Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Resumo

Este vídeo demonstra de 2 cores montar toda hibridização in situ, um método pelo qual o padrão de expressão espacial e temporal de 2 genes diferentes podem ser visualizados em embriões de galinha jovens. Este método foi originalmente introduzido por David Wilkinson, Henrique Domingos, Phil e David Ingham Ish-Horowicz.

Resumo

O embrião de galinha é uma ferramenta valiosa no estudo do desenvolvimento embrionário precoce. Sua transparência, acessibilidade e facilidade de manipulação, torná-lo uma ferramenta ideal para estudar a expressão genética no cérebro, tubo neural, somito e formação de coração primórdios. Este vídeo demonstra as diferentes etapas em 2 cores montar toda a hibridização in situ; Primeiro, o embrião é dissecada do ovo e fixados em paraformaldeído. Em segundo lugar, o embrião é processada para prehybridization. O embrião é então hibridizado com duas sondas diferentes, um acoplado a DIG, e acoplado a um FITC. Após a hibridização durante a noite, o embrião é incubada com anticorpo acoplado DIG. Reação de cor para substrato DIG é realizada, ea região de interesse aparece em azul. O embrião é, então, incubadas com anticorpo acoplado FITC. O embrião é processado para reação de cor com FITC, ea região de interesse aparece em vermelho. Finalmente, o embrião é fixo e processados ​​para phtograph e corte. Um guia resolução de problemas também é apresentada.

Protocolo

Parte 1: Corrigindo os embriões

1. Preencha prato com dissecção gelada DEPC-PBS. Manter no gelo. Abra o ovo tocando no shell com uma pinça e remover peças de shell.
2. Remover espessura albumina com uma pinça. Tilt saco vitelino com uma pinça grossa para que embrião voltado para cima.
3. Com uma tesoura, corte um quadrado de saco vitelino em torno do embrião.
4. Usando uma colher, retire embrião da gema e colocar no gelo frio DEPC-PBS.
5. Sob o microscópio, retire as membranas e gema e transferência para prato de fixação.
6. Pino para baixo, remova-DEPC PBS. Substituir por PFA 4% em PBS-DEPC e corrigir S / N, 4 ° C.
7. Remover fixador. Substituir por gelada DEPC-PBS. Usando uma agulha fim blunt microcapilar ou uma faca microdissecção, perfurar o sistema nervoso e as cavidades do coração, para evitar aprisionamento de sonda.
8. Lavar 2x 10 mn DEPC-PBS com 0,1% Tween-20 (PBT). Desidratar a 10 minutos cada em 25%, 50%, metanol 75% em PBT. Desidratar embriões duas vezes em metanol 100%. Armazenar a -20 ° C em metanol.

Parte 2: Prehybridization

1. Reidratar embriões 10 minutos cada em 75%, 50% e metanol 25% em PBT. Lavar 2x 10 minutos em PBT.
2. Enquanto isso, prepare fixador gelada (paraformaldeído 4% em PBT). Substituir PBT com proteinase K solução (3 ml / frasco; [? 5 g / ml] final em PBT). Certifique-se que o frasco inteiro é exposto à solução de proteinase K por suaves do frasco; consulte Solução de problemas para tempos de exposição.
3. Usando RNase livre Pasteur pipeta, remova proteinase K e adicionar fixador (2 ml). Colocar imediatamente no gelo por exatamente 20 minutos.
4. Todas as lavagens RT são executadas em nutator. Lavar 2x 10 minutos em PBT e PBT em 1x 10mn contendo tampão de hibridação de 50%.
5. Lavar em 1x tampão de hibridação. Incubar a 65 ° C em tampão de hibridação 2 ml por 4-5 hr.

Parte 3: embriões híbridos com sondas

1. DIG e FITC síntese sonda acoplada é descrito no apêndice. A sonda deverá dar um sinal forte, deve ser synhesized com FITC contendo nucleotídeos, o mais fraco sonda deve ser sintetizado com a DIG contendo nucleotídeos.
2. Pré-aquecer as sondas em tampão de hibridação (500 ng / ml cada) usando um frasco de 2 ml. Prontamente substituir o tampão de hibridação com a solução de sonda. Não deixe que os embriões seco. Incubar por 16 horas a 65 ° C.
3. Substituir sonda com tampão de hibridação, 2 lavagens, 30 min cada a 65 ° C. Lavar 15 minutos em tampão de hibridação / injuded (01/01 v / v /) a 65 ° C.

Parte 4: DIG de incubação de anticorpos e cor reação

1. Lavar 2x20 mn em injuded. Lave 1 hr em 2% BBR / injuded. Lavar 5 horas em 2% BBR/20% HISS / injuded (tampão de bloqueio). Incubar em 1:2000 do anticorpo DIG diluído em tampão de bloqueio, O / N, 4 ° C em nutator.
2. Lavar 3x 10 minutos cada um em injuded, e 1 hora cada em 3x injuded.
3. Lavar 2x 20 mn em NTMT. Adicionar 200ul substrato NBT / BCIP a 10 NTMT ml. Remover imediatamente NTMT do frasco e substituir com 1-2 ml de tampão NBT / BCIP. Lugar no escuro. Monitorar a reação de cor depois de 20 mn, e em intervalos de 20 min depois.
4. Após a reação de cor (deve aparecer azul), lavar em PBS durante 10 mn, o pino para baixo no prato de fixação preenchido com PBS, e substituir solução com PFA 4% em PBS. Fix O / N a 4 ° C.
5. Transferir para frasco de cintilação novo. Lave em PBST (PBS com 1% Tween-20) 2x10 mn. Lave em injuded 2x 10 minutos.
6. Incubar em injuded 30 mn a 63 ° C.

Parte 5: a incubação do anticorpo FITC e cor reação

1. Lavar 2x 10 minutos em injuded, 1 hr em 2% BBR / injuded, 5 hr em tampão de bloqueio
2. Incubar em fosfatase alcalina anti-coupled-FITC-anticorpos (1:500) O / N a 4 ° C.
3. Lavar 3x 10 minutos cada um em injuded, e 1 hora cada em 3x injuded.
4. Lave em 2x 20 minutos em TBS pH 8,45 com 0,1% Tween-20 (TBST).
5. Preparar a solução Vector Vermelha de trabalho (5 ml) em TBST utilizando reagentes 1,2 e 3 incluída no kit. Remover imediatamente TBST do frasco e substituir com Vector tampão Vermelho. Lugar no escuro. Monitorar a reação de cor depois de 40 mn, e intervalos de 30 min depois.
6. Reação de cor seguinte (deve aparecer em vermelho), os embriões transferidos para PBS.

Parte 6: Fixação e processamento

1. Transferência para o prato de fixação contendo PBS, e fixar em PFA 4% por 20 min em temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C.
2. Lavar em PBS, 2x 10 minutos. Ao processo para a fotografia, a transferência para glicerol 20% em PBS (isto fará com que os embriões translúcido). Para criar uma câmara, corte duas tiras de fita PVC, sobrepô-las em slide. Corte um quadrado no centro usando uma lâmina. Remova a pinça quadrada usando.
3. Ao processo de corte de cera, a transferência de volta para PBS, lave 2x 10 minutos, desidratar em série graduada de metanol (25%, 50%, 75% e 100% em PBS, a 10 minutos cada).
4. Substituir com propanol, 3mn. Substituir com 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, 20 mn seguido por Histoclear (2x 1 hr). Substituir com histoclear / cera 01/01 (v / v) 60 ° C por 1 hora. Substituir por um processo de cerapara histologia.

Parte 7: Soluções

Tampão de hibridação loja, a -20 ° C no Falcon, 50 ml: 25 ml formamida; 3,25 ml (20xSSC), 0,5 ml (EDTA 0,5 M); 1 ml (10% Tween-20), 2,5 ml (1% SDS) ; 125 ul (20mg/ml tRNA);. 100ul (50 heparina mg / ml) injuded, prepare ácido maleico 100mM, pH para 7,5 com NaOH pellets. Adicionar 150mm NaCl e 0,1% Tween-20.

NTMT (feito um pouco antes de usar), 50 ml: 1 ml (NaCl 5M), 2,5 ml (2M Tris-HCl pH9.5); 1,25 ml (2M MgCl _2), 5 ml (10% Tween-20).

TBST: 0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, pH 8,45, 0,1% Tween-20.

Parte 8: Resolução de problemas

Problema	Causa	Remédio
Embrião é enrolado	Desidratação insuficiente / reidratação	Manter intervalos de 10 min durante sucessivos de desidratação / reidratação passos
Não há nenhum sinal de sonda	Sonda é a contaminação RNase degradadas em frasco	Executar sonda em 1% gel Agarose Certifique-se que o frasco inteiro é exposto a solução de proteinase K no passo 2
Sonda é etiquetas cavidades do coração de um tubo neural	Sonda é preso	No passo 2, certifique-se que todas as cavidades são faca microdissecção perfurado usando ou microcapilar
Embrião se desintegrou hibridização seguinte (passo 3)	Proteinase K passo esquerdo temperatura de hibridação muito longo é muito alta	Proteinase K não deve ser deixado mais tempo do que 1mn (estágios 3 e 4 +), 2 mn (estágio 5 a 7), 3 mn (fase 10/08), 4 mn (etapa 11-13) Não hibridizam em T o maior de 65 o C

Parte 9: Resultados Representante

Embriões representativos são mostrados abaixo: (A) Embrião (estágio HH7) é marcado com uma sonda DIG-Sox (azul) e uma FITC-delta-1 sonda (vermelho). (B) Embrião (estágio HH8) é marcado com uma sonda DIG-Pax6 (azul) e uma sonda FITC-Shh (vermelho). Nf, neural dobra, anp, placa neural anterior, psm, mesoderma presomitic, n, notocorda, nt, tubo neural). Sonda presentes dos laboratórios dos Drs.. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, e J. Briscoe.

Discussão

A montagem de 2 cores em todo método de hibridização in situ é usado para determinar os padrões espaciais e temporais da expressão gênica, usando um ou dois genes de interesse. As aplicações incluem análise de padrões de expressão gênica de genes novos (por exemplo, ^1,2, assim como mudanças na expressão gênica insulto seguinte (manipulações embrionárias ^{3, 4} contas, e eletroporação de RNA ou DNA construções ^5).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ovos	Animal	Charles River Laboratories	Premium Fértil
Stereomicroscópio	Microsscópio	Leica Microsystems	MZ9.5
Incubadora Automática Marsh	Ferramenta	Lyon	RX
Incubadora de Hibridização	Ferramenta	Hybaid	Micro-4
Misturador orbital Adams Nutator	Ferramenta	Fisher Scientific	14-062
Pinça Curva (1)	Ferramenta	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Tesoura fina	Ferramenta	Fine Science Tools	14161-10
Colher	Ferramenta	Fine Science Tools	10370-18
Pipeta Capilar de Pasteur		Electron Microscopy Sciences	70950-12
Tubo microcapilar		Sigma-Aldrich	P1049-1PAK	Puxar usando puxador vertical de micropipetas; arredondar a extremidade com pinça fina
Faca de microdissecação		Fine Science Tools	10056-12	Usar para perfurar cavidades antes da hibridização in situ
Alfinetes Minuten, diâmetro 0,2 mm		Fine Science Tools	26002-20	Manter os alfinetes juntos usando um agitador magnético;
Agente de cura e base de elastômero de silicone Sylgard 184	Reagente	Dow Corning	0001986475	Misturar 1 parte do agente de cura com 9 partes da base; deixar curar durante a noite a 37 °C
Diethylpirocarbonato (depc)	Reagente	Acros Organics	10025025	Adicionar 1 ml de depc a 1 l de PBS; agitar; autoclavar
PFA 16%	Reagente	Electron Microscopy Sciences	15710
Tween-20	Reagente	Sigma-Aldrich	P1379-100ML
Protease K		Sigma-Aldrich	P2308-5MG	Estoque a 10 mg/ml em H₂O com depc em alíquotas de 10 µl. Armazenar a -20 °C.
Formamida, desionizada	Reagente	Ambion	9342
tRNA de levedura - 25 mg	Reagente	Invitrogen	15401-011	Estoque a 20 mg/ml em H₂O com depc em alíquotas de 125 µl. Armazenar a -20 °C
Heparina, sal de sódio	Reagente	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	Estoque a 50 mg/ml em H₂O com depc em alíquotas de 100 µl. Armazenar a -20 °C.
SSC x20 pH 5,5	Reagente	Fisher Scientific	PR-V4261
EDTA (0,5 M)	PR-V4231	Fisher Scientific
SDS	Reagente	Fisher Scientific	BP166-100
Ácido málico	Reagente	Fluka	63189
Agente bloqueador B–hringer	Reagente	Roche Group	11096176001	Usar a 2% em MABT. Para preparar, aquecer com MABT por 20 min a 60 °C. Pode-se preparar um estoque e armazenar em alíquotas de 1-5 ml a 20 °C.
Soro de ovelha inativado pelo calor	Reagente	Jackson ImmunoResearch	013-000-121	Dissolver em 10 ml de H₂O; aquecer a 55 °C por 30 min. Aliquotar em 1 ml e armazenar a -20 °C.
Anti-Digoxigenina-AP, fragmentos Fab	Reagente	Roche Group	11093274910
Solução estoque de NBT/BCIP	Reagente	Roche Group	11681451001
Anti-Fluoresceína-AP, fragmentos Fab	Reagente	Roche Group	11426338910
Tris 2 M	BP1759-500	Fisher Scientific
Kit de Substrato de Fosfatase Alcalina Vector Red	Reagente	Vector Laboratories	SK-5100
1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno	Reagente	Sigma-Aldrich	429325-100ML	Sob capela