Este vídeo é uma demonstração técnica do protocolo de hibridização para todo o genoma azulejos caminho disposição CGH, que escaneia todo o genoma humano usando apenas 25-100 ng de DNA que podem ser isoladas a partir de uma variedade de fontes, incluindo o material de arquivo formol fixa.
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Artigo de método
Demonstração de técnicas Whole Genome hibridização genômica comparativa de matriz
Neste artigo
Resumo
Resumo
Matriz hibridização genômica comparativa (array CGH) é um método para a detecção de ganhos e perdas de segmentos de DNA ou dosagem do gene no genoma 1. Os recentes avanços nesta tecnologia permitiram a comparação de alta resolução de genomas inteiros para a identificação de alterações genéticas no cancro e outras doenças genéticas 2. O Sub-Megabase Resolução série Tiling set-(ou SMRT) matriz é composta por um conjunto de cerca de 30 mil sobreposição cromossomo artificial bacteriano (BAC) clones que abrangem o genoma humano em ~ par kilobase 100 (kb) segmentos 2. Essas metas são BAC individualmente sintetizados e manchado em duplicado por uma lâmina de vidro única 2-4. Matriz CGH é baseado no princípio de hibridização competitiva. Amostra de DNA e de referência são diferencialmente marcada com Cyanine-3 e corantes fluorescentes Cyanine-5, e co-hibridizados para a matriz. Após um período de incubação, as amostras não ligadas são lavadas a partir do slide ea matriz é impressa. Um pacote de software disponível gratuitamente personalizado chamado SeeGH (www.flintbox.ca) é usado para processar o grande volume de dados coletados - um único experimento gera 53.892 pontos de dados. SeeGH visualiza o log2 relação intensidade de sinal entre as duas amostras em cada alvo BAC, que está verticalmente alinhado com a posição cromossômica 5,6. A matriz SMRT pode detectar alterações tão pequenas quanto 50 kb de tamanho 7. A matriz SMRT pode detectar uma variedade de eventos de rearranjo do DNA DNA incluindo os ganhos, perdas, amplificações e deleções homozigótica. A única vantagem da matriz SMRT é que se pode usar DNA isolado de amostras de parafina fixado em formalina incorporado. Quando combinado com os requisitos de entrada baixa de DNA sem amplificação (25-100ng), que permite perfis de amostras preciosos como os produzidos por microdissecção 7,8. Isto é atribuído ao grande tamanho de cada alvo de hibridização BAC que permite a ligação de amostras suficientes rotulados para produzir sinais para detecção. Outra vantagem desta plataforma é a tolerância da heterogeneidade do tecido, diminuindo a necessidade de microdissecção tecido tedioso 8. Este protocolo de vídeo é um tutorial passo-a-passo da rotulagem o DNA de entrada até a aquisição de sinal para o genoma série azulejos toda SMRT caminho.
Protocolo
PROBE ROTULAGEM
Nota: limite de exposição de Corantes Cye à luz o tempo todo (isso pode ser conseguido através do trabalho em uma área escura ou pela proteção dos tubos com uma tampa, como folha de alumínio)
- Combine:
(Setup um tubo de reação para referência e um tubo de reação para a amostra)- DNA (25-400 ng)
- 5 mL de tampão 5X primers aleatórios (concentração final: 5X Promega Klenow tampão e 7 mg / mL octâmeros aleatório)
- Diluída para 17,0 mL de volume total com H 2 O destilada
- Ferva por 10 minutos a 100 ° C. Transferir imediatamente para o gelo....
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Discussão
Pobres DNA de qualidade não vai fornecer um perfil de hibridização bom. É essencial para garantir que a amostra de ADN de referência e estão livres de contaminantes tais como fenol, RNA, sal, etc que possam interferir com a etapa de rotulagem aleatória principal antes de iniciar um experimento de hibridização. Por exemplo, a ressuspensão de DNA em Tris - EDTA (TE) em vez de água não é recomendada como alta concentração de sal pode inibir a reação rotulagem. Recomendamos assaying qualidade do DNA usando o espectrofotômetro Nanodrop para medi.......
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Agradecimentos
Queremos agradecer aos membros do Laboratório de Lam Wan equipe matriz BAC especialmente Miwa Suzuki e Bryan Chi para a preparação deste artigo. Este trabalho foi financiado com recursos do Canadian Institutes for Health Research, Canadá Genoma / British Columbia Genoma, e NIH / NIDCR conceder RO1 DE15965-01.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Tampão Klenow 5X | Reagente | Promega Corp. | ||
| Oligômeros Aleatórios de Oito Nucleotídeos | Reagente | Alpha DNA | ||
| Mistura 10X de dNTPs | Reagente | Promega Corp. | 2 mM dATP, dGTP, dTTP, 1,2 mM dCTP | |
| dCTP marcado com Cy-3 | Reagente | GE Healthcare | ||
| dCTP marcado com Cy-5 | Reagente | GE Healthcare | ||
| ADN Genômico Humano de Referência | Reagente | Novagen, EMD Millipore | Exemplo de uma possível referência | |
| Klenow | Reagente | Promega Corp. | ||
| Coluna YM-30 | Reagente | EMD Millipore | ||
| ADN Cot-1 | Reagente | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagente | Roche Group | ||
| ADN de Esperma de Arenque Fragmentado | Reagente | Promega Corp. | ||
| Lâmina de Cobertura | Reagente | Fisher Scientific | 22 mm x 60 mm | |
| Cassete de Hibridização | Ferramenta | Telechem |
Referências
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L.
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Reimpressões e permissões
