2.13: Cultivo e Enumeração de Bactérias de Amostras de Solo

1. Preparação de Diluições do Solo

1. Para iniciar o procedimento, pese 10 g de amostra de solo e adicione a 95 mL de água deionizada. Agite bem a suspensão, e rotule como "A".
2. Antes que o solo se instale, remova 1 mL da suspensão com uma pipeta estéril e transfira-a para uma água deionizada de 9 mL em branco. Vórtice completamente, e rotular como "B".
3. Repita esta etapa de diluição três vezes, cada vez com 1 mL da suspensão anterior e uma água deionizada de 9 mL em branco. Rotule-os sequencialmente como tubos C, D e E. Isso resulta em diluições seriais de 10^-1 a 10^-5 gramas de solo por mL

2. Fazer placas de difusão para a cultura bacteriana

1. Para cultivar colônias bacterianas, pegue três placas de ágar de peptone-levedura pré-preparadas e rotule-as como amostras C, D e E. Vortex C, D e E, e pipeta 0,1 mL em cada prato. Isso aumenta ainda mais o valor de diluição, por um fator de dez (C = 10^-3, D = 10^-4, E = 10^-5).
2. Em seguida, mergulhe um espalhador de vidro no etanol. Coloque o espalhador em chamas por alguns segundos para acender e queimar o etanol. Isso esterilizará o espalhador.
3. Segure o espalhador acima da primeira placa até que a chama seja apagada. Abra a placa rapidamente, segurando a tampa por perto. Toque o espalhador para o ágar longe do áculo (Inoculum = células usadas para começar uma cultura) para esfriar, e depois espalhe a gota de inóculo ao redor da superfície do ágar até que traços de líquido livre desapareçam. Substitua a tampa da placa.
4. Re-flame o espalhador e repita o processo com a próxima placa, trabalhando rapidamente para não contaminar o ágar com organismos aéreos
5. Incubar as placas de bactérias à temperatura ambiente por 1 semana. Certifique-se de que as placas estão invertidas durante a incubação para evitar que gotas de umidade de condensação caiam sobre a superfície do ágar.

3. Fabricação de placas de difusão para Actinomycetes

1. Para cultivar actinomycetes, pegue três placas de glicerol pré-preparadas e rotule-as como B, C e D. Utilizando as técnicas mostradas anteriormente, espalhe placa de 0,1 mL das suspensões B, C e D. As diluições mais baixas são utilizadas porque os actinomycetes estão tipicamente presentes como 1/10 da população bacteriana (B = 10^-2, C = 10^-3, D = 10^-4).
2. Incubar as placas de actinomycete (invertidas) à temperatura ambiente por 2 semanas.

4. Contagem de bactérias e actinomycetos

1. Após a incubação, examine cuidadosamente todas as placas de bactérias e note diferenças no tamanho e forma da colônia. Quando cultivadas em ágar, as bactérias produzem colônias viscosas que vão de incolor a laranja brilhante, amarelo ou rosa. Em contraste, as colônias de actinomycete são calcéticas, firmes, de couro, e quebrarão sob pressão, onde outras colônias bacterianas irão manchar. Isso permite que as colônias sejam distinguidas pelo contato com um laço estéril.
2. Conte e regise o número de colônias bacterianas, incluindo quaisquer actinomycetes. Só conte placas com 30-200 colônias por placa.

5. Isolamento de Culturas Puras

1. Selecione colônias bacterianas individuais de qualquer uma das placas. Mais colônias podem ser selecionadas se houver interesse particular no solo. Use uma placa de diluição alta, pois tende a ter colônias puras que são bem separadas. Escolha apenas colônias bem separadas das colônias vizinhas e pareça morfologicamente distintas umas das outras.
2. Esterilize o laço mergulhando-o em álcool e flamejando-o. Abra rapidamente a placa de Petri de interesse, e toque o laço em um ponto nu no ágar para esfriá-lo. Em seguida, remova uma pequena quantidade de uma colônia de interesse no loop.
3. Tomando uma placa de levedura de peptone fresco, faça uma raia de alguns centímetros de comprimento de um lado. Esterilizar e esfriar novamente, depois faça uma raia que cruza a raia inicial apenas na primeira passagem. Repita este processo mais duas vezes da mesma maneira. Essa "diluição" de streaking resulta em células no loop sendo separadas umas das outras. Coloque a placa em uma área escura para incubar em temperatura ambiente por duas semanas.

Determinar uma contagem precisa de bactérias ambientais é fundamental para avaliar a saúde de um ecossistema do solo. Isso pode ser feito cultivando colônias bacterianas com diluições apropriadas.

As bactérias do solo são uma parte importante de um ecossistema de solo saudável, desempenhando papéis na decomposição, fixação de nitrogênio e ciclagem de nutrientes. Os solos superficiais são um substrato de partículas orgânicas e inorgânicas formando uma matriz complexa ao redor dos poros que se enchem de ar ou água. Essas condições criam um ecossistema ideal para bactérias, com solos superficiais normalmente contendo mais de um milhão de bactérias por grama.

Devido a essa alta concentração de bactérias, a diluição é necessária antes de se plaquear no meio de crescimento. As diluições em série podem reduzir a concentração da amostra de solo original a níveis baixos o suficiente para que colônias únicas sejam cultivadas em placas de mídia, permitindo o cálculo das contagens iniciais de bactérias na amostra de solo.

Este vídeo ilustrará como preparar diluições em série de amostras de solo, como plaquear essas amostras bacterianas e como calcular a contagem bacteriana do solo a partir das placas de diluição.

As bactérias são organismos procarióticos simples, mas altamente diversos em termos de espécies e ecossistemas. Os actinomicetos são um subconjunto de bactérias que são frequentemente consideradas um grupo único devido à sua estrutura filamentosa, onde crescem amarradas para formar hifas.

Normalmente, os actinomicetos representam 10% da população bacteriana total no solo. Bactérias e actinomicetos são abundantes em quase todos os ambientes da Terra, mas são encontrados em diversidade e abundância incomparáveis no solo.

As bactérias do solo são enumeradas e potencialmente cultivadas e identificadas por diluição. Aqui, uma amostra de solo é diluída em série em água e, em seguida, dispersa em placas de crescimento de ágar. As colônias resultantes são então contadas. Este valor, juntamente com o fator de diluição, é usado para elucidar a concentração inicial de bactérias no solo.

O revestimento de diluição é um método comum, barato e simples para enumeração bacteriana, mas sofre de várias desvantagens. O solo não deve assentar durante as diluições, o que pode levar a um crescimento tendencioso. Algumas bactérias do solo não cultivam nas placas ou crescem muito devagar para serem observadas. Além disso, este método pressupõe que as colônias são formadas a partir de uma única bactéria, mas podem surgir de aglomerados de várias células.

Certas espécies bacterianas crescem melhor em diferentes meios de crescimento. Um substrato comum para cultivar uma ampla gama de bactérias é uma placa de levedura ágar-peptona. Os actinomicetos crescem preferencialmente em placas à base de glicerol-caseína, que se adaptam melhor ao crescimento dessas bactérias filamentosas.

Agora que você entende o conceito por trás da enumeração bacteriana, vamos ver como esse processo é realizado em laboratório.

Para iniciar o procedimento, pesar 10 g de amostra de solo e adicionar 95 mL de água deionizada. Agite bem a suspensão e rotule como "A". Antes que o solo assente, remova 1 mL da suspensão com uma pipeta estéril e transfira-a para 9 mL de água deionizada. Vórtice completamente e rotule como "B".

Repita esta etapa de diluição 3 vezes, cada vez com 1 mL da suspensão anterior e 9 mL de água deionizada. Rotule-os sequencialmente como tubos C, D e E. Isso resulta em diluições seriadas de 10-1 a 10-5 gramas de solo por mL.

Para cultivar colônias bacterianas, pegue 3 placas de ágar peptona-levedura pré-preparadas e rotule-as como C, D e E. Vortex as amostras correspondentes e pipete 0,1 mL em cada placa. Como as UFC são relatadas por mL, o uso de 0,1 mL aumenta ainda mais a diluição por um fator de dez.

Em seguida, mergulhe um espalhador de vidro em etanol. Coloque o espalhador em uma chama por alguns segundos para acender e queimar o etanol. Isso esterilizará o espalhador.

Segure o espalhador acima da primeira placa até que a chama se apague. Abra o prato rapidamente, segurando a tampa por perto. Toque o espalhador no ágar longe do inóculo para esfriar e, em seguida, espalhe a gota de inóculo pela superfície até que os vestígios de líquido livre desapareçam. Recoloque a tampa da placa.

Volte a inflamar o espalhador e repita o processo com a próxima placa, trabalhando rapidamente para não contaminar a placa com organismos transportados pelo ar. Inverta as placas para evitar que gotas de umidade caiam no ágar e incube as placas em temperatura ambiente por uma semana.

Para cultivar actinomicetos, pegue três placas de glicerol-caseína pré-preparadas e rotule-as como B, C e D. Usando as técnicas mostradas anteriormente, espalhe a placa 0,1 mL das suspensões B, C e D. As diluições mais baixas são usadas porque os actinomicetos estão tipicamente presentes como 1/10 da população bacteriana.

Por fim, inverta essas placas e guarde em temperatura ambiente por duas semanas.

Após a incubação, examine cuidadosamente todas as placas bacterianas e observe as diferenças no tamanho e na forma da colônia. Quando cultivadas em ágar, as bactérias produzem colônias viscosas que variam de incolores a laranja brilhante, amarelo ou rosa. Em contraste, as colônias de actinomicetos são calcárias, firmes, coriáceas e quebram sob pressão, onde outras colônias bacterianas se espalham. Isso permite que as colônias sejam distinguidas pelo toque com uma alça estéril.

Conte e registre o número de colônias bacterianas, incluindo quaisquer actinomicetos. Conte apenas placas com 30-200 colônias por placa.

Para cultivar culturas de bactérias individuais específicas, selecione colônias discretas de qualquer uma das placas, escolhendo colônias bem separadas das colônias vizinhas. Esterilize um laço de espalhamento, abra a placa e toque o laço em um local vazio para esfriar. Em seguida, escolha uma pequena quantidade da colônia de interesse no loop.

Pegando um prato de fermento de peptona fresco, faça uma faixa de alguns centímetros de comprimento de um lado. Esterilize e esfrie novamente, depois faça uma faixa que cruze a faixa inicial apenas na primeira passagem. Repita esse processo mais duas vezes da mesma maneira. Essa "diluição" de listras resulta na separação das células no loop. Coloque a placa em uma área escura para incubar em temperatura ambiente por duas semanas.

A partir das contagens de colônias bacterianas e de actinomicetos, as Unidades Formadoras de Colônias por grama de solo podem ser determinadas. O número de colónias por grama de solo é igual ao número de colónias contadas na placa, multiplicado pelo recíproco da diluição em placa. Por exemplo, se 46 colônias são contadas em uma placa de diluição de 10-5 com um inoculante de 0,1 mL, então a UFC por grama de solo é igual a 10-6 por 46, ou 46 milhões de UFC por grama de solo.

A realização de contagens e culturas bacterianas é um primeiro passo fundamental em muitas investigações ou protocolos científicos.

O solo saudável contém entre 106 e 108 bactérias por grama. A enumeração bacteriana do solo pode ser usada para determinar a saúde dos solos de interesse, e contagens inferiores a 106 e 108 bactérias por grama indicam solo insalubre ou pobre. Isso pode ser causado por falta de nutrientes ou matéria orgânica, estresse abiótico devido ao pH extremo do solo ou contaminação do solo.

Muitos tipos de antibióticos usados na medicina hoje foram identificados pela primeira vez a partir de bactérias ou fungos que vivem no solo. Isolar cepas puras de culturas de solo pode ajudar a identificar novos compostos antibióticos. Aqui, bactérias de teste ou compostos isolados de interesse podem ser adicionados a placas cultivadas com gramados bacterianos e seus efeitos no crescimento do gramado registrados. Manchas claras em gramados bacterianos onde o crescimento foi inibido pela bactéria ou composto de teste podem indicar atividade antibiótica.

As leguminosas, incluindo ervilhas e feijões, dependem de relações simbióticas com bactérias fixadoras de nitrogênio. Essas bactérias vivem livremente no solo ou dentro de nódulos no sistema radicular e produzem compostos de nitrogênio que são utilizados pela planta. Em solos pobres, a suplementação de leguminosas com bactérias fixadoras de nitrogênio cultivadas dos solos pode aumentar o crescimento e a saúde das plantas. Isso pode resultar em plantas maiores e mais resistentes, o que, por sua vez, proporciona maior rendimento das colheitas.

Você acabou de assistir à introdução de JoVE à enumeração bacteriana. Agora você deve entender como realizar diluições de amostras de solo, como plaquear para contagem de colônias e isolamento de colônias e como calcular o número de bactérias em amostras de solo. Obrigado por assistir!