Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

Resumo

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Resumo

Pluripotência pode ser induzida em murinos diferenciados por transdução viral de Oct4, Sox2, KLF4, e c-Myc (Takahashi e Yamanaka, 2006; Wernig, et al, 2007;. Okita, et al, 2007;.. Maherali, et al, 2007). Nós planejamos uma estratégia de reprogramação em que estes quatro fatores de transcrição são expressos de doxiciclina (Dox)-induzível lentivirais (Brambrink et al., 2008). Usando essas construções induzível, podemos derivar-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células de fibroblastos de rato embrionárias (MEFs). Neste vídeo, demonstramos o procedimento para a geração de lentivírus induzível que expressam os quatro fatores de transcrição e mostrar como a infectar MEFs com estes vírus, a fim de produzir células iPS. Usando lentivírus induzível, a expressão dos quatro fatores na controlada pela adição de doxicilina ao meio de cultura. A vantagem deste sistema sobre a infecção retroviral tradicionais é a capacidade de transformar os genes dentro e fora de forma que a cinética de reprogramação e os requisitos de expressão gênica podem ser analisados ​​em detalhe.

Protocolo

Passo 1:

Descongelar 293 células e placa para a produção de lentivírus.

1. Prepare 9 ml de DMEM + em um tubo de 15 ml.
2. Remover um frasco de congelados 293 ações do tanque de nitrogênio líquido e colocar o frasco em banho-maria a 37 ° C até que a maioria das células (mas não todos) são descongeladas.
3. Remove as células de congelamento frasco e colocar no tubo de 15ml a partir do passo 1.
4. Centrifugar a 180g por 5 min, em seguida, descartar o sobrenadante.
5. Ressuspender as células com 10 ml de DMEM +, e transferir para um prato de gelatina revestidos de 100 mm. Incubar as células a 37 ° C, 5% incubadora de CO ₂ até que sejam confluentes 80-90%.
6. Passagem dos 293 células: células de lavagem com PBS, aspirar o PBS, e adicionar 4 ml por 10 cm de prato de 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, e incubar por 1 min a 37 ° C.
7. Separar células de pratos tocando, ressuspender com 10 ml DMEM + médio, e transferir para um tubo de 15 ml. Centrifugar a 180g por 5 min, e aspirar o sobrenadante.
8. Adicionar volume apropriado de DMEM + meio, e acabar com as células em uma suspensão única célula por pipetagem cima e para baixo várias vezes.
9. Contar o número de células e ajustar a concentração para 8x10 ⁵ células por ml com meio de FP.
10. Células de semente de 8x10 ⁶ células (10 ml) por 100 mm de prato, cultura e incubar durante a 37 ° C, 5% de CO _2.

Passo 2:

Transfectar 293 células com plasmídeos lentivírus eo vírus da colheita

1. Para cada placa de 10 cm, usar 10 mg de FUW-Teto-cDNA (Oct4, Sox2, KLF4 ou c-Myc) backbone lentivírus com 2.5ug de PMD-G e 7,5 mcg de pPax2.
2. Enquanto as três alíquotas plasmídeos em um tubo, entregar 30μl de Fugene reagente transfecção 6 em um segundo tubo contendo 500μl de DMEM sem soro e misture delicadamente com o dedo tocando e incubar por 5 min à temperatura ambiente.
3. Adicione a mistura de DNA gota a gota dentro do tubo Fugene 6/DMEM-containing, misture delicadamente tocando dedo e incubar por 20 min.
4. Adicione o DNA / Fugene 6 gotas complexo no prato de 293, e incubar durante a 37 ° C, 5% CO _2.
5. Na manhã seguinte: Aspirar a transfecção reagentes contendo meio, adicionar 5 ml de meio fresco ES célula, e as células voltem para a incubadora.
6. Às 48 horas e 72 horas após a transfecção, recolher o meio do 293, usando um de 10 ml em seringa descartável estéril, filtrando-a através de um poro filtro de tamanho 0,45 mícrons acetato de celulose, e transferir para um tubo de 15 ml.
7. Concentrar o sobrenadante vírus por ultracentrifugação. Ressuspender o sedimento vírus no volume desejado e fazer amixture de partes iguais do meio contendo Oct-3/4-, Sox2, KLF4 e c-Myc-lentivírus.
8. Ao fazer o vírus, prepare Oct4-neo/rtTA ou Oct4-GFP/rtTA MEFs (passagem <3) a 90% na confluência de 10 cm pratos (2x10 ⁶ células por prato)
9. Aspirar o meio de cultura e lavar com 10 ml de PBS.
10. Descartar PBS, adicionar 1 ml para cada prato de 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, e incubar a 37 ° C por 10 min.
11. Adicionar 9 ml do meio de cultura, suspender as células de uma única célula, e transferir para um tubo de 15 ml.
12. Contar o número de células, e ajustar a concentração para 8x10 ⁴ células por ml. Transferência de 10 ml de suspensão de células (8x10 ⁵ células) para um prato de 10 cm revestidas com gelatina. Incubar o prato durante a noite a 37 ° C CO, 5% _2.
13. Aspirar o meio de um prato de fibroblastos, e adicione 10 ml do meio-vírus contém. Incubar as células a partir de 4 h durante a noite a 37 ° C, 5% CO _2.
14. Após 24 aspirar o médio de um prato de fibroblastos, e adicione 10 ml de meio fresco ES celular.
15. Substituir médio de células ES regulares com meio contendo doxiciclina para iniciar a expressão dos quatro genes, ou seja, iniciar a reprogramação.
16. Se estiver usando um repórter Oct4-neo, em seguida, iniciar a seção de drogas a qualquer momento entre 6 e 9 dias.
17. Mudar o meio todos os dias até as colônias tornam-se grandes o suficiente para ser pego. Colônias deve primeiro tornar-se visíveis cerca de uma semana após o início da reprogramação. Eles devem tornar-se grande o suficiente para ser pego por volta do dia 20.

Passo 3:

Pegando as colônias iPS

Dia antes de escolher:

1. Semente do número necessário de gelatina revestido placas de 24 poços com γ-irradiados DR4 MEFs

Escolher Clones no dia 1:

1. Alimentam as colônias nas placas de 1-2 horas antes de escolher.
2. Adicionar 15 mL de PBS aos poços de uma antena V de fundo de 96 poços.
3. Lavar a cápsula contendo as colônias para ser escolhido uma vez com PBS e adicione 10 ml de PBS para o prato.
4. Escolha as colônias com as pequenas pontas de pipeta 5μl (definir o Pipetman P20 em 4 mL). Transferência de colonies a um poço no prato de 96 poços.
5. Adicionar 20 mL de tripsina a cada poço usando o multi-canal (12) pipetor. Pipeta cima e para baixo 3 vezes. Incubar a 37 ° C por 4 minutos.
6. Adicionar 100 l de meio de ES para as colônias tripsinizados. Pipeta cima e para baixo 10 vezes. Transferência de seis clones de uma vez do prato de 96 poços para um prato de 24 poços, utilizando uma ponta em todas as outras posições no pipetor lugar 12.
7. Cultivar as células na placa de 24 poços a 37 ° C, 5% incubadora de CO ₂ até alcançar as células confluência de 80-90%, a alimentação diária com ES meio celular. Células provavelmente irá estar pronto para expandir-se em 3-7 dias.

Passo 4

1. Expansão de células iPS
   1. Aspirar o meio, e lavar as células com 1 ml de PBS.
   2. Remover completamente PBS, adicionar 0,1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA 1 mM e incubar a 37 ° C por 10 min.
   3. Adicionar 0,4 ml do meio de ES e suspender as células mediante pipetando para cima e para baixo para suspensão única célula.
   4. Transferir a suspensão de célula para um poço de placa 6-bem, adicionar 1,5 ml de meio de células ES, e incubar a 37 ° C, 5% incubadora de CO ₂ até atingir 80-90% de células confluência em 6-lamelas. Neste ponto, preparar estoque congelado das células, como se segue.
2. Preparação de ações congelar
   1. Aspirar o meio, e lavar as células com 2 ml de PBS.
   2. Remover completamente PBS, adicionar 0,5 ml de 0,25% de tripsina / EDTA 1 mM e incubar a 37 ° C por 10 min.
   3. Adicionar 2 ml do meio de ES e suspender as células mediante pipetando para cima e para baixo para suspensão única célula.
   4. Transferir a suspensão celular a um tubo de 15 ml, contar o número de células e spin down das células.
   5. Desprezar o sobrenadante, ressuspender as células com meio ES para a concentração em 2x10 ⁶ células por ml.
   6. Prepare 2 ES meio de congelamento de células (DMSO 20% em média ES) e alíquota é de 0,5 ml por frasco.
   7. Transferência de 0,5 ml da suspensão de células para congelar os frascos e misture delicadamente.
   8. Colocar os frascos em um recipiente de células de congelamento e mantê-lo a -80 ° C durante a noite; transferência para nitrogênio líquido no dia seguinte para armazenamento de longo prazo.

Discussão

Neste vídeo, que demonstram como usar um sistema induzível, lentiviral para gerar GFP-positivas, células pluripotentes a partir de iPS MEFs derivadas de camundongos Oct4-GFP/R26-M2rtTA e Nanog-GFP/R26-M2rtTA. Este procedimento é um método útil para gerar células iPS, pois permite o controle de expressão do transgene durante o processo de reprogramação. Embora o uso de vírus na geração de células iPS impede o uso dessas células em um ambiente clínico, este procedimento nos permite responder a algumas das grandes questões biológicas que sublinhar o processo ainda definido reprogramação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente de hilato de doxiciclina		Sigma-Aldrich	D9891-100G