Cultivo e Enumeração de Bactérias de Amostras de Solo

1. Preparação de Diluições do Solo

1. Para iniciar o procedimento, pese 10 g de amostra de solo e adicione a 95 mL de água deionizada. Agite bem a suspensão, e rotule como "A".
2. Antes que o solo se instale, remova 1 mL da suspensão com uma pipeta estéril e transfira-a para uma água deionizada de 9 mL em branco. Vórtice completamente, e rotular como "B".
3. Repita esta etapa de diluição três vezes, cada vez com 1 mL da suspensão anterior e uma água deionizada de 9 mL em branco. Rotule-os sequencialmente como tubos C, D e E. Isso resulta em diluições seriais de 10^-1 a 10^-5 gramas de solo por mL

2. Fazer placas de difusão para a cultura bacteriana

1. Para cultivar colônias bacterianas, pegue três placas de ágar de peptone-levedura pré-preparadas e rotule-as como amostras C, D e E. Vortex C, D e E, e pipeta 0,1 mL em cada prato. Isso aumenta ainda mais o valor de diluição, por um fator de dez (C = 10^-3, D = 10^-4, E = 10^-5).
2. Em seguida, mergulhe um espalhador de vidro no etanol. Coloque o espalhador em chamas por alguns segundos para acender e queimar o etanol. Isso esterilizará o espalhador.
3. Segure o espalhador acima da primeira placa até que a chama seja apagada. Abra a placa rapidamente, segurando a tampa por perto. Toque o espalhador para o ágar longe do áculo (Inoculum = células usadas para começar uma cultura) para esfriar, e depois espalhe a gota de inóculo ao redor da superfície do ágar até que traços de líquido livre desapareçam. Substitua a tampa da placa.
4. Re-flame o espalhador e repita o processo com a próxima placa, trabalhando rapidamente para não contaminar o ágar com organismos aéreos
5. Incubar as placas de bactérias à temperatura ambiente por 1 semana. Certifique-se de que as placas estão invertidas durante a incubação para evitar que gotas de umidade de condensação caiam sobre a superfície do ágar.

3. Fabricação de placas de difusão para Actinomycetes

1. Para cultivar actinomycetes, pegue três placas de glicerol pré-preparadas e rotule-as como B, C e D. Utilizando as técnicas mostradas anteriormente, espalhe placa de 0,1 mL das suspensões B, C e D. As diluições mais baixas são utilizadas porque os actinomycetes estão tipicamente presentes como 1/10 da população bacteriana (B = 10^-2, C = 10^-3, D = 10^-4).
2. Incubar as placas de actinomycete (invertidas) à temperatura ambiente por 2 semanas.

4. Contagem de bactérias e actinomycetos

1. Após a incubação, examine cuidadosamente todas as placas de bactérias e note diferenças no tamanho e forma da colônia. Quando cultivadas em ágar, as bactérias produzem colônias viscosas que vão de incolor a laranja brilhante, amarelo ou rosa. Em contraste, as colônias de actinomycete são calcéticas, firmes, de couro, e quebrarão sob pressão, onde outras colônias bacterianas irão manchar. Isso permite que as colônias sejam distinguidas pelo contato com um laço estéril.
2. Conte e regise o número de colônias bacterianas, incluindo quaisquer actinomycetes. Só conte placas com 30-200 colônias por placa.

5. Isolamento de Culturas Puras

1. Selecione colônias bacterianas individuais de qualquer uma das placas. Mais colônias podem ser selecionadas se houver interesse particular no solo. Use uma placa de diluição alta, pois tende a ter colônias puras que são bem separadas. Escolha apenas colônias bem separadas das colônias vizinhas e pareça morfologicamente distintas umas das outras.
2. Esterilize o laço mergulhando-o em álcool e flamejando-o. Abra rapidamente a placa de Petri de interesse, e toque o laço em um ponto nu no ágar para esfriá-lo. Em seguida, remova uma pequena quantidade de uma colônia de interesse no loop.
3. Tomando uma placa de levedura de peptone fresco, faça uma raia de alguns centímetros de comprimento de um lado. Esterilizar e esfriar novamente, depois faça uma raia que cruza a raia inicial apenas na primeira passagem. Repita este processo mais duas vezes da mesma maneira. Essa "diluição" de streaking resulta em células no loop sendo separadas umas das outras. Coloque a placa em uma área escura para incubar em temperatura ambiente por duas semanas.