Este é um protocolo que descreve como isolar e cultura primária de neurônios simpáticos gânglios cervical superior (GCS) de filhotes de rato recém-nascido.
Artigo de método
Este é um protocolo que descreve como isolar e cultura primária de neurônios simpáticos gânglios cervical superior (GCS) de filhotes de rato recém-nascido.
Os gânglios cervical superior (GCS) de ratos são pequenos, brilhantes, em forma de amêndoa estruturas que contêm neurônios simpáticos. Esses neurônios fornecem inervação simpática para a cabeça e pescoço e constituem uma população bem caracterizados e relativamente homogêneo (4). Neurônios simpáticos são dependentes de fator de crescimento neural (NGF) para a diferenciação, sobrevivência e crescimento axonal ea propagação de grande disponibilidade de NGF facilita sua cultura e manipulação experimental (2, 3, 6). Por estas razões, cultivadas neurônios simpáticos têm sido utilizadas em uma ampla variedade de estudos, incluindo o desenvolvimento neuronal e diferenciação, os mecanismos de morte celular programada e patológicos, e transdução de sinal (1, 2, 5 e 6). Dissecando o SCG de ratos recém-nascidos e neurônios simpáticos cultura não é muito complicado e pode ser dominada com bastante rapidez. Neste artigo, iremos descrever em detalhes como dissecar o SCG de filhotes de rato recém-nascido e para usá-los para estabelecer culturas de neurônios simpáticos. O artigo também descreve as etapas preparatórias e os vários reagentes e equipamentos que são necessários para alcançar este objectivo.
1. Preparação para a dissecação:
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Nós usamos ratos Sprague Dawley de nossas culturas.
Tire um tempo e cuidado ao limpar os gânglios. Remover todos os detritos, vasos sangüíneos e gordura. Este passo é importante para garantir uma cultura que é mais ou menos homogêneo e livre de tipos de células estranhas. A adição de uridine/5-FDU em grande parte eliminar qualquer resquício de células não-neuronais (mitose) contaminando a cultura ou, pelo menos, reprimir a sua proliferação.
Além disso, durante a etapa de dissociação, ser paciente e ter tempo para separar os .......
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Os autores não têm nada a declarar.
NZ gostaria de agradecer aos membros do laboratório Subhas Biswas, Andrew Sproul, e Ryan Willet para a formação dela em dissecar e colheita neurônios simpáticos. Suportada por concessões do NIH-NINDS.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Pinceta, aço inoxidável nº 5 | Ferramenta | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Tesoura, DEAVER reta com pontas finas e rombas - lâminas de 43 mm - 5,5 | Ferramenta | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 com L-Glutamina | Reagente | Cellgro | 10-040-CV | |
| Soro bovino fetal | Reagente | SAFC Global | 12103c | |
| Soro de cavalo doador | Reagente | JRH Biosciences | 12449 | Inativar pelo calor incubando em banho-maria a 56°C por 30 minutos. |
| Penicilina/estreptomicina | Reagente | GIBCO, por Life Technologies | 15140-122 | |
| Tripsina sem EDTA | Reagente | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridina | Reagente | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxiuridina | Reagente | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagente | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Microscópio de dissecação e fonte de luz | Microscópio | |||
| Tubos de polipropileno de 15 ml | Ferramenta | BD Biosciences | 352096 | |
| Placas de cultura celular | Ferramenta | Corning |
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