Esse protocolo apresenta um fluxo padrão de triagem de alta produtividade para microrganismos industriais. Envolve construir uma biblioteca mutante via mutagênese ARTP, realizar triagem positiva de gotículas com microfluídica automatizada e, posteriormente, verificar os resultados. A confiabilidade do fluxo de trabalho foi validada por meio de triagem de cepas de B. coagulans de alto rendimento.
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Artigo de método
Triagem de alto rendimento de mutantes Bacillus coagulans , hiperprodutora de ácido l-lático, utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A biomanufatura industrial depende de microrganismos para sintetizar eficientemente produtos-alvo sob condições de engenharia. No entanto, cepas do tipo selvagem frequentemente não têm capacidade para isso devido às suas redes metabólicas nativas. Portanto, a triagem rápida e precisa de cepas de alto desempenho em bibliotecas mutantes em grande escala é um passo crítico no melhoramento microbiano industrial. Nos últimos anos, a tecnologia microfluídica de gotículas atraiu atenção significativa por sua alta produtividade, baixo consumo e capacidade de compartimentalização de célula única, levando ao desenvolvimento de inúmeros sistemas de separação de célula única. Um protocolo de triagem de alto rendimento para cepas microbianas industriais utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas é apresentado neste estudo. O fluxo de trabalho integrado compreende quatro estágios-chave: construção de uma biblioteca mutante por meio de mutagênese de plasma atmosférico e à temperatura ambiente (ARTP); encapsulamento de célula única de alta eficiência e microcultivo controlado dentro de gotículas em escala de picolitro; pico-injeção precisa de um biossensor fluorescente, seguida por filtragem de gotículas ativada por fluorescência (FADS) para isolar gotículas contendo variantes de alta produção; e validação das cepas candidatas selecionadas por meio de fermentação em microplacas e balões agitados. Um fluxo de trabalho completo e integrado de triagem é concebido como um modelo padronizado, e sua validação é demonstrada pelo isolamento de mutantes produtores de ácido L-lático de alto rendimento de B. coagulans como exemplo específico. Esta plataforma automatizada e de alta capacidade oferece uma solução técnica poderosa com potencial significativo para acelerar o melhoramento industrial de cepas de alto desempenho.
Introdução
A biotecnologia industrial utiliza microrganismos e enzimas como biocatalisadores para produzir produtos valiosos em larga escala. Essa abordagem é considerada mais ambientalmente correta e eficiente do que a fabricação tradicional de produtos químicos. No entanto, as redes metabólicas naturais dos microrganismos evoluíram para priorizar sua própria sobrevivência e reprodução, em vez da síntese eficiente dos produtos desejados pelos humanos. Como resultado, o melhoramento microbiano de alto rendimento é frequentemente necessário para atender às demandas dos ambientes industriais de produção com condições
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Protocolo
Não foi necessária aprovação ética para este estudo. Todos os experimentos foram realizados usando culturas microbianas puras, e nenhum indivíduo humano ou animal de laboratório participou dessa pesquisa. Consulte a Tabela de Materiais para detalhes sobre todos os materiais usados no protocolo a seguir.
1. Preparativos
ATENÇÃO: Siga as práticas de biossegurança. B. coagulans é um organismo de Nível 1 de Biossegurança. Use luvas e jaleco. Realize todas as manipulações abertas dentro de uma capela de fluxo laminar. Autoclave todos os materi....
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Resultados
Com base na plataforma microfluídica automatizada de gotículas, foi estabelecido um modelo de triagem de alto rendimento. Uma biblioteca mutante de B. coagulans foi construída por mutagênese por ARTP com tempo ótimo de irradiação de 20 s, o que proporcionou uma taxa de letalidade de aproximadamente 90% (Figura 4A). As células mutantes foram então encapsuladas em gotículas de 14 pL, aproximadamente 30 μm de diâmetro, a uma taxa de geração de 1500 Hz .......
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Discussão
Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho padronizado para triagem microbiana industrial baseado em uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas. O fluxo de trabalho integrado abrange a construção de bibliotecas mutantes, geração de gotículas e encapsulamento de célula única, cultivo de microreatores, injeção de biosensores, separação de gotículas ativadas por fluorescência e validação final de cepas-alvo. Utilizando a triagem de alto rendimento de um B. coagulans .......
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Divulgações
Xiaojie Guo e Liyan Wang são funcionários da Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., que fabrica a plataforma microfluídica automatizada de gotículas e chips microfluídicos usados neste estudo. A empresa declara que não possui interesses concorrentes em relação a esse trabalho e não teve papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise, interpretação ou preparação de manuscritos. Os outros autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Advanced Materials-National Science and Technology Major Project (Grant No. 2024ZD0603600). Apoio adicional foi oferecido pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Guangdong (Subsídio nº 2024B1111130002).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214030 | Para preparação de placas sólidas |
| Anhydrous Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | Limpar e desinfetar bancadas e aparelhos de laboratório |
| Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP) | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | CP-002 | ARTP foi empregado para construir a biblioteca de mutantes para a mutagenese de linhagens. |
| B. coagulans | Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC | 1511C0004000002355 | B. coagulans ATCC 7050 foi usado como a linhagem inicial para a mutagenese e o alvo da triagem de gotículas de alta produtividade. |
| Black microplate (96 well) | Corning | 3925 | A microplaca preta de 96 poços foi usada para ensaios de sensor de lactato e determinação da concentração de ácido láctico. |
| Calcium carbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20011062 | Para isolar hiperprodutores de L-ácido lático. |
| Calcium chloride | Sinopharm | 10005819 | O cloreto de cálcio é usado para a preparação do meio de cultura microbiana, fornecendo nutrientes essenciais para o crescimento microbiano. |
| Calcium L-lactate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 69027528 | Usado como amostras para a preparação da curva padrão no processo de detecção. |
| Centrifuge tube (15 mL) | Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd | HB53397 | Usado para diluição de líquido bacteriano |
| Collection tube | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | DREMcell-CL | Para coletar gotículas e cultivo subsequente |
| Computer | Lenovo | E450 | Instalação de software e controle do DREM Cell. |
| DAPI | Solarbio | c0065 | Para coloração celular. |
| Deep-well plate (24-well) | BKMAMLAB | 110424008 | Para a verificação inicial do rendimento de mutantes de B. coagulans usando placas de poço profundo |
| Demulsifier (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol) | MACKLIN | H817022 | O desemulsificador de gotículas é usado para quebrar as microgotículas de água em óleo e liberar as células internas, linhagens ou supernatante para detecção e análise subsequentes. |
| D-Glucose | Solarbio | G8150-1000 | D-Glucose é usado para a preparação do meio de cultura microbiana, fornecendo nutrientes essenciais para o crescimento microbiano. |
| Diammonium hydrogen citrate | Solarbio | D9950 | O citrato de diamônio e hidrogênio é usado para a preparação do meio de cultura microbiana, fornecendo nutrientes essenciais para o crescimento microbiano. |
| Dipotassium hydrogen phosphate anhydrous | Sigma-Aldrich | P8281 | O fosfato de dipotássio e hidrogênio anidro é usado para a preparação do meio de cultura microbiana, fornecendo nutrientes essenciais para o crescimento microbiano. |
| DREM Software version | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | DREMcell v02.01.18 | Para controlar o instrumento DREM cell. O Software DREM é um programa comercial proprietário exclusivamente para o instrumento DREM Cell da Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. Não possui acesso público oficial ou URL de download e é distribuído apenas com o instrumento sob autorização. |
| Droplet Entrapping Microfluidic Cell-sorter (DREM Cell) | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | CP-027 | Foi usado para encapsulação e triagem de células únicas de alta produtividade e para triagem rápida de linhagens de alto rendimento da biblioteca de mutantes. |
| Droplet generation chip | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | HC-03-009 | O chip de geração de gotículas é usado para produzir gotículas monodispersas em escala de picolítero (pL) para encapsulação de células únicas. |
| Droplet injection chip | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | HC-03-003 | O chip de microinjeção de gotículas é usado para alcançar uma injeção precisa e traço de reagentes em gotículas pré-formadas para reações bioquímicas subsequentes. |
| Droplet sorting chip | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | HC-03-002 | O chip de triagem de gotículas é usado para classificar gotículas-alvo contendo células de alto rendimento com base em sinais de fluorescência. |
| Erlenmeyer shake flask (250 mL) | Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd. | B-001006 | Usado para a verificação da cultura em escala de linhagens mutantes de B. coagulans após a triagem primária com placas de poço profundo, para confirmar a estabilidade e a reprodutibilidade das linhagens de alto rendimento. |
| Filter Membranes (0.22 μm) | Merck | SLGPR33RB | Usado para filtração do caldo de fermentação. |
| Fluorescence inverted microscope | Olympus | IX73 | O microscópio de inversão de fluorescência Olympus IX73 foi usado para observar a morfologia bacteriana dentro das gotículas |
| Fluorinated Oil | Bio-Rad | 1864006 | O óleo fluorado serve como a fase contínua na microfluídica de gotículas para gerar microgotículas de água em óleo estáveis, monodispersas e não interferentes, suportando o cultivo e a triagem de células únicas. |
| High Performance Liquid Chromatography column | Bio-Rad | Bio-Rad Aminex HPX-87 | É usado para separar o ácido láctico de outros componentes no caldo de fermentação de acordo com suas diferentes propriedades de retenção, para realizar a detecção quantitativa precisa do ácido láctico. |
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu | 228-34001-02 | HPLC é usado para a detecção e análise quantitativa de ácido L-lático em amostras de fermentação. |
| Injection tube | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | DREMcell-1N | Para injetar a fase oleosa, suspensão bacteriana de amostra e solução de reagente |
| Iron(III) sulfate heptahydrate | Iron(III) sulfate heptahydrate | Iron(III) sulfate heptahydrate | Iron(III) sulfate heptahydrate |
| Laminar flow hood | Shanghai SHP Instrument Equipment Co., Ltd | SP20230501 | Usado para operação asséptica no cultivo e fermentação de B. coagulans. |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm | 10013018 | Extrato de Levedura é usado para a preparação do meio de cultura microbiana, fornecendo nutrientes essenciais para o crescimento microbiano. |
| Manganese sulfate monohydrate | MACKLIN | M813856 | O sulfato de manganês monoidratado é usado para a preparação do meio de cultura microbiana, fornecendo nutrientes essenciais para o crescimento microbiano. |
| Microplate reader | TECAN | TCAT920000 |
Referências
- Zeng W, et al. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends Biotechnol. 2020;38(8):888-906.
- Sarnaik A, et al. High-throughput screening for efficient microbial biotechnology. Curr Opin Biotechnol. 2020;64:141-150.
- Li Z-H, et al. The advances of strategies and technologies in high-throughput microbial culturomics. Biotechnol Adv. 2026;87:108783.
- Zhou S, Alper HS. Strategies for directed and adapted evolution as part of microbial strain engineering. J Chem Technol Biotechnol. 2019;94(2):366-376.
- Xu L, Guo M, Jiang D, Jiang J, Lu L. Advances in high-throughput mutation breeding systems integrating atmospheric and room....
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Reimpressões e permissões
