Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

Resumo

Neste vídeo, vamos mostrar-lhe como os complexos da cadeia respiratória mitocondrial de células estaminais embrionárias humanas podem ser analisadas por ensaios de atividade em gel.

Resumo

As mitocôndrias são organelas citoplasmáticas que têm um papel fundamental no metabolismo celular ea homeostase, a regulação da rede de sinalização celular e morte celular programada. Mitocôndrias produzem ATP, regular o estado redox citoplasmático e Ca2 + equilíbrio, catabolizar ácidos gordos, sintetizar heme, nucleotídeos, hormônios esteróides, aminoácidos, e ajudar a montar ferro-enxofre em proteínas. Mitocôndria também têm um papel essencial na produção de calor. Mutações do genoma mitocondrial causar vários tipos de desordem humana. O acúmulo de mutações do mtDNA correlaciona-se com o envelhecimento e é suspeito de ter um papel importante no desenvolvimento do câncer. Devido ao seu papel de vital importância em todos os tipos de células, a função das mitocôndrias também deve ser crítico para as células-tronco. Avanços importantes foram feitos em nossa compreensão da viabilidade de células-tronco, proliferação e capacidade de diferenciação. Mas a atividade funcional das células-tronco, no estado de energia particular, a sua, não foi ainda estudado em detalhe. Quase nada se sabe sobre as propriedades mitocondrial de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e seus descendentes precursor diferenciadas. Uma maneira de compreender e avaliar o papel da mitocôndria na função CTEh e potencial de desenvolvimento é o de medir diretamente a atividade dos complexos respiratórios mitocondriais. Aqui, descrevemos de alta resolução de eletroforese em gel claro nativa e posterior visualização em gel atividade como um método para analisar os cinco complexos da cadeia respiratória de hESCs.

Protocolo

Alta Resolução Eletroforese Gel Limpar Native (hrCNE) para Complex mitocondrial em Gel-ensaios de atividade

Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) foram mantidos em uma monocamada de ˠ irradiados ou mitomicina C fibroblastos tratados com embrionárias de camundongos (MEFs), depois passou para o crescimento em Matrigel por 5 dias em MEF-condicionado médio utilizando condições padrão. Para remover contaminantes MEFs, hESCs foram re-semeadas em Matrigel e cultivadas em MEF-condicionado meio de um adicional de 3 dias. Microscopia de imunofluorescência para marcadores de pluripotência Oct-4 e SSEA-4 foi usado para confirmar a falta de di....

Discussão

Neste vídeo, temos descrito a extração de complexos de proteína mitocondrial de células estaminais embrionárias humanas, a sua separação por eletroforese em gel de alta resolução clara nativa (hrCNE), e posterior análise por gel em ensaios de atividade catalítica. hrCNE resolve complexos de proteína mitocondrial de membrana com uma resolução comparável à de eletroforese em gel azul nativa e é superior para os ensaios em gel atividade. Esta técnica pode ser empregada não apenas para quantificar respiratória mitocondrial complexos IV, mas tam.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
EDTA 0,5 M	Fisher Scientific	BP120-1	ajustar o pH para 8,0 com NaOH
NaCl 1 M	Sigma-Aldrich	S3014-500MG
Succinato de sódio 1 M	Fisher Scientific	S413-500
Tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,2	Fisher Scientific	BP332-1 e BP329-1	Misture 68,4 ml de Na2HPO4 1 M e 31,6 ml de NaH2PO4 1 M para preparar tampão de fosfato de sódio 0,1 M com pH 7,2 a 25 °C
Tricina 1 M, pH 7,0 (ajustado com NaOH)	EMD Millipore	9010	armazenar a 4 °C
Imidazol/HCl 1 M, pH 7,0	Sigma-Aldrich	I-2399	armazenar a 4 °C
Tris-HCl 1 M, pH 7,4	Fisher Scientific	BP153-1
Dodecil-β-D-maltosídeo (DDM) 20% (p/v)	Fluka	44205-500MG	Dissolvido em água. Armazene alíquotas de 1 ml a –20 °C.
Digitonina 10% (p/v) (>50% de pureza, usada sem recristalização)	Fluka	37008-1G	Dissolvida em água. Armazene alíquotas de 0,1–1 ml a –20 °C. Deve ser aquecida até 95 °C antes do uso.
Ácido 6-aminohexanóico 2 M	Fluka	07260-100G	armazenar a 4 °C
Solução estoque de Ponceau S/glicerol 10x	Sigma-Aldrich	P-3504 e G6279-1L	Ponceau S 0,1%, glicerol 50% (p/v) em água.
Desoxicolato de sódio 10% p/v	Fluka	30970-25G	Dissolvido em água. Deve ser protegido da luz. Ajuste o pH para 7,0 com HCl, filtre e armazene à temperatura ambiente.
Fenazina metassulfato (PMS) 250 mM	TCI America	P0083	Dissolvido em DMSO e alquotado. Armazene a –20 °C.
Tetrazólio azul nítrico (NBT)	Amresco	0329-1G
3,3’-diaminobenzidina tetra-hidrocloridrato (DAB)	TCI America	D0078
Pb(NO3)2	Fisher Scientific	L62-100
MgSO4	Fisher Scientific	BP213-1
Base de Tris	Fisher Scientific	BP152-10
Glicina	Fisher Scientific	G45-212
Adenosina 5’-trifosfato dissódico (ATP)	Sigma-Aldrich	A2383-5G	Classe I, mínimo 99%
β-nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) forma reduzida	Sigma-Aldrich	N-8129
Citocromo c do coração de cavalo	Sigma-Aldrich	C2506-250MG
Sacarose	Fisher Scientific	BP220-212
Coquetel de inibidores de protease 100x	Sigma-Aldrich	P8340	Armazenar a –20 °C.
Dissulfóxido de dimetila (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Corante azul de tripano 0,4%	GIBCO, by Life Technologies	15250-061
Tripsina 10x (0,5%)	GIBCO, by Life Technologies	15400-054
Inibidor de tripsina	GIBCO, by Life Technologies	17075-029