O protocolo de texto completo para essa abordagem experimental está disponível em <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">protocolos atuais em biologia celular</a> .

Os autores não têm nada a declarar.

contagem e determinação da viabilidade das células em cultura

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determinar o número de células em cultura é importante na normalização das condições de cultivo e na realização de experimentos de quantificação precisa. A hemocitômetro é uma lâmina de vidro grosso com uma zona central concebida como uma câmara de contagem. Suspensão de células é aplicado a uma área definida e contou para densidade das células pode ser calculada.

Determinar o número de células em cultura é importante na normalização das condições de cultivo e na realização de experimentos de quantificação precisa. Neste vídeo, demonstramos como as células são contadas usando um hemocitômetro.

Contagem e determinação da viabilidade das células em cultura

Determinar o número de células em cultura é importante para a padronização das condições de cultura e para a realização de experimentos de quantificação precisos. Um...

A determinação do número de células e do cultivo é importante para a padronização das condições de cultivo e ao realizar experimentos nos quais são necessários números precisos de células. Aqui, mostraremos como contar células utilizando um hemocitômetro e calcular a concentração de células presentes em suspensão. Também mostraremos como determinar o número de células viáveis presentes no seu cultivo com o ensaio de viabilidade com Azul de Tripano.Olá, sou o Ricky, do Laboratório do Dr. LAN, nas Instalações de Laboratórios de Patologia Molecular no Leste do Tennessee. Hoje vou mostrar como contar células em suspensão e como determinar sua viabilidade. Para preparar o hemocitômetro para a contagem de células, você deve primeiro limpar sua superfície e a lamínula correspondente com etanol a 70%.A lamínula e a lâmina devem estar limpas, secas e livres de fiapos, impressões digitais e marcas de água. Em seguida, umedeça levemente as bordas do hemocitômetro com água da torneira e pressione a lamínula sobre ele. A lamínula deve assentar-se uniformemente sobre a área prateada de contagem.Agora estamos prontos para a suspensão celular a fim de preparar a suspensão para contagem. Primeiro, se as células forem cultivadas em culturas em monocamada, desprenda as células da superfície da placa utilizando tripsina, conforme visto no vídeo para células aderentes. Uma vez que as células tenham se desprendido da placa, dilua-as conforme necessário para obter uma suspensão uniforme.Certifique-se de dispersar quaisquer aglomerados na suspensão ao usar o hemocitômetro. Recomenda-se uma contagem máxima de 20 a 50 células por quadrado de um milímetro. Quando estiver pronto para carregar o hemocitômetro com sua amostra de células, use uma micropipeta para transferir a suspensão celular para a borda da câmara de contagem do hemocitômetro.Segure a ponta da pipeta sob a lamínula e dispense uma gota da suspensão. A suspensão será puxada para sob a lamínula pela ação capilar. Após preencher a primeira câmara, preencha a segunda câmara de contagem e você estará pronto para contar suas células antes de iniciar a contagem.Deixe as células se acomodarem por alguns minutos. Também é útil remover com absorção qualquer líquido em excesso após as células terem se acomodado. Você pode observar a lâmina ao microscópio com uma ampliação de cem vezes.Você deverá observar a grande área central da grade, que é delimitada por um conjunto de três linhas paralelas. As subdivisões dentro da área central também são delimitadas por três linhas paralelas, e cada subdivisão é dividida em 16 quadrados menores por linhas simples. As células nessa área devem estar distribuídas uniformemente, sem aglomerados.Se as células não estiverem uniformemente distribuídas, lave e recarregue. O hemocitômetro utiliza um contador manual para contar as células em cada um dos quatro cantos e no quadrado central. Não conte as células que tocam a linha do meio das linhas triplas na parte superior e esquerda dos quadrados; não conte as células que tocam a linha do meio das linhas triplas na parte inferior ou direita do quadrado.Repita as contagens para a outra câmara de contagem. Após contar as células, você pode determinar o número de células por mililitro. Para isso, tome a contagem média de células por quadrado e multiplique pelo fator de diluição e por 10.000 para obter o número de células na sua amostra.Multiplique o número de células por mililitro pelo volume total da suspensão celular da qual a amostra foi retirada. Agora estamos prontos para determinar a viabilidade da nossa suspensão. Para determinar o número de células viáveis na sua amostra, utilizaremos o azul de tripano: primeiro, combine 0,5 mililitros de azul de tripano 4%, 0,03 mililitros de HBSS e 0,1 mililitros da suspensão celular em um tubo pequeno, misture bem e deixe o tubo em repouso por cinco minutos antes de carregar o hemocitômetro.As células viáveis devem permanecer não coradas, mas as células mortas aparecerão azuis ao microscópio de hemocitômetro. Conte o número total de células e o número total de células viáveis, ou seja, as não coradas, e calcule a porcentagem de células viáveis na sua amostra. Após concluir, descontamine a lamínula do hemocitômetro lavando-a com etanol 70% e, em seguida, com água desionizada.Deixe secar ao ar e armazene para uso futuro. Acabamos de mostrar como determinar o número e a viabilidade de suas células cultivadas. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte em todos os seus experimentos.

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Molecular Pathology Laboratory Network, Inc.  Determinar o número de células em cultura é importante na normalização das condições de cultivo e na realização de experimentos de quantificação precisa. Neste vídeo, demonstramos como as células são contadas usando um hemocitômetro.

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