Uma técnica rápida para a visualização de células vivas de levedura Imobilizado

Resumo

Uma técnica rápida para a visualização do crescimento de células de levedura imobilizadas, aqui aplicado a repórteres fluorescentes no silêncio de acasalamento loci HML e HMR

Resumo

Apresentamos aqui uma técnica simples, rápida e extremamente flexível para a imobilização e visualização de células de levedura crescendo por microscopia de epifluorescência. A técnica é igualmente adequado para visualização de populações de leveduras estática, ou cursos de experimentos de tempo de até 10 horas de duração. Meu microscopia investiga herança epigenética no loci acasalamento silêncio em S. cerevisiae. Há dois loci de acasalamento em silêncio, HML e HMR, que não são normalmente expressos como eles são embalados em heterocromatina. No silenciamento de fundo sir1 mutante está enfraquecido de tal forma que cada locus pode estar no estado expressa ou silenciados epigenético, por isso, a população como um todo há uma mistura de células de diferentes estados epigenética para ambos HML e HMR. Meu microscopia demonstrou que não há relação entre o estado epigenético da HML e HMR em uma cela individual. sir1 células estocasticamente interruptor estados epigenética, o estabelecimento de silenciamento em um locus previamente expressos ou expressar um locus previamente silenciados. Meu microscopia curso de tempo monitorados individuais sir1 células e seus descendentes para marcar a freqüência de cada um dos quatro possíveis interruptores epigenética e, portanto, a estabilidade de cada um dos estados epigenéticas em células sir1. Veja também Xu et al. Mol. Celular 2006.

Protocolo

1. Células imobilizadas por tempo microscopia de epifluorescência curso. Por favor note que este protocolo só é útil se as lentes objetiva de seu microscópio são abaixo do estágio do microscópio.
   
   
2. Células lugar na concentração desejada em meio líquido em uma lamela de comprimento (cerca de 24x50mm)
   
   
3. Cortar um bloco de agar do tamanho desejado de uma placa de material sintético (estes têm menor autofluorescência) e coloque sobre as células. Coloque o lado do bloco de agar não tratadas por pinças em contato com as células.
   
   
4. Para cursos mais curtos de tempo (até 3 horas), esta configuração é suficiente. Se as células estão se movendo quando visualizado no microscópio, diminuir o volume de células ou aumento de área do bloco de ágar.
   
   
5. Para os cursos mais tempo, coloque uma gota de doce meios líquidos em cima do bloco de ágar, e colocar uma lâmina de vidro em cima do bloco de ágar. Este slide reduz a evaporação através do topo do bloco de ágar. Se desejar, as bordas do bloco de agar em contato com a lamínula pode ser selado com vaselina para reduzir ainda mais a umidade. Eu tenho usado este set up para filmes de até 9 horas de duração, com as células que se dividem em taxas de tipo selvagem.

Discussão

Esta é uma técnica rápida que imobiliza as células de levedura, enquanto ainda permitindo o crescimento. Temos acompanhado o crescimento do fermento para até 10 horas, com o fermento exibindo taxas de divisão de tipo selvagem durante todo o experimento. Note que esta configuração requer a lente objetiva para ser abaixo do estágio do microscópio.