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Alta Resolução Eletroforese Gel Limpar Native (hrCNE) para Complex mitocondrial em Gel-ensaios de atividade
Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) foram mantidos em uma monocamada de ˠ irradiados ou mitomicina C fibroblastos tratados com embrionárias de camundongos (MEFs), depois passou para o crescimento em Matrigel por 5 dias em MEF-condicionado médio utilizando condições padrão. Para remover contaminantes MEFs, hESCs foram re-semeadas em Matrigel e cultivadas em MEF-condicionado meio de um adicional de 3 dias. Microscopia de imunofluorescência para marcadores de pluripotência Oct-4 e SSEA-4 foi usado para confirmar a falta de diferenciação CTEh.
- Lavar as células com PBS 1x quente, pH 7,4, seguido por tripsinização (1 ml de tripsina 1x por bem em uma placa de 6 poços) por 5 min.
- Adicionar um volume igual de inibidor de tripsina frescos (1mg/ml em 1x PBS, pH 7,4). Células colheita e centrifugar a 200 g, 5 min, temperatura ambiente.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 0,8 peletizada - 1.7ml (baseado no tamanho do pellet celular) de gelo tampão de isolamento a frio mitocôndrias (83mm de sacarose; 6.6mM imidazol / HCl, pH 7,0) preparada na hora com Cocktail Inibidor 1 'Protease. Incubar no gelo por 10 min.
- Dounce células com um homogeneizador (~ 4-50 AVC). Mancha uma alíquota das células dounced com azul de tripano para verificar integridade de homogeneização utilizando um microscópio de luz.
- Centrifugar a 20.000 g por 10 min a 4 ° C para obter um bruto mitocondrial pelota que também contém núcleos e fragmentos de célula maior. Decantar e desprezar o sobrenadante e pesar o precipitado bruto mitocondrial pellet. O pellet podem ser armazenadas a -80 ° C após congelamento em nitrogênio líquido instante se este é um ponto de parada.
NOTA: centrifugação diferencial ou outros baseados em gradiente de procedimentos podem ser usados para isolar e coletar uma fração de membrana pura mitocondrial. Ver ref. 4 para mais detalhes. Esta abordagem alternativa trará a atividade mitocondrial complexo por mg de proteína mitocondrial em vez de atividade complexa por mg de peso celular ou número de celular. A concentração de proteínas mitocondriais terá de ser determinada após a purificação para fazer esta comparação. Além disso, um buffer de isolamento diferentes podem ser necessários para esta abordagem. Para solubilização da fração de membrana pura mitocondrial, consulte a seguinte nota a etapa 6 abaixo.
- Solubilizar o crude mitocondrial pellet no gelo por vórtex com gelo tampão de solubilização a frio (50 mM NaCl, 50 mM imidazol / HCl pH 7.0, 1mM EDTA, 2mM 6-aminohexanoic ácido). Ácido 6-aminohexanoic pode ser substituído com o Cocktail 1x Inibidor da Protease. Use 35μl de tampão de solubilização por 20mg de peso pelota. Adicionar 20μl de 10% w / v digitonina por 20mg de pellet de peso e misture sacudindo o tubo. Incubar por 50-10 min no gelo. Dodecil-bD-maltosídeo ou triton X-100 pode ser substituído por digitonina para solubilizar as proteínas. A escolha do detergente e sua quantidade pode afetar a formação de supercomplexes ou formas multimérica dos complexos mitocondriais. Para mais informações, consulte ref.1.
NOTA: A quantidade de detergente necessária para solubilizar uma fração de membrana pura mitocondrial corresponde a uma relação peso / detergente de proteínas variando de 2-6g / g. A proporção ideal para solubilizar as membranas mitocondrial é 2,5 g / g de dodecil-bD-maltosídeo, 3g / g de triton X-100, e 6g / g para digitonina.
- Centrifugar o pellet solubilizados a 100.000 g por 15 min a 4 ° C. Recolher o sobrenadante límpido.
- Adicionar tampão de carregamento para um final de 5% de glicerol w / v e 0,01% w / v Ponceau S (use um 50% de glicerol w / v, 0,1% w / v carregamento Ponceau S solução estoque regulador).
- Carga poços de gel com um volume que contém 20-40mg do crude mitocondrial pellet por pista. Use um gel de gradiente de acrilamida (4% -13) com 3,5% de empilhamento gel.
NOTA: Gel de preparação e condições de eletroforese:
Para a preparação de gel, use um acrilamida / bis-acrilamida (AA / bisAA) 3 mix da seguinte forma: 48g de acrilamida e 1,5 g de bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Onde T é a concentração total de AA e bisAA e C é o percentual de reticulador (bisAA) para monômero total).
Gel buffer (3 '): 1,5 M de ácido 6-aminohexanoic; imidazol 75mm, pH 7,0
| Gel gradiente: | 4% | 13% | Empilhamento gel: | 3,5% |
| AA / bisAA misture 3 | 2 ml | 6,5 ml | | 0,6 ml |
| Gel tampão 3 ' | 8,3 ml | 8,3 ml | | 2,7 ml |
| Glicerina | | 5 g | | |
| H 2 O | 14,7 ml | 5 ml | | 4,7 ml |
| Volume total | 25 ml | 25 ml | | 8 ml |
| APS 10% | 139 mL | 125 mL | | 67 mL |
| Temed | 14 mL | 12,5 mL | | 6,7 mL |
Buffer de ânodo: 25mM imidazol / HCl, pH 7,0
Tampão cátodo: tricine 50mm, 7.5mm imidazol / HCl, 0,02% w / v dodecil-bD-maltosídeo, 0,05% w / v desoxicolato, pH 7,0
Despeje e executar géis em uma sala fria (4-7 ° C). A tensão inicial usado é 100V. Quando a amostra entrou no gel de empilhamento, a tensão é elevada a 500V com a corrente limitada a 15mA (para 0,15 '14' 14 cm de gel). Eletroforese é interrompido após 3-4 h, quando a linha nítida de corante vermelho Ponceau S a abordagens frente gel. Alternativamente, um gel pode ser executado durante a noite com tensão constante de 70-100V.
- Em gel de ensaios de atividade. O tempo de incubação para cada ensaio depende da eficiência de solubilização de proteína e da quantidade de material carregado por bem. Complexos I, IV e V costumam gerar sinais mais fortes do que os complexos II e III.
Complexo I (CI)
Incubar a fatia de gel com CI buffer (5mM Tris-HCl, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) em temperatura ambiente por várias horas.
CI buffer: Adicionar por 100ml de 5mM Tris-HCl, pH 7.4:
0.01g NADH
0.25g NBT
Corrigir o gel em metanol 50% e 10% de ácido acético por 15-45 min. O gel é preservada fixo em 10% de ácido acético.
Complexo II (CII)
Incubar a fatia de gel com CII buffer (20mM de sódio succinato; methasulfate fenazina 0,2 mM; 2.5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) em temperatura ambiente por várias horas.
CII buffer: Adicionar por 100ml de 5mM Tris-HCl, pH 7.4:
Succinato de sódio 1M 200μl
Pipete 80 methasulfate fenazina (PMS 250mm dissolvido em DMSO)
0.25g NBT
Corrigir o gel como descrito para Complexo I
Complexo III (CIII)
Incubar a fatia de gel com CIII tampão (fosfato de sódio 50mM, pH 7,2; 0,05% 3,3 tetrahidrocloreto 'diaminobenzidina (DAB)) em temperatura ambiente por várias horas.
CIII buffer: Adicionar por 100 ml de fosfato de sódio pH, 50mM 7.2:
50mg tetrahidrocloreto diaminobenzidina
Corrigir o gel como descrito para Complexo I
Complexo IV (CIV)
Incubar a fatia de gel com CIV tampão (fosfato de sódio 50mM, pH 7,2; 0,05% 3,3 tetrahidrocloreto 'diaminobenzidina (DAB), o cavalo de 50 ìm coração citocromo c) em temperatura ambiente por várias horas.
CIV buffer: Adicionar por 100 ml de fosfato de sódio pH, 50mM 7.2:
50mg tetrahidrocloreto diaminobenzidina
Cavalo 0.1g coração citocromo c
Corrigir o gel como descrito para Complexo I
Complexo V (CV)
Incubar a fatia de gel com CV tampão (Tris-base de 35mm, 270mm glicina, pH 8,3 a 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0,2% w / v Pb (NO 3) 2, 8MM ATP) em temperatura ambiente por várias horas.
CV buffer: 100 ml de solução por acrescentar:
| Tris-base | 0.424g |
| Glicina | 2.026g |
| MgSO 4 | 0.345g |
| Pb (NO 3) 2 | 0.29g |
Não há necessidade de ajustar o pH (deve ser 8.3) - não use ácido ou base. Filtro e adicionar
Corrigir o gel em metanol 50% por 30 min e transferência para a água.