Paradigmas para Caracterização farmacológica de C. elegans Mutants Transmissão Sináptica

Resumo

Este vídeo demonstra como empregar dois estimulantes neural, aldicarb e pentilenotetrazol (PTZ), de forma complementar para estudar a função sináptica no nematóide, C. elegans. Esta abordagem complementar também podem ser usados ​​para lançar luz sobre mecanismos evolutivamente conservados para sincronia neuronal modular e tem implicações para a epilepsia e convulsões.

Resumo

O nematóide, Caenorhabditis elegans, tornou-se um modelo conveniente para estudar a neurotransmissão. C. elegans é único entre os modelos animais, como a anatomia e conectividade de seu sistema nervoso foi determinada a partir de micrografias eletrônicas e refinado por ensaios farmacológicos. Neste vídeo, descrevemos como dois complementares estimulantes neural, um inibidor da acetilcolinesterase, chamado aldicarbe, e um ácido gama-aminobutírico (GABA) antagonista do receptor, chamado de pentilenotetrazol (PTZ), pode ser empregada para caracterizar especificamente sinalização em C. elegans junções neuromusculares (NMJs) e facilitar nossa compreensão da antagônicas circuitos neurais.

De 302 C. elegans neurônios, dezenove neurônios GABAérgicos D-tipo do motor corpo inervam os músculos da parede (BWMs), enquanto quatro neurônios GABAérgicos, chamado RMEs, músculos da cabeça inervam. Por outro lado, os neurônios do motor 39 expressar o neurotransmissor excitatório, a acetilcolina (ACh), e antagonizar a transmissão GABA em BWMs para coordenar a locomoção. A natureza antagônica dos neurônios motores GABAérgicos e colinérgicos em corpo NMJs parede foi inicialmente determinada por ablação a laser e, mais tarde reforçada pela exposição aldicarbe. Resultados aldicarbe aguda de exposição em uma paralisia tempo-curso ou dose-resposta no tipo selvagem worms. No entanto, a perda de transmissão ACh excitatórios confere resistência ao aldicarb, como ACh menos acumula em NMJs worm, levando a uma menor estimulação da BWMs. Resistência ao aldicarb pode ser observado com ACh-específicas ou gerais mutantes função sináptica. Consistente com GABA antagônicas e transmissão de ACh, a perda de transmissão GABA, ou uma falta de regular negativamente ACh lançamento, confere hipersensibilidade ao aldicarbe. Embora a exposição aldicarbe levou ao isolamento de vírus homólogos numerosos genes de neurotransmissão, a exposição aldicarbe por si só não pode determinar de forma eficiente papéis predominantes para os genes e as vias de neurônios específicos C. elegans motor. Para esse fim, introduzimos uma abordagem complementar experimental, que usa PTZ.

Mutantes neurotransmissão exibir fenótipos clara, distinta de aldicarbe induzida por paralisia, em resposta a PTZ. Do tipo selvagem worms, bem como os mutantes com incapacidades específicas para liberar ou receber ACh, não mostram sensibilidade aparente para PTZ. No entanto, os mutantes GABA, bem como em geral os mutantes função sináptica, display convulsões anterior de uma maneira tempo-curso ou dose-resposta. Mutantes que não podem regular negativamente a liberação do neurotransmissor em geral e, assim, secretam quantidades excessivas de ACh em BWMs, tornam-se paralisado em PTZ. Os fenótipos PTZ-induzida de discreta aulas mutante indicam que uma abordagem complementar com aldicarb e paradigmas exposição PTZ em C. elegans pode acelerar nossa compreensão da neurotransmissão. Além disso, vídeos demonstrando como realizamos os ensaios farmacológicos devem estabelecer métodos consistentes para C. elegans pesquisa.

Protocolo

Aldicarbe Paradigm Exposição

1. No primeiro dia, garantir que pelo menos trinta vermes adultos jovens estágio de cada genótipo e de cada repetição estará disponível para ensaios aldicarbe no segundo dia. É melhor se um experimentador seleciona cinquenta ou mais vermes estágio L4 em placas NGM fresco (melhor sem nistatina), que contêm E. coli (de preferência OP50) como fonte de alimento, e cultivá-las por 12-24 horas a uma temperatura constante e permissivo (20 ° C a 22 ° C é melhor, apesar de 25 ° C está bem).
   
   
2. No segundo dia, fazer uma solução estoque 100 mM de aldicarbe com etanol 70% (EtOH) e 30% DDH ₂ O. Espalhe a ....

Discussão

Os protocolos atuais para a exposição com aldicarb C. elegans não permitem que pesquisadores a distinguir entre mutantes com déficits específicos de ACh transmissão e mutantes com déficits generalizados na transmissão sináptica, como ambas as classes de mutantes apresentam resistência ao aldicarbe. Da mesma forma, aldicarbe não pode ser usado para determinar se os mutantes têm déficits específicos na transmissão GABA ou falhas generalizadas para regular negativamente ACh transmissão, como ambas as classes de mutantes apresentam hip.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente Aldicarb		Supelco, Sigma-Aldrich	PS734	Comprável do
Reagente	Pentilenotetrazol	Sigma-Aldrich	P6500