contra hospedeiro e doenças^{alérgicas 3,4,5}. Enquanto isso, inibir a função das células de Treg é considerado uma estratégia eficaz para ativar a imunidade^{antitumoral 6,7}. Estudos clínicos investigaram a adoção da terapia regulatória com células T ou o tratamento em baixa dose com IL-2 para doenças autoimunes, transplante de órgãos sólidos e doença enxerto contra^{hospedeiro 8,9,10}. Além disso, estudos em células Treg modificadas, incluindo células do receptor de antígeno quimérico (CAR)-Treg e células T-cell receptor (TCR)-Treg, também estão ganhando cada vez mais atenção ^11,12.

Até o momento, a terapia com células Treg não foi amplamente estabelecida no tratamento clínico de rotina. Para apoiar a aplicação clínica da terapia com células Treg, pesquisas sistemáticas e avaliação de suas funções são importantes. Uma estratégia comum para avaliar as funções das células T reguladoras in vitro é o ensaio de supressão Treg^{in vitro 13}, que pode detectar a função supressora das células Treg na proliferação das células T (Teff) efetoras. No entanto, o ensaio padrão in vitro de supressão de Treg não avalia a diferenciação das células Teff. Se a proliferação e diferenciação das células T efetoras puderem ser avaliadas simultaneamente, mais informações sobre a função das células T reguladoras poderão ser obtidas.

Aqui, apresentamos um ensaio modificado de supressão de células Treg in vitro , denominado "análise funcional in vitro de células Treg" (Figura 1). Esse protocolo fornece uma estratégia de co-cultura in vitro para investigar os efeitos das células Treg na proliferação e diferenciação das células Teff.

Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram autorizados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital da China Ocidental, Universidade de Sichuan (Aprovação Nº 20250814006, 20211212A). Todos os camundongos usados neste experimento estavam em um fundo genético C57BL/6.

1. Preparação de soluções

1. Prepare o tampão de separação celular ativada por fluorescência (FACS): 1× PBS contendo 0,5% de albumina sérica bovina (BSA).
2. Prepare o tampão de separação celular ativada magneticamente (MACS): 1× PBS contendo 0,5% de BSA e 2 mM de ácido etilenediamina tetraacético (EDTA).
3. Prepare meio de cultura celular: meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM de L-glutamina, 10 mM de HEPES, 55 μM β-mercaptoetanol, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.

2. Preparação de linfócitos de camundongo C57BL/6

1. Pegue o baço e os linfonodos periféricos (LNs) de um camundongo C57BL/6 de 6–8 semanas (masculino ou feminino) em condições estéreis e coloque-os em um tubo centrífugo de 50 mL com 5 mL de tampão FACS.
   NOTA: A dissecação do baço e dos LNs deve ser realizada de acordo com procedimentos padrão.
2. Coloque um filtro de célula de 70 μm em um tubo centrífugo de 50 mL, depois coloque o baço e as LNs sobre o peneira, e use um pistão de seringa de 5 mL para moer o tecido suavemente por 1 minuto. Durante a moagem, enxágue o penador 3 vezes com o buffer FACS. Certifique-se de moer todo o tecido completamente e enxaguar as células no tubo da centrífuga. Depois de moer, remova a peneira.
3. Centrifuge a 4 °C, 350 × g por 7 minutos.
4. Remova o sobrenadante, resuspenda a pastilha celular em 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos e deixe a suspensão em temperatura ambiente por 3 a 5 minutos.
5. Adicione imediatamente o buffer FACS ao tubo da centrífuga a um volume de 15–20 mL para terminar a lise, e centrifuge a 4 °C, 350 × g por 7 minutos.
6. Remova o sobrenadante, adicione 10 mL de buffer FACS e ressuspenda suavemente a célula pellet.
7. Pegue 10 μL de suspensão celular e use coloração com tripano azul para contar o total de linfócitos vivos.
   NOTA: Essas células são linfócitos CD45.2⁺ .

3. Preparação de linfócitos de camundongos CD45.1

1. Pegue o baço e as LNs de um camundongo CD45.1 de 6–8 semanas (macho ou fêmea) em condições estéreis e coloque-os em um tubo centrífugo de 50 mL com 5 mL de tampão FACS.
2. Prepare linfócitos do camundongo CD45.1 seguindo os mesmos passos descritos acima.
   NOTA: Essas células são linfócitos CD45.1⁺ .

4. Preparação de células T naïf CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺

NOTA: Todo o processo utiliza o Kit de Isolamento de Células T CD4⁺CD62L⁺ para MACS. O buffer MACS é pré-resfriado a 4 °C, e todas as condições de centrifugação são 4 °C, 350 × g por 7 minutos.

1. Colete a suspensão celular de camundongos C57BL/6, centrifuge e descarte o sobrenadante, adicione 400 μL de buffer MACS e 100 μL de Coquetel Biotina-Anticorpo CD4⁺ T Cell ao tubo da centrífuga por 1 ×^{10 8} células iniciais. Misture suavemente e incube a 4 °C por 5 minutos no escuro.
2. Adicione 300 μL de buffer MACS e 200 μL de Microesferas de Antibiotina ao tubo da centrífuga a partir da etapa 4.1 por 1 ×^{10 8} células iniciais no total. Misture suavemente e incube a 4 °C por 10 minutos no escuro.
3. Adicione 10 mL de buffer MACS, centrifuge e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 2 mL de buffer MACS.
4. Coloque a coluna LS no separador magnético MACS apropriado. Use 3 mL de buffer MACS para enxaguar a coluna. Espere até que o buffer na coluna drene completamente antes de prosseguir para a próxima etapa.
   NOTA: A capacidade máxima de carga das células da coluna LS é de 2 × 10⁹ células, incluindo células positivas e negativas, e o número máximo de células positivas que pode capturar é 1 × 10⁸. Normalmente, um único mouse só precisa de uma coluna LS aqui.
5. Carregue a suspensão da célula do passo 4.3 na coluna LS. Quando a suspensão da célula fluir completamente para dentro da coluna, use 3 mL de buffer MACS para lavar a coluna. Colete todo o líquido de fluxo em um novo tubo centrífuga de 15 mL.
   NOTA: Estas são as células CD4⁺CD25^– T.
6. Centrifuge o total de células CD4⁺CD25^– T obtidas na etapa 4.5, descarte o sobrenadante e obtenha o pellet celular.
7. Adicione 800 μL de buffer MACS e 200 μL de microesferas CD62L ao pellet celular por 1 ×^{10 8} células iniciais. Misture suavemente e incube a 4 °C por 10 minutos no escuro.
8. Adicione 10 mL de buffer MACS ao tubo da centrífuga, centrifuge e descarte o sobrenadante, e ressuspenda a célula em 500 μL de buffer MACS.
9. Coloque a coluna MS no separador magnético MACS apropriado e use um buffer MACS de 1 mL para enxaguar a coluna.
10. Carregue a suspensão da célula na coluna MS. Quando a suspensão fluir completamente para dentro da coluna, use 1 mL de buffer MACS para lavar a coluna duas vezes.
11. Remova a coluna MS do separador magnético e coloque-a em um novo tubo centrífugo de 15 mL. Adicione 1 mL de buffer MACS à coluna e imediatamente empurre firmemente o êmbolo para eluir as células marcadas com esferas magnéticas.
12. Conte as células, centrifuge e descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em um volume apropriado de meio de cultivo e mantenha o tubo no gelo.
    NOTA: Essas células são células T naïves CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ . Normalmente, aproximadamente 8 × 10⁶ a 1 × 10⁷ células T naïves CD4⁺CD25^–CD62L⁺ podem ser purificadas de um camundongo; a inclusão de linfonodos periféricos pode aumentar o rendimento.
13. Determine a pureza das células isoladas: Pegue 5 × 10⁴ células T CD4⁺CD62L⁺ isoladas e resuspenda-as em 50 μL de solução de anticorpos em um tubo centrífugo de 1,5 mL.
    NOTA: Prepare a solução de anticorpos adicionando o anticorpo anti-camundongo CD4 PerCP-Cy5.5, anticorpo anti-camundongo CD62L FITC e anti-camundongo CD25 PE no buffer FACS em uma proporção de 1:100.
14. Após a incubação de 20 minutos a 4 °C no escuro, adicione 1 mL de tampão FACS para lavar as células. Centrifuge as células, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 μL de buffer FACS.
15. Detecte a pureza das amostras por citometria de fluxo.
    NOTA: Para detalhes da análise do citômetro de fluxo, consulte o manual do usuário do instrumento ou o protocolo¹⁴ previamente reportado. A pureza das células T naïves CD4⁺CD25^–CD62L⁺ deve ser superior a 95% na amostra isolada de células T (Figura 2).

5. Preparação de células enriquecidas com Treg CD45.1⁺CD4⁺CD25^{+ e células não} CD4+ enriquecidas com antígenos

NOTA: Todo o processo utiliza o Kit de Isolamento de Células T Reguladoras CD4⁺CD25⁺ para MACS, e as instruções do kit foram otimizadas para obter simultaneamente ^{células não} CD4+ enriquecidas com células apresentadoras de antígeno (APC) e células enriquecidas ^{com Treg} CD4⁺CD25+. O buffer MACS é pré-resfriado a 4 °C, e todas as condições de centrifugação são 4 °C, 350 × g por 7 minutos.

1. Colete a suspensão celular dos camundongos CD45.1, centrifuge e descarte o sobrenadante, adicione 400 μL de buffer MACS pré-resfriado e 100 μL do Cocktail Biotina-Anticorpo de Células T Reguladoras CD4^+CD25+ ao tubo da centrífuga por 1 × 10⁸ células iniciais. Misture suavemente e incube a 4 °C por 10 minutos no escuro.
2. Sem lavagem, adicione diretamente 380 μL de buffer MACS pré-resfriado, 200 μL de microesferas anti-biotina e 20 μL de anticorpo CD25-PE por 1 ×^10,8 células iniciais no tubo da centrífuga a partir da etapa 5.1. Misture suavemente e incube a 4 °C por 15 minutos no escuro.
3. Adicione 10 mL de buffer MACS ao tubo da centrífuga, centrifuge e descarte o sobrenadante, depois ressuspenda o pellet de célula em 500 μL de buffer MACS por 1 ×^{10 8} células iniciais.
4. Coloque a coluna LD no separador magnético MACS apropriado e enxágue a coluna com 2 mL de buffer MACS. Espere até que o buffer na coluna drene completamente antes de prosseguir para a próxima etapa.
5. Carrega lentamente a suspensão da célula do passo 5.3 na coluna LD. Quando a suspensão da célula fluir completamente para dentro da coluna, lave a coluna duas vezes com buffer MACS de 2 mL. Colete todo o líquido de fluxo em um novo tubo centrífuga de 15 mL.
6. Remova a coluna LD do separador magnético e coloque-a em um novo tubo centrífugo de 15 mL. Adicione 3 mL de buffer MACS à coluna LD, pressione imediatamente o êmbolo firmemente para expulsar ^{as células} não-CD4+ marcadas como Microesferas. Conte as células, centrifuge, ressuspenda as células em um volume apropriado de meio de cultivo celular para alcançar uma concentração celular de 1 × 10⁷ células/mL e mantenha o tubo no gelo.
   NOTA: Essas células não-CD4⁺ consistem principalmente de APCs, como macrófagos, células dendríticas e células B. Neste protocolo, essas células são usadas ^{como uma} fração não CD4+ enriquecida com APC.
7. Centrifuge o total de células CD4⁺ T coletadas na etapa 5.5, descarte o sobrenadante e obtenha a pastilha celular.
8. Adicione 900 μL de buffer MACS e 100 μL de Microesferas Anti-PE ao pellet celular por 1 × 10⁸ células iniciais no total. Misture suavemente e incube a 4 °C por 15 minutos no escuro.
9. Coloque a coluna MS no separador magnético MACS apropriado e enxágue a coluna com 500 μL de buffer MACS pré-resfriado. Espere até que o buffer na coluna drene completamente antes de prosseguir para a próxima etapa.
10. Carregue lentamente a suspensão da célula do passo 5.8 na coluna MS. Quando a suspensão da célula fluir completamente para dentro da coluna, lave a coluna duas vezes com buffer MACS de 1 mL. Colete o líquido de fluxo em um novo tubo centrífugo de 15 mL.
    NOTA: As células no líquido de fluxo neste momento são ^CD4+CD25^– células T.
11. Desconecte a coluna MS do separador magnético e posicione-a sobre um tubo centrífugo novo de 15 mL. Adicione 1 mL de buffer MACS à coluna, depois pressione rapidamente o êmbolo para recuperar as células enriquecidas com Treg CD4^+CD25+ marcadas com esferas magnéticas.
12. Após contar as células, centrifuge a suspensão e remova o sobrenadante. Resuspenda o pellet em meio de cultivo suficiente para obter uma concentração final de 2 × 10⁶ células/mL, e mantenha o tubo no gelo.
    NOTA: Essas células são células enriquecidas com Treg CD45.1⁺CD4^+CD25+. Normalmente, aproximadamente 8 × 10^{células de 5} a 1 × 10^{células de 6} CD4⁺CD25⁺ podem ser purificadas de um único camundongo; a inclusão de linfonodos periféricos pode aumentar o rendimento.
13. Determinar a pureza das células isoladas enriquecidas com Treg ^CD4+CD25+: Recolha 5 ×^{10 células isoladas de 4} CD4⁺CD25⁺ enriquecidas com Treg e 5 ×^{10 4} células isoladas enriquecidas com APC não CD4⁺ e ressuspenda-as em 50 μL de solução de anticorpos.
    NOTA: Prepare a solução de anticorpos adicionando o anticorpo anti-camundongo CD4 PerCP-Cy5.5 e o anticorpo anti-camundongo CD25 PE no buffer FACS na proporção de 1:100. Use o mesmo anticorpo anti-camundongo CD25 PE aqui para confirmar que as células CD4⁺CD25⁺ estão adequadamente marcadas e que não há células T CD4⁺CD25⁺ na fração não-CD4⁺ . Para uma identificação mais rigorosa das células Treg, também pode ser realizada coloração intracelular com um anticorpo anti-camundongo Foxp3 PB.
14. Após a incubação de 20 minutos a 4 °C no escuro, adicione 2 mL de tampão FACS para lavar as células. Centrifuge as células, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 μL de buffer FACS.
15. Detecte a pureza das amostras por citometria de fluxo.
    NOTA: A frequência das células CD4⁺CD25⁺ deve ser ≥ 95% para garantir que a pureza da população celular enriquecida com Treg atenda aos requisitos experimentais (Figura 2). As células não CD4⁺ usadas como fração enriquecida com APC devem conter no máximo 5% de células T CD4⁺ (Figura 2).

6. Marcagem de células T CD4⁺ naïves com corante de proliferação celular

NOTA: Todas as condições de centrifugação são 4 °C, 350 × g por 7 minutos. O buffer PBS é pré-equilibrado à temperatura ambiente antes do uso. O processo de rotulagem é realizado sob proteção leve para evitar a têmpera com corante.

1. Pegue a suspensão ingênua CD4⁺ de células T, centrifuge, descarte o sobrenadante e obtenha a bola da célula.
2. Dilua o corante de proliferação celular eFluor 450 em PBS para obter uma concentração de 20 μM em temperatura ambiente.
3. Adicione 0,5 mL de PBS por 1 × 10⁷ células. Mantenha o tubo inclinado aproximadamente 45° e ressuspenda suavemente as células pipetando para cima e para baixo 50 vezes.
4. Adicione rapidamente um volume igual de solução de corante de proliferação celular na suspensão celular, de modo que a concentração final do corante de proliferação seja 10 μM. Mantenha o tubo inclinado aproximadamente 45° e misture as células pipetando para cima e para baixo 50x para garantir contato total entre elas e o corante de proliferação celular.
5. Imediatamente envolva o tubo da centrífuga com papel alumínio para evitar exposição à luz. Incube em temperatura ambiente por 20 minutos. Faça um vórtice suave nas células a cada 5 minutos para evitar a agregação celular.
6. Adicione 10 mL de meio de cultura celular pré-resfriado ao tubo da centrífuga, faça um vórtice suave para terminar a coloração, depois centrifuge e descarte o sobrenadante.
7. Adicione 5 mL de meio de cultura celular pré-resfriado ao pellet celular, centrifuge e descarte o sobrenadante para lavar as células.
8. Adicione 5 mL de meio de cultura celular pré-resfriado ao pellet celular novamente e ressuspenda as células.
9. Conte as células, centrifuge e descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em um volume apropriado de meio de cultivo para alcançar uma concentração celular de 2 × 10⁶ células/mL, e mantenha o tubo no gelo.

7. Estabelecimento da análise funcional in vitro das células Treg

1. Calcule o número de amostras necessárias para a cultura celular, prepare uma quantidade adequada de meio de cultura celular contendo 2,5 μg/mL anticorpo anti-camundongo CD3 ou as citocinas de indução indicadas, e vórtice suavemente as células T ingênuas CD45,2⁺CD4⁺CD62L⁺ preparadas, células enriquecidas com Treg CD45,1⁺CD4⁺CD25⁺ e células não CD4⁺ enriquecidas com APC.
   NOTA: Use células T CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naïve como células T respondentes (Tresp). Este experimento de exemplo estuda o efeito das células Treg na diferenciação e proliferação das células Th1 e Th17. Portanto, há um total de quatro amostras para a cultura celular: células Tresp cultivadas sob condições de indução Th1 ou Th17, na ausência ou presença de células enriquecidas com Treg.
2. Adicione 100 μL de células T ingênuas CD45,2⁺CD4⁺ (2 × 10 células^{de 5} por poço) à placa de 48 poços.
3. Adicione 100 μL ^{de células não} CD4+ enriquecidas com APC CD45.1⁺ (1 × 10^{células 6} por poço) à placa de 48 poços.
4. Adicione 100 μL de células enriquecidas com Treg CD45,1⁺CD4⁺CD25⁺ (2 × 10^{células de 5} por poço) aos poços experimentais e adicione 100 μL de meio de cultura celular aos poços de controle. A razão célula enriquecida com Treg:Tresp nas amostras experimentais é de 1:1.
   NOTA: A razão entre células Treg e células Tresp pode ser definida conforme necessário, ou um painel com múltiplas proporções pode ser projetado. O número de células Tresp é fixo na cocultura, enquanto o número de células Treg pode ser alterado conforme necessário. Tipicamente, as razões de Treg para Tresp nas amostras experimentais incluem 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 e 0:1. Além disso, cada condição experimental pode ser preparada em triplicado para minimizar erros experimentais aleatórios. Aqui, para maior clareza, com base em experiências anteriores de^{pesquisa 15,16}, é usado um índice 1:1 como exemplo.
5. Adicione 100 μL de meio de cultivo celular contendo 2,5 μg/mL anticorpo anti-camundongo CD3 em cada poço.
   NOTA: A concentração final do anticorpo anti-camundongo CD3 é de 0,5 μg/mL. Além das amostras experimentais, coloque uma amostra controle em branco sem anticorpo anti-camundongo CD3. Nesta amostra, adicione 100 μL de meio de cultura de células T sem anticorpo anti-camundongo CD3 para determinar a intensidade de fluorescência das células T não proliferadas, ou a intensidade do pico 0. Isso permite uma calibração precisa da distribuição de proliferação.
6. Adicione 100 μL de meio de cultura celular contendo as citocinas indicadas a cada poço para fazer o volume final de cada poço em 500 μL.
   NOTA: Neste experimento, a IL-12 recombinante de camundongo p70 em uma concentração final de 10 ng/mL é usada para induzir células Th1, e o TGF-β1 humano recombinante em concentração final de 2 ng/mL e o IL-6 recombinante de camundongo a 50 ng/mL são usados para induzir células Th17.
7. Adicione PBS aos poços vazios restantes (500 μL/poço) para manter a umidade da placa e reduzir os efeitos de borda.
8. Incube a placa de 48 poços em uma incubadora com 5% de_CO2 a 37 °C por 3 dias.
   NOTA: Neste sistema de co-cultura, o anticorpo solúvel anti-camundongo CD3 fornece o sinal primário do receptor das células T (TCR) para ativação das células T, ^{e as células} não-CD4+ enriquecidas com APC fornecem sinais coestimulatórios para ativar totalmente as células T. TCR e sinais coestimulatórios também podem ser acionados pelo anticorpo anti-camundongo revestido em placa CD3 e pelo anticorpo anti-camundongo solúvel CD28. Os pesquisadores podem escolher o método de estimulação conforme necessário.

8. Análise funcional in vitro de células Treg

NOTA: Todas as condições de centrifugação são 4 °C, 350 × g por 7 minutos.

1. Pipetee suavemente as células cultivadas para ressuspendê-las e transfira a suspensão para um tubo centrífuga de 1,5 mL. Centrifuge as células e remova o sobrenadante.
2. Adicione 500 μL de meio de cultura celular contendo 5 ng/mL de PMA, 1 μg/mL ionomicina e 1:1.000 diluído GolgiPlug Protein Transport Inhibitor em cada tubo, faça um vórtice suave para ressuspender as células e incube-as em uma incubadora de 5% de_CO-2 a 37 °C por 3 horas.
3. Centrifuge, descarte o supernadante, adicione 50 μL de PBS contendo um teste de corante Zombie Yellow e anticorpo anti-camundongo diluído 1:100 CD16/32 em cada amostra, vórtice e incube em temperatura ambiente no escuro por 15 minutos para marcar células mortas e bloquear os receptores Fc.
4. Centrífuga, descarte o sobrenadante, adicione 50 μL de coquetel de anticorpos de superfície, vórtice e incube a 4 °C no escuro por 20 minutos.
   NOTA: Adicione anticorpos anti-CD4 PerCP-Cy5.5, anticorpo anti-CD45.1 FITC e anti-CD45.2 APC-eFluor 780 ao buffer FACS em proporção 1:200 para preparar o coquetel de anticorpos de superfície.
5. Adicione 1 mL de buffer FACS a cada tubo da centrífuga, centrífuga e descarte o sobrenadante.
6. Adicione 300 μL de Solução de Fixação e Permeabilização a cada tubo da centrífuga, vórtice e incube a 4 °C no escuro por 20 minutos.
7. Adicione 1 mL de 1× Permeabilização/Lavagem (Perm/Wash) Buffer a cada tubo da centrífuga, centrífuga e descarte o sobrenadante; Depois, repita essa etapa de lavagem uma vez para garantir a remoção completa do fixador residual.
8. Adicione 50 μL de coquetel de anticorpos de citocinas, vórtice e incube a 4 °C no escuro por 40 minutos.
   NOTA: Adicione anticorpo anti-IFN-γ PE e anticorpo anti-IL-17A PE-Cy7 ao Tampão Perm/Wash em uma proporção de 1:100 para preparar o coquetel de anticorpos citocinas.
9. Lave cada amostra com 1 mL de tampão Perm/Wash, centrifuge as células e remova o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 300 μL de buffer FACS.
10. Meça a proliferação e diferenciação das células Tresp por citometria de fluxo. Use a seguinte estratégia de controle (Figura 3): primeiro, bloquear a população de linfócitos entre as células totais e excluir detritos e impurezas celulares; segundo, bloquear a população unicelular entre os linfócitos com base em sinais de dispersão; terceiro, limitar a população de células vivas entre as células individuais; quarto, limitar a população de células T CD4⁺ entre as células vivas; quinto, limitar a população celular enriquecida com Treg CD45.1⁺ e a população de células Teff CD45.2⁺ entre as células T CD4⁺ ; sexto, células CD45.2⁺CD4⁺IFN-γ⁺ Th1, células CD45.2⁺CD4⁺IL-17A⁺ Th17 e células T CD45.2⁺CD4⁺ não proliferadas entre as células T CD45.2⁺ .
11. Realize a aquisição de dados da citometria de fluxo e analise os dados da citometria de fluxo.
    1. Use células T cultivadas marcadas com o corante de proliferação celular eFluor 450 como o controle de corante de proliferação celular com corante único. Prepare o corante Zumbi Amarelo com controle de coloração única com células T cultivadas que não foram marcadas com corante de proliferação celular. Prepare os outros controles de uma única coloração com esferas de compensação para cada fluoróforo utilizado.
    2. Use células T marcadas com o corante de proliferação celular eFluor 450 e cultivadas sem anticorpo anti-camundongo CD3 para definir a porta das células não proliferadas.
    3. Use células T cultivadas marcadas com corante de proliferação celular e coradas com corante Zombie Yellow, anticorpos de superfície celular e controles isotípicos do anticorpo PE anti-IFN-γ de camundongo e anticorpo IL-17A PE-Cy7 para definir portões das células T IFN-γ⁺CD4⁺ e IL-17A⁺CD4⁺ .

Resultados

No experimento representativo, células T ingênuas foram usadas como células Tresp para investigar os efeitos das células enriquecidas com Treg na proliferação e diferenciação das células Th1 e Th17. Neste experimento, células Tresp foram ativadas ^{por células} CD3 anti-camundongo e células não CD4+ enriquecidas com APC, e depois diferenciadas em células Th1 sob indução de IL-12 p70 ou em células Th17 sob indução de TGF-β1 e IL-6. Sob essas duas condições de indução, mudanças na proliferação e diferenciação das c...

Discussão

Neste estudo, os resultados da cocultura sob condições de indução Th1 são consistentes com relatos anteriores de que células Treg podem suprimir a proliferação e diferenciação das células^{Th1 17,18}. Células enriquecidas com Treg também inibiram a proliferação das células Tresp sob condições de indução Th17. No entanto, sob as condições polarizadoras Th17 usadas aqui, a frequência das células IL-17A⁺ Tresp aumentou na pr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.5 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3457IW	ou equivalente
12.5 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420043	ou equivalente
1250 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420813	ou equivalente
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	ou equivalente
200 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420318	ou equivalente
48-well plates	Corning Incorporated	3548	ou equivalente
5 mL syringe piston	Shifeng Medical	SB2-061(A)	ou equivalente
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652	ou equivalente
50 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420258	ou equivalente
70 μm cell strainer	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	ou equivalente
Anti-mouse CD28 antibody	BioXcell	BE0015-1	ou equivalente
Anti-mouse CD3 antibody	BioXcell	BE0001-1	ou equivalente
Anti-mouse CD4 PerCP-Cy5.5 (RM4-5)	Thermo Fisher Scientific	45-0042-82	ou equivalente
Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	ou equivalente
Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	ou equivalente
Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	ou equivalente
Beckman CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter	N/A	para aquisição de dados citometria de fluxo de amostras de células imunológicas
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	ou equivalente
C57BL/6 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	para isolamento de linfócitos primários e subconjuntos de células T
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	ou equivalente
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-041	para classificação celular
CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-106-643	para classificação celular
CD45.1 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	para isolamento de linfócitos primários e subconjuntos de células T
CD45.1 Monoclonal Antibody (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	ou equivalente
CD45.2 Monoclonal Antibody (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	ou equivalente
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	ou equivalente
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	ou equivalente
eBioscience Cell Proliferation Dye eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	ou equivalente
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Solarbio Life Sciences	E1170	ou equivalente
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	A5669701	ou equivalente
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	software para análise de dados de citometria de fluxo
Golgi-Plug Protein Transport Inhibitor	BD Biosciences	555029	ou equivalente
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	ou equivalente
Human TGF-beta1	PEPROTECH	100-21C	ou equivalente
Ionomycin calcium salt	Millipore Sigma	I3909	ou equivalente
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901	para classificação celular
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	ou equivalente
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	para classificação celular
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	para classificação celular
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	para classificação celular
OctoMACS Separators	Miltenyi Biotec	130-042-109	para classificação celular
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	ou equivalente
PE Rat IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400408	ou equivalente
PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control Antibody	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	ou equivalente
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	ou equivalente
PMA	Millipore Sigma	P8139	ou equivalente
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101302	ou equivalente
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	para classificação celular
Recombinant mouse IL-12 p70	PEPROTECH	210-12	ou equivalente
Recombinant Mouse IL-6	R&D Systems	406-ML	ou equivalente
Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK Lysing Buffer)	Thermo Fisher Scientific	A1049201	ou equivalente
RPMI 1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093	ou equivalente
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070	ou equivalente
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	ou equivalente
UltraComp eBeads Compensation Beads	Thermo Fisher Scientific	01-2222-42	ou equivalente
Zombie Yellow Fixable Viability Kit	BioLegend	423104	ou equivalente
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	ou equivalente