2.15: Contagem de Algas em Métodos de Cultura

1. Pese uma amostra de 10 g de solo que foi coletada úmida do campo, ou teve água adicionada a ele para que permaneça úmida por 2-3 dias. Note que o solo deve ser úmido, mas não saturado.
2. Prepare uma série de diluição de 10 vezes adicionando os 10 g de solo em 95 mL de Solução modificada de Bristol(Figura 1). Para criar a Solução modificada de Bristol, dissolva o seguinte em 1.000 mL de água: 0,25 g NaNO₃, 0,025 g CaCl₂, 0,075 g MgSO^-₄ · 7H₂O, 0,075 g K₂HPO₄, 0,018 g KH₂PO₄, 0,025 g NaCl e 0,5 mg FeCl_3.
3. Continue a série de diluição com a adição de 1 mL de suspensão A a 9 mL da Solução de Bristol e diluições sequenciais adicionais.
4. Inoculato 5 tubos de réplica cada um contendo 9 mL de Solução modificada de Bristol com 1 mL cada uma das diluições 10^-2 a 10^-6 (Tabela 1).
5. Incubar os tubos tampados por até 4 semanas em uma área exposta à luz solar.
6. Observe os tubos para o crescimento de algas uma vez a cada 7 dias. Tubos com crescimento de algas parecem verdes.

Figura 1. Como fazer uma série de diluição de 10 vezes.

Mesa 1. Tubos e diluições.

As algas são organismos fotossintéticos que vivem em uma variedade de ambientes. As algas que habitam o solo podem ser cultivadas em laboratório e sua concentração enumerada usando cálculos simples.

As algas são um grupo altamente heterogêneo de organismos que possuem uma característica comum, ou seja, a posse de pigmentos fotossintéticos, geralmente clorofila. A grande maioria das algas é microscópica, no entanto, a definição exata do grupo é controversa e também inclui algas marinhas, que são tipicamente macroscópicas.

No meio ambiente, as algas podem causar problemas em águas superficiais, como lagos ou reservatórios, formando florações de algas que esgotam os nutrientes da água, bloqueando a passagem da luz além da superfície da água e liberando toxinas. A capacidade de enumerar algas em amostras permite que os cientistas avaliem a saúde de um ecossistema e o risco potencial de crescimento excessivo de algas.

As populações de algas nos solos ocorrem frequentemente em torno de dez mil células por grama. Esses números são tipicamente mais baixos do que as concentrações correspondentes de bactérias, fungos ou actinomicetos, pois as algas requerem luz solar para a fotossíntese, que não pode penetrar muito abaixo da superfície do solo.

Este vídeo ilustrará como cultivar algas do solo em laboratório e como enumerar a concentração de algas na amostra inicial do solo.

As algas têm efeitos benéficos nos ecossistemas. As algas verde-azuladas, ou cianobactérias, têm a capacidade de fixar o gás nitrogênio da atmosfera, tornando-as úteis no aumento do nitrogênio do solo em ambientes semiáridos e também como uma ferramenta potencial para a produção de biocombustíveis.

Outras algas são eucarióticas e variam de organismos unicelulares a organismos multicelulares complexos, como algas marinhas. Estes incluem algas verdes, euglenoides, dinoflagelados e diatomáceas, algas marrons e algas vermelhas.

As algas são fototróficas, obtendo energia da fotossíntese e carbono para biomassa a partir do dióxido de carbono. Como resultado, eles podem ser cultivados em meios que consistem inteiramente de nutrientes inorgânicos, sem adição de substrato de carbono orgânico. Essa falta de substrato orgânico impede o crescimento de bactérias heterotróficas, que dependem do carbono orgânico externo para crescer.

Para cultivar algas para enumeração, as amostras de solo são diluídas em série dez vezes a 10-6 g de solo por mL e cultivadas em meio de crescimento. Fazem-se várias réplicas para cada diluição. Eles são então incubados em uma área bem iluminada por até 4 semanas para permitir o crescimento de algas.

A presença de algas em qualquer diluição é determinada por um sinal positivo de crescimento no meio, que normalmente aparece como um lodo verde. Finalmente, tabelas MPN desenvolvidas empiricamente projetadas para o crescimento de algas são consultadas, permitindo ao usuário determinar a concentração original de algas com base no crescimento em replicados de diluição. O método MPN baseia-se na diluição em série de amostras de modo que as algas sejam diluídas até a extinção, o que significa que, em alguma diluição, não ocorre crescimento de algas.

Agora que estamos familiarizados com os conceitos por trás do cultivo e enumeração de algas a partir de amostras, vamos dar uma olhada em como isso é realizado em laboratório.

Para iniciar o experimento, primeiro pese 10 gramas de solo úmido que foi coletado úmido do campo ou foi reidratado e permaneceu úmido por 2 a 3 dias. O solo deve, mas não saturado.

Em seguida, prepare uma série de diluição de dez vezes adicionando os 10 gramas de solo primeiro a 95 mL de solução de Bristol modificada, ou MBS. Rotular como suspensão A.

Depois de agitar vigorosamente, continuar a série de diluições adicionando 1 ml de suspensão A a 9 ml de MBS num tubo de ensaio. Continue esta série de diluição de dez vezes mais 4 vezes para obter diluições de até 10-6 g por mL.

Em seguida, inocule 5 tubos replicados, cada um contendo 9 mL de MBS com 1 mL de cada uma das diluições 10-1 a 10-5. Isso resulta em 5 tubos de réplicas para cada diluição de 10-2 a 10-6. Tampe os tubos frouxamente.

Finalmente, incube os tubos por 4 semanas completas em uma área exposta à luz solar. Observe os tubos para o crescimento de algas uma vez a cada 7 dias. Os tubos que exibem crescimento de algas aparecerão verdes.

A análise do Número Mais Provável, ou MPN, é um método matemático comumente usado para enumerar microrganismos cultivados a partir da diluição de um substrato inicial concentrado. Levando-se em consideração os fatores de diluição das soluções e o número de tubos que mostram sinais positivos de crescimento em cada diluição, o número mais provável de organismos por grama de amostra original de solo pode ser calculado usando uma tabela MPN e uma fórmula simples.

Para calcular o NMP, atribui-se à diluição mais elevada com o maior número de tubos replicados positivos o rótulo de p1, neste caso, os replicados do tubo C. Em contraste, alguns dos tubos de D & E são negativos, sem sinais de crescimento de algas.

O número de tubos nas próximas duas diluições mais altas que mostram crescimento positivo é rotulado como p2 e p3. Aqui, p2 = D e p3 = E.

O valor de p1 pode ser encontrado examinando a primeira coluna na tabela MPN. O mesmo deve ser feito com a coluna p2. Finalmente, o valor de p3, na parte superior, é usado para cruzar os dois definidos por p1 e p2, para dar um valor do número mais provável de organismos por mL.

Em seguida, para calcular a concentração de organismos por grama na amostra original do solo, esse valor é dividido pela concentração do solo na diluição à qual p2 foi atribuído. A equação a seguir é usada para definir o número real de organismos por grama de solo.

A enumeração de algas e a análise de NMP têm uma ampla gama de aplicações, algumas das quais são exploradas aqui.

Este método de cultura de enumeração de algas pode ser usado em uma variedade de configurações. Pode ser aplicado em rios ou lagos para determinar os níveis de algas e avaliar os riscos de proliferação de algas nocivas. Alternativamente, pode ser usado para avaliar a limpeza e segurança das águas usadas mais diretamente pelos seres humanos, incluindo piscinas, bebedouros ou outras fontes de água potável. Idealmente, em amostras de água potável e piscinas, não há algas presentes.

A análise do NMP para enumeração também pode ser aplicada a outros microrganismos não algais. Por exemplo, a qualidade da água pode ser avaliada usando organismos indicadores, como coliformes ou E. coli. Aqui, as amostras podem ser cultivadas com meios contendo produtos químicos que são alterados para produzir cor ou fluorescência na presença dos organismos indicadores. Ao realizar várias pequenas réplicas deste experimento em células individuais, com amostras diluídas a uma concentração conhecida, a proporção de células positivas pode ser referenciada a uma tabela MPN para o organismo indicador específico e a concentração inicial nas amostras determinada.

As algas também podem ser cultivadas para aplicações comerciais. Por exemplo, alguns tipos de biofertilizante utilizam algas verde-azuladas, que podem atuar como simbiontes das plantas, auxiliando na fixação e absorção de nitrogênio, o que é particularmente útil para auxiliar no crescimento das culturas em áreas com solo pobre. Da mesma forma, as algas podem ser cultivadas para biocombustíveis ou como fonte de alimento rico em nutrientes para o gado.

Você acabou de assistir à introdução de JoVE à cultura e enumeração de algas. Agora você deve entender como diluir amostras de solo para crescimento de algas, como cultivar algas em laboratório e como enumerar a concentração de algas de suas amostras iniciais. Obrigado por assistir!