1.13: Análise de Carbono e Nitrogênio de Amostras Ambientais

1. Preparação de Amostras de Solo

1. Amostras de solo seco a 60 °C por 48 h.
2. Passe o solo através de uma peneira de 2 mm x 2 mm.
3. Coloque aproximadamente 5 g do solo no moedor de moinho de bola e triture por 2 min. É importante obter uma amostra homogênea, pois o tamanho da sua amostra será muito pequeno.
4. Coloque o solo moído em um recipiente pequeno e guarde em um desiccador até estar pronto para uso.

2. Configuração dos parâmetros do instrumento

1. Ligue o instrumento Flash EA 1112 na parte de trás, invertendo o interruptor.
2. Ligue o computador.
3. Clique duas vezes no ícone "Ansioso 300" para iniciar o programa de software que executa o instrumento.
4. Clique duas vezes no ícone "NC Soils" para abrir o método que executa a configuração do instrumento para solos.
5. Aqueça o instrumento abrindo os parâmetros do "Analisador Elemental" e clicando no botão "Enviar". Os parâmetros devem ser os seguintes (Ver Figuras 1-3):
   a. Temperaturas: Esquerda = 900 °C, Direita = 680 °C, Forno = 50 °C
   b. Fluxo de gás: Transportador = 130 mL/min, Oxigênio = 250 mL/min, Referência = 100 mL/min
   c. Tempo de execução do ciclo = 360 s
   d. Atraso amostral = 12 s
   e. Extremidade da injeção de oxigênio = 5 s
   f. Detector = Filamento Ligado
6. Crie uma tabela de amostra clicando em "Editar tabela de amostra" e, em seguida, "Preencher a tabela da amostra". Altere o nome do arquivo para a data de hoje. Insira o número de amostras que você planeja executar, incluindo os padrões e espaços em branco. Em seguida, clique em "Substituir" para substituir a última tabela de amostra que foi criada com a sua nova tabela de amostra.

3. Criando uma Curva Padrão

1. Usando fórceps, remova um disco de estanho da embalagem e molde-o em uma forma de copo usando o dispositivo especial de vedação. Evite tocar o disco de lata com os dedos para evitar a transferência de óleos da ponta dos dedos. (Ver Números 4-5)
2. Usando fórceps, coloque o disco de estanho no microequilípmo e zero o equilíbrio.
3. Usando fórceps, remova o disco de estanho do microequilíptico e usando uma microspatula, coloque aproximadamente 1 mg de ácido aspartíco padrão no disco de estanho.
4. Pesar o disco de estanho com o padrão de ácido aspartílico no microequilíptico. Digite esse peso na tabela de dados no software Eager 300 no computador.
5. Sele o disco de lata com as fórceps para que nenhum dos padrões de ácido aspartílico vaze dele. Coloque o pacote de lata no autosampler. (Ver Figura 6)
6. Repetir as etapas 3.1 – 3.5, utilizando aproximadamente 5 mg de padrão ácido aspartíaco.
7. Repetir as etapas 3.1 – 3.5, utilizando aproximadamente 7,5 mg de padrão ácido aspáltico.
8. Repetir as etapas 3.1 – 3.5, utilizando aproximadamente 10 mg de padrão ácido aspáltico.

4. Carregando o Autosampler com amostras de solo

1. Usando fórceps, remova um disco de estanho da embalagem e molde-o em uma forma de copo usando o dispositivo de vedação. Você não deve tocar a lata com os dedos para evitar a transferência de óleos da ponta dos dedos.
2. Usando fórceps, coloque o disco de estanho no microequilípmo e zero o equilíbrio.
3. Remova o disco de estanho do microequilípmo e coloque aproximadamente 50 mg do solo homogeneizado no disco de lata usando uma microspatula.
4. Pesar o disco de lata com amostra de solo no microequilíramismo. Digite esse peso na tabela de dados no software Eager 300 no computador.
5. Sele o disco de estanho usando as fórceps para que o solo seja contido. Transfira o pacote de lata para a bandeja do autosampler.
6. Repita os passos 4.1 – 4.5 para todas as suas amostras. Recomenda-se executar ensaios triplicados de cada amostra. Um experimento triplicado é considerado uma boa regra de ouro para descartar erros experimentais.

5. Execução das Amostras

1. Quando as temperaturas apropriadas tiverem sido atingidas no instrumento, a luz verde "Temperatura Pronta" acenderá. Na parte inferior da tela do computador, ele também dirá "Pronto para análise".
2. Antes de iniciar sua execução de amostra, clique em "Arquivo" e "Método de salvar" para salvar os dados que você acabou de inserir. Recomenda-se que você salve o método com seu sobrenome e a data.
3. Para começar a corrida, clique no arqueiro verde e empurre "Iniciar agora".
4. Levará aproximadamente 6 minutos por amostra para ser executado.
5. Depois que a execução estiver concluída, você pode ver os resultados clicando em "Recálculo" e depois em "Resumir resultados".

Figura 1. Tela de configuração dos parâmetros Flash EA 1112 1.

Figura 2. Tela de configuração dos parâmetros Flash EA 1112 2.

Figura 3. Tela de configuração dos parâmetros Flash EA 1112 3.

Figura 4. Removendo um disco de lata com fórceps.

Figura 5. O disco de estanho moldado em forma de copo usando o dispositivo de vedação.

Figura 6. O pacote de lata que está sendo colocado no autosampler.

A análise das quantidades de carbono e nitrogênio em amostras ambientais - um processo conhecido como "análise elementar" - fornece informações importantes sobre as propriedades ecológicas do meio ambiente.

Carbono e nitrogênio são dois dos elementos mais importantes para a vida. O carbono é a base dos compostos orgânicos que formam a base de todos os seres vivos e é particularmente útil como medida para moléculas como os carboidratos, a principal fonte de energia para os organismos. Por outro lado, o nitrogênio é encontrado em moléculas como nucléicos e aminoácidos. Estes servem, respectivamente, como material genético e como blocos de construção das proteínas usadas pelos organismos para estrutura e função.

Como essas diferentes classes de moléculas orgânicas têm diferentes papéis biológicos, os organismos as requerem em quantidades diferentes. Por exemplo, os microrganismos no solo normalmente requerem fontes de alimento com uma proporção C:N de 24:1. Como diferentes resíduos vegetais têm diferentes proporções de C:N que variam de 13:1, como a alfafa, a 57:1, como no milho, eles serão decompostos por micróbios em diferentes taxas e em diferentes extensões, afetando a forma como os nutrientes são devolvidos ao solo.

Este vídeo apresentará os princípios de análise da composição elementar de carbono e nitrogênio; um protocolo para a realização de análises elementares em amostras de solo; e, finalmente, algumas aplicações desse método de análise para pesquisas ambientais.

A análise elementar pode ser realizada de várias maneiras, como o uso de reações químicas específicas, muitas vezes envolvendo ácidos fortes, resultando em produtos característicos que podem ser detectados. Uma grande melhoria na metodologia de análise elementar foi o desenvolvimento da técnica de combustão instantânea, que eliminou a necessidade de usar produtos químicos perigosos, simplificou e acelerou bastante o processo e permitiu a automação.

A base da análise elementar baseada em combustão instantânea é oxidar a amostra em uma "câmara de oxidação", queimando-a na presença de oxigênio em altas temperaturas de cerca de 1.000 ? C na presença de um catalisador, que acelera a reação. Isso converte o carbono na amostra em gás dióxido de carbono e o nitrogênio em óxido de nitrogênio e gases de nitrogênio. Um "gás transportador" inerte, como o hélio, é então usado para transportar esses produtos de combustão para uma "câmara de redução" com enchimento de cobre, onde os óxidos de nitrogênio são posteriormente convertidos em gás nitrogênio. O excesso de vapor de água é removido da mistura de gases por filtração com um dessecante, como o perclorato de magnésio.

Os produtos da combustão instantânea podem então ser separados por cromatografia gasosa, durante a qual as moléculas de gás passam por uma tubulação, chamada coluna, contendo uma fina camada de líquido ou polímero. Os gases se dissolvem e vaporizam repetidamente desse substrato à medida que passam pela coluna, a taxas que dependem da força com que as moléculas interagem com o substrato e o gás transportador. Uma espécie que passa mais tempo dissolvida no substrato viajará mais lentamente pela coluna, permitindo assim que os gases sejam diferenciados.

Uma vez que saem da coluna, os gases podem ser identificados, por exemplo, detectando o quão bem eles conduzem o calor, uma propriedade conhecida como condutividade térmica. Ao traçar o tempo que cada gás leva para viajar pela bobina, os cientistas obtêm um "cromatograma" com picos que representam cada gás. Calculando as quantidades detectadas de dióxido de carbono e gases nitrogênio usando a área sob os respectivos picos, a razão C:N na amostra original pode ser deduzida.

Agora que você entende os princípios da análise elementar de carbono e nitrogênio usando o método de combustão instantânea, vamos passar por um protocolo para fazer isso usando um analisador elementar automatizado.

Para preparar as amostras de solo para análise, primeiro seque as amostras em um 60 ? C forno por 48 h. Em seguida, passe o solo seco por uma peneira de 2 x 2 mm e descarte qualquer partícula de solo que não passe. Em seguida, use um moedor de bolas para moer aproximadamente 5 g de solo por 2 min para fazer um pó homogêneo. Coloque o solo moído em um pequeno recipiente, como um frasco de polietileno, e armazene-o em um dessecador até a hora de usar.

Defina os parâmetros de análise no analisador elementar de acordo com as instruções do fabricante. Isso inclui as temperaturas do forno de oxidação, do forno de redução e do forno de cromatografia gasosa, a vazão do gás de arraste, a taxa de injeção de oxigênio, a vazão do gás de referência, o tempo de execução do ciclo, o atraso entre a queda da amostra e a injeção de oxigênio na câmara de oxidação e a duração da injeção de oxigênio.

Para determinar quantitativamente a composição da amostra, uma curva padrão é criada primeiro usando diferentes quantidades de um composto de composição conhecida, como o ácido aspártico.

Para fazer isso, primeiro use uma pinça para remover um disco de retenção de amostra de estanho de uma embalagem e moldá-lo em forma de copo usando o dispositivo de vedação especializado. Evite tocar no disco de estanho com os dedos, pois isso pode levar à transferência de óleos para o disco.

Agora, coloque o copo de estanho em uma microbalança e defina a massa de tara. Remova o copo de lata e, em seguida, use uma microespátula para colocar aproximadamente 1 mg do padrão de ácido aspártico no copo. Pese o copo e registre a massa. Em seguida, sele o copo de lata e coloque-o no amostrador automático, que entregará automaticamente cada amostra na câmara de reação.

Repita as etapas acima para várias quantidades do padrão. Em seguida, coloque todos os padrões no amostrador automático.

Dispensar e pesar as amostras de solo em copos de estanho de forma semelhante aos padrões, utilizando aproximadamente 50 mg de cada amostra de solo homogeneizada. Preparar cada amostra em triplicado.

Depois que todas as amostras forem colocadas no amostrador automático e as temperaturas apropriadas forem atingidas no instrumento, defina as medições para serem executadas. O software do instrumento produzirá um cromatograma para cada padrão e amostra.

Dependendo dos parâmetros utilizados, o pico do gás nitrogênio deve ser de cerca de 110 s no cromatograma, enquanto o pico de dióxido de carbono é detectado em torno de 190 s. As curvas padrão são geradas com ácido aspártico, que tem uma proporção de carbono para nitrogênio de 4 para 1. Com esse conhecimento, juntamente com a concentração de cada padrão, a área sob cada pico pode ser usada para calcular a quantidade de nitrogênio e carbono em cada amostra.

Com base na massa da amostra original, a porcentagem de nitrogênio e a porcentagem de carbono de cada amostra podem ser calculadas. Nesta demonstração, a relação C:N desta amostra de solo foi de aproximadamente 13:1, inferior à proporção de 14,25:1 normalmente encontrada para solo sob florestas abertas e indicativa de bosques dominados pelas invasoras árvores de espinheiro europeu.

A análise do teor de carbono e nitrogênio pode ser aplicada a uma variedade de amostras ambientais, além do solo, e tem amplas aplicações na pesquisa ambiental.

Neste exemplo, os pesquisadores coletaram amostras de água de vários habitats marinhos, como recifes de coral. Para entender a disponibilidade de nutrientes orgânicos para as comunidades microbianas marinhas, vários parâmetros químicos foram medidos, incluindo análise elementar de carbono e nitrogênio. Os níveis de carbono orgânico dissolvido foram medidos diretamente da amostra de água, enquanto a matéria orgânica particulada foi filtrada da água e analisada.

A análise elementar também pode ser usada para monitorar a perda de nutrientes no escoamento da irrigação de paisagens urbanas e gramados, que podem poluir o abastecimento de água. Aqui, os cientistas montaram parcelas de teste para simular paisagens urbanas e entender melhor esse processo. Uma variedade de testes químicos foi usada para analisar nutrientes específicos, como nitratos e amônia no escoamento coletado, e a análise elementar baseada em combustão foi usada para medir os níveis de carbono orgânico dissolvido e nitrogênio.

Finalmente, a análise da relação C:N em carcaças de herbívoros revelou uma ligação interessante entre o risco de predação e a taxa de decomposição no solo. Neste estudo, os gafanhotos foram criados com ou sem risco de predação por aranhas. As carcaças desses gafanhotos foram então decompostas em parcelas de solo, e detritos de plantas foram posteriormente adicionados ao solo para decomposição.

A análise elementar mostrou um aumento ligeiramente maior da relação C: N em gafanhotos criados com risco de predação, mas isso, por sua vez, levou a uma diminuição significativa da taxa de decomposição no solo em que o gafanhoto estressado foi decomposto, apontando para uma dinâmica complexa inesperada no ciclo de nutrientes do ecossistema.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre análise de carbono e nitrogênio de amostras ambientais. Agora você deve entender os princípios por trás desse método de análise; como realizá-lo usando um analisador elementar de combustão flash; e algumas de suas aplicações na ciência ambiental. Como sempre, obrigado por assistir!