Contagem de Algas em Métodos de Cultura

Algae Enumeration via Culturable Methodology

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Environmental Microbiology

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Algae Enumeration via Culturable Methodology

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09:29 min

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February 23, 2015

Overview

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba – Universidade do Arizona
Autor de Demonstração: Bradley Schmitz

As algas são um grupo altamente heterogêneo de microrganismos que têm um traço comum, a posse de pigmentos fotossintéticos. No meio ambiente, as algas podem causar problemas para os donos de piscinas, crescendo na água. As algas também podem causar problemas em águas superficiais, como lagos e reservatórios, devido às flores algas que liberam toxinas. Mais recentemente, as algas estão sendo avaliadas como novas fontes de energia através de biocombustíveis de algas. Algas verde-azulas são na verdade bactérias classificadas como cianobactérias. As cianobactérias não só fotossintthesizem, mas também têm a capacidade de fixar gás nitrogênio da atmosfera. Outras algas são eucarióticas, que vão desde organismos unicelulares até organismos multicelulares complexos, como algas marinhas. Estes incluem as algas verdes, os euglenóides, os dinoflagellates, as algas marrons douradas, diatomas, as algas marrons, e as algas vermelhas. Em solos, as populações de algas são frequentemente 10⁶ por grama. Esses números são inferiores aos números correspondentes de bactérias, actinomycetes e fungos, principalmente porque a luz solar necessária para a fotossíntese não pode penetrar muito abaixo da superfície do solo.

Como as algas são fototróficas, obtendo energia da fotossíntese e carbono para biomassa de dióxido de carbono, elas podem ser cultivadas em meios de crescimento que consistem inteiramente em nutrientes inorgânicos e sem um substrato de carbono orgânico. A falta de substrato orgânico impede o crescimento de bactérias heterotróficas. Utilizando um meio de crescimento inorgânico, as algas originalmente presentes no solo ou na água podem ser quantificadas pelo método de número mais provável (MPN). O método MPN baseia-se em diluir sucessivamente uma amostra, de modo que as próprias algas sejam diluídas à extinção. A presença de algas em qualquer diluição é determinada por um sinal positivo de crescimento no meio, que é tipicamente um lodo verde de algas que resulta da fotossíntese. O uso de tubos de replicação em cada diluição e uma avaliação estatística do número de tubos positivos para o crescimento em qualquer diluição permite que o número de algas presentes na amostra original seja calculado. As tabelas mpn foram desenvolvidas e publicadas específicas para um determinado desenho de MPN, incluindo o número de réplicas utilizadas em cada diluição.

Procedure

Pese uma amostra de 10 g de solo que foi coletada úmida do campo, ou teve água adicionada a ele para que permaneça úmida por 2-3 dias. Note que o solo deve ser úmido, mas não saturado.
Prepare uma série de diluição de 10 vezes adicionando os 10 g de solo em 95 mL de Solução modificada de Bristol(Figura 1). Para criar a Solução modificada de Bristol, dissolva o seguinte em 1.000 mL de água: 0,25 g NaNO₃, 0,025 g CaCl₂, 0,075 g MgSO^–₄ · 7H₂O, 0,075 g K₂HPO₄, 0,018 g KH₂PO₄, 0,025 g NaCl e 0,5 mg FeCl_3.
Continue a série de diluição com a adição de 1 mL de suspensão A a 9 mL da Solução de Bristol e diluições sequenciais adicionais.
Inoculato 5 tubos de réplica cada um contendo 9 mL de Solução modificada de Bristol com 1 mL cada uma das diluições 10^-2 a 10^-6(Tabela 1).
Incubar os tubos tampados por até 4 semanas em uma área exposta à luz solar.
Observe os tubos para o crescimento de algas uma vez a cada 7 dias. Tubos com crescimento de algas parecem verdes.

Figura 1. Como fazer uma série de diluição de 10 vezes.

Tubo	Diluição
B	10^-2
C	10^-3
D	10^-4
E	10^-5
F	10^-6

Mesa 1. Tubos e diluições.

Algas são organismos fotossintéticos que vivem em vários ambientes. Algas que habitam o solo podem ser cultivadas em laboratório, e sua concentração enumerada usando cálculos simples.

As algas são um grupo altamente heterogêneo de organismos que têm um traço comum, ou seja, a posse de pigmentos fotossintéticos, comumente clorofila. A grande maioria das algas são microscópicas, no entanto, a definição exata do grupo é controversa, e também inclui algas marinhas, que são tipicamente macroscópicas.

No ambiente, as algas podem causar problemas em águas superficiais, como lagos ou reservatórios, formando flores algas que esgotam os nutrientes da água, bloqueando a passagem da luz além da superfície da água e liberando toxinas. A capacidade de enumerar algas em amostras permite que os cientistas avaliem a saúde de um ecossistema e o risco potencial de crescimento excessivo de algas.

Populações de algas em solos ocorrem frequentemente em cerca de dez mil células por grama. Esses números são tipicamente inferiores às concentrações correspondentes de bactérias, fungos ou actinomictos, pois as algas requerem luz solar para fotossíntese, que não podem penetrar muito abaixo da superfície do solo.

Este vídeo ilustrará como cultivar algas do solo em laboratório, e como enumerar a concentração de algas na amostra inicial do solo.

As algas têm efeitos benéficos nos ecossistemas. Algas azul-esverdedas, ou cianobactérias, têm a capacidade de fixar gás nitrogênio da atmosfera, tornando-as úteis no aumento do nitrogênio do solo em ambientes semiáridos e também como uma ferramenta potencial para a produção de biocombustíveis.

Outras algas são eucarióticas, e variam de monocelulares únicos a organismos multicelulares complexos, como algas marinhas. Estes incluem algas verdes, euglenóides, dinoflagellates e diatomas, algas marrons e algas vermelhas.

As algas são fototróficas, obtendo energia da fotossíntese e carbono para biomassa de dióxido de carbono. Como resultado, eles podem ser cultivados em mídia composta inteiramente de nutrientes inorgânicos, sem um substrato de carbono orgânico adicionado. Essa falta de substrato orgânico impede o crescimento de bactérias heterotróficas, que dependem de carbono orgânico externo para o crescimento.

Para cultivar algas para enumeração, as amostras de solo são diluídas em série dez vezes a 10^-6 g de solo por mL, e cultivadas em meios de crescimento. Várias réplicas são feitas para cada diluição. Eles são então incubados em uma área bem iluminada por até 4 semanas para permitir o crescimento de algas.

A presença de algas em qualquer diluição é determinada por um sinal positivo de crescimento no meio, que normalmente aparecerá como um lodo verde. Finalmente, são consultadas tabelas mpn desenvolvidas empiricamente projetadas para o crescimento de algas, permitindo que o usuário determine a concentração de algas original com base no crescimento das réplicas de diluição. O método MPN baseia-se na diluição serial de amostras de modo que as algas são diluídas à extinção, o que significa que, em alguma diluição, não se segue o crescimento de algas.

Agora que estamos familiarizados com os conceitos por trás do cultivo e enumeração de algas a partir de amostras, vamos dar uma olhada em como isso é realizado em laboratório.

Para começar o experimento, primeiro peso fora 10 gramas de solo úmido que foi coletado úmido do campo, ou foi reidratado e permaneceu úmido por 2 a 3 dias. O solo deve, mas não saturado.

Em seguida, prepare uma série de diluição dez vezes adicionando os 10 gramas de solo primeiro a 95 mL da solução modificada de Bristol, ou MBS. Rotule isso como suspensão A.

Depois de tremer vigorosamente, continue a série de diluição adicionando 1 mL de suspensão A a 9 mL de MBS em um tubo de ensaio. Continue esta série de diluição de dez vezes mais 4 vezes para dar diluições de até 10^-6 g por mL.

Em seguida, inocular 5 tubos de réplica, cada um contendo 9 mL de MBS com 1 mL de cada uma das diluições 10^-1 a 10^-5. Isso resulta em 5 tubos de réplica para cada diluição de 10^-2 a 10^-6. Tampe os tubos livremente.

Finalmente, incubar os tubos por 4 semanas em uma área exposta à luz solar. Observe os tubos para o crescimento de algas uma vez a cada 7 dias. Tubos que exibem crescimento de algas aparecerão verdes.

O número mais provável, ou MPN, é um método matemático comumente usado para enumerar microrganismos cultivados a partir da diluição de um substrato inicial concentrado. Levando em conta os fatores de diluição das soluções, e o número de tubos que mostram sinais positivos de crescimento a cada diluição, o número mais provável de organismos por grama de amostra original do solo pode ser calculado utilizando uma tabela MPN e fórmula simples.

Para calcular o MPN, a maior diluição com maior número de tubos de replicação positiva é atribuída ao rótulo de p1, neste caso, as réplicas do tubo C. Em contraste, alguns dos tubos da D & E são negativos sem sinais de crescimento de algas.

O número de tubos nas próximas duas diluições maiores que mostram crescimento positivo são rotulados como p2 e p3. Aqui, p2 = D e p3 = E.

O valor para p₁ pode ser encontrado olhando para baixo a primeira coluna na tabela MPN. O mesmo deve ser feito com a coluna p_2. Por fim, o valor da p₃, através do topo, é usado para cruzar os dois definidos por p₁ e p₂, para dar um valor do número mais provável de organismos por mL.

Em seguida, para calcular a concentração de organismos por grama na amostra original do solo, esse valor é dividido pela concentração do solo na diluição à qual p₂ foi atribuído. A equação a seguir é usada para definir o número real de organismos por grama de solo.

A enumeração de algas e análises de MPN têm uma ampla gama de aplicações, algumas das quais são exploradas aqui.

Este método de cultivo de enumeração de algas pode ser usado em uma variedade de configurações. Pode ser aplicado a rios ou lagos para determinar os níveis de algas e avaliar os riscos de flores algas nocivas. Alternativamente, pode ser usado para avaliar a limpeza e a segurança das águas mais diretamente utilizadas pelos seres humanos, incluindo piscinas, bebedouros ou outras fontes de água potável. Idealmente, em amostras de água potável e piscinas, não há algas presentes.

A análise do MPN para enumeração também pode ser aplicada a outros microrganismos não algas. Por exemplo, a qualidade da água pode ser avaliada utilizando organismos indicadores como coliformes ou E. coli. Aqui, as amostras podem ser cultivadas com meios que contenham produtos químicos que são alterados para produzir cor ou fluorescência na presença dos organismos indicadores. Ao realizar múltiplas pequenas réplicas deste experimento em células individuais, com amostras diluídas para uma concentração conhecida, a razão de células positivas pode ser referenciada a uma tabela de MPN para o organismo indicador específico, e a concentração inicial nas amostras determinadas.

As algas também podem ser cultivadas para aplicações comerciais. Por exemplo, alguns tipos de biofertilizantes utilizam algas azul-esverdedas, que podem atuar como simmbiontos com plantas, auxiliando sua fixação e absorção de nitrogênio, o que é particularmente útil para ajudar o crescimento das culturas em áreas com solo pobre. Da mesma forma, as algas podem ser cultivadas para biocombustíveis, ou como fonte de alimentos ricos em nutrientes para a pecuária.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à cultura e enumeração de algas. Agora você deve entender como diluir amostras de solo para o crescimento de algas, como cultivar algas em laboratório e como enumerar a concentração de algas de suas amostras iniciais. Obrigado por assistir!

Results

A Figura 2 é um exemplo de resultados representativos.

p₁ é escolhido para ser o número de tubos de replicação da maior diluição (menos concentrada no solo) que tem o maior número de tubos positivos. Aqui, as réplicas do tubo B não contam, pois as do tubo C são de uma diluição maior. Em contraste, o número de tubos do Tubo D que mostram um sinal positivo de crescimento é menor do que os do Tubo C. Então, p₁ = 5.

p₂ e p₃ são escolhidos para ser o número de tubos nas próximas duas diluições maiores que mostram um sinal positivo de crescimento. Assim, p₂ = 3 e p₃ = 1.

O valor para p₁ pode ser encontrado olhando para baixo a primeira coluna na Tabela 2. O mesmo é feito na coluna p_2. Em seguida, o valor de p₃ (através da parte superior) cruza os dois definidos pelos valores de p₁ e p₂. Neste exemplo, o valor é de 1,1 organismos por mL.

Divida esse valor pela concentração de solo na diluição a que você atribuiu p₂. Neste exemplo, este é o Tubo D.

Assim, neste exemplo, havia 1,1 x 10⁴ algas por g de solo. Este valor é bastante típico do número de algas encontradas no solo.

Figura 2. Resultado hipotético de um experimento de enumeração de algas. Tubos sombreados indicam a presença de algas. Tubos não sombreados representam a ausência de algas.

		Número mais provável para valores indicados de p₃
p1	p2	0	1	2	3	4	5
0 0 0 0 0 0	0 1 2 3 4 5	— 0.018 0.037 0.056 0.075 0.094	0.018 0.036 0.055 0.074 0.094 0.11	0.036 0.055 0.074 0.093 0.11 0.13	0.054 0.073 0.092 0.11 0.13 0.15	0.072 0.091 0.11 0.13 0.15 0.17	0.090 0.11 0.13 0.15 0.17 0.19
1 1 1 1 1 1	0 1 2 3 4 5	0.020 0.040 0.061 0.083 0.11 0.13	0.040 0.061 0.082 0.1 0.13 0.16	0.060 0.081 0.10 0.13 0.15 0.17	0.080 0.10 0.12 0.15 0.17 0.19	0.10 0.12 0.15 0.17 0.19 0.22	0.12 0.14 0.17 0.19 0.22 0.24
2 2 2 2 2 2	0 1 2 3 4 5	0.045 0.068 0.093 0.12 0.15 0.17	0.068 0.092 0.12 0.14 0.17 0.20	0.091 0.12 0.14 0.17 0.20 0.23	0.12 0.14 0.17 0.20 0.23 0.26	0.14 0.17 0.19 0.22 0.25 0.29	0.16 0.19 0.22 0.25 0.28 0.32
3 3 3 3 3 3	0 1 2 3 4 5	0.078 0.11 0.14 0.17 0.21 0.25	0.11 0.14 0.17 0.21 0.24 0.29	0.13 0.17 0.20 0.24 0.28 0.32	0.16 0.20 0.24 0.28 0.32 0.37	0.20 0.23 0.27 0.31 0.36 0.41	0.23 0.27 0.31 0.35 0.40 0.45
4 4 4 4 4 4	0 1 2 3 4 5	0.13 0.17 0.22 0.34 0.41	0.17 0.21 0.26 0.33 0.40 0.48	0.21 0.26 0.32 0.39 0.47 0.56	0.25 0.31 0.38 0.45 0.54 0.64	0.30 0.36 0.44 0.52 0.62 0.72	0.36 0.42 0.5 0.59 0.69 0.81
5 5 5 5 5 5	0 1 2 3 4 5	0.23 0.33 0.49 0.79 1.3 2.4	0.31 0.46 0.7 1.1 1.7 3.5	0.43 0.64 0.95 1.4 2.2 5.4	0.58 0.84 1.2 1.8 2.8 9.2	0.76 1.1 1.5 2.1 3.5 16	0.95 1.3 1.8 2.5 4.3 —

Mesa 2. Números mais prováveis para uso com o design experimental neste exercício.

Applications and Summary

A metodologia do MPN é útil, pois permite a estimativa de uma população funcional com base em uma atribuição relacionada ao processo. No exemplo, o processo funcional foi a fotossíntese empreendida por algas, o que permitiu o crescimento na ausência de carbono orgânico. Isso permitiu que as populações totais de algas no solo fossem enumeradas.

A MPN também é usada para estimar o número de um tipo específico de patógenos microbianos na água, como Salmonella,utilizando a resistência de Salmonella ao verde malachite.

Outra aplicação é a estimativa de fungos micorrizais inoculando diluições do solo em um hospedeiro de plantas e procurando a colonização das raízes pelos fungos.

Transcript

Algae are photosynthetic organisms that live in a variety of environments. Soil dwelling algae can be cultured in the laboratory, and their concentration enumerated using simple calculations.

Algae are a highly heterogeneous group of organisms that have one common trait, namely the possession of photosynthetic pigments, commonly chlorophyll. The vast majority of algae are microscopic, however, the exact definition of the group is controversial, and also includes seaweeds, which are typically macroscopic.

In the environment, algae can cause problems in surface waters such as lakes or reservoirs, forming algal blooms that deplete the water nutrients, blocking light passing beyond the water surface, and releasing toxins. The ability to enumerate algae in samples allows scientists to evaluate the health of an ecosystem, and the potential risk of algal overgrowth.

Algal populations in soils frequently occur at around ten thousand cells per gram. These numbers are typically lower than corresponding concentrations of bacteria, fungi, or actinomycetes, as algae require sunlight for photosynthesis, which cannot penetrate far below the soil surface.

This video will illustrate how to culture algae from soil in the laboratory, and how to enumerate the concentration of algae in the starting soil sample.

Algae have beneficial effects on ecosystems. Blue-green algae, or cyanobacteria, have the ability to fix nitrogen gas from the atmosphere, making them useful in increasing soil nitrogen in semi-arid environments and also as a potential tool for biofuel production.

Other algae are eukaryotic, and range from single-celled to complex multicellular organisms, like seaweeds. These include green algae, euglenoids, dinoflagellates and diatoms, brown algae, and red algae.

Algae are phototrophic, obtaining energy from photosynthesis and carbon for biomass from carbon dioxide. As a result, they can be grown in media consisting entirely of inorganic nutrients, without an added organic carbon substrate. This lack of organic substrate prevents the growth of heterotrophic bacteria, which are dependent on external organic carbon for growth.

To culture algae for enumeration, soil samples are serially diluted tenfold to 10-6 g soil per mL, and cultured in growth media. Several replicates are made for each dilution. They are then incubated in a well-lit area for up to 4 weeks to allow algal growth.

The presence of algae in any dilution is determined by a positive sign of growth in the medium, which will typically appear as a green slime. Finally, empirically developed MPN tables designed for algal growth are consulted, enabling the user to determine the original algal concentration based on growth in dilution replicates. The MPN method relies on the serial dilution of samples such that the algae are diluted to extinction, meaning that at some dilution, no algal growth ensues.

Now that we are familiar with the concepts behind growing and enumerating algae from samples, let’s take a look at how this is carried out in the laboratory.

To begin the experiment, first weight out 10 grams of moist soil that has either been collected moist from the field, or been rehydrated and remained moist for 2 to 3 days. The soil should but not saturated.

Next, prepare a ten-fold dilution series by adding the 10 grams of soil first to 95 mL of Modified Bristol’s solution, or MBS. Label this as suspension A.

After shaking vigorously, continue the dilution series by adding 1 mL of suspension A to 9 mL of MBS in a test tube. Continue this ten-fold dilution series another 4 times to give dilutions up to 10-6 g per mL.

Next, inoculate 5 replicate tubes, each containing 9 mL of MBS with 1 mL of each of the dilutions 10-1 to 10-5. This results in 5 replicates tubes for each dilution from 10-2 to 10-6. Cap the tubes loosely.

Finally, incubate the tubes for a full 4 weeks in an area exposed to sunlight. Observe the tubes for algal growth once every 7 days. Tubes exhibiting algal growth will appear green.

Most Probable Number, or MPN, analysis is a commonly used mathematical method to enumerate microorganisms grown from dilution of a concentrated initial substrate. By taking into account the dilution factors of the solutions, and the number of tubes which show positive signs of growth at each dilution, the most probable number of organisms per gram of original soil sample can be calculated using an MPN table and simple formula.

To calculate MPN, the highest dilution with the highest number of positive replicate tubes is assigned the label of p1, in this case, the replicates of tube C. In contrast, some of the tubes from D & E are negative with no signs of algal growth.

The number of tubes in the next two higher dilutions that show positive growth are labeled as p2 and p3. Here, p2 = D and p3 = E.

The value for p1 can be found by looking down the first column in the MPN table. The same should be done with the p2 column. Finally, the value of p3, across the top, is used to intersect the two defined by p1 and p2, to give a value of the most probable number of organisms per mL.

Next, to calculate the concentration of organisms per gram in the original soil sample, this value is divided by the concentration of soil in the dilution to which p2 was assigned. The following equation is used to define the actual number of organisms per gram of soil.

Algal enumeration and MPN analysis have a wide range of applications, some of which are explored here.

This culturing method of algal enumeration can be used in a variety of settings. It can be applied to rivers or lakes to determine algal levels, and assess the risks of harmful algal blooms. Alternatively, it can be used to assess the cleanliness and safety of waters more directly used by humans, including swimming pools, water fountains, or other drinking water sources. Ideally, in potable water samples and swimming pools, there are no algae present.

The MPN analysis for enumeration can also be applied to other non-algal microorganisms. For example, water quality can be assessed using indicator organisms such as coliforms or E. coli. Here, samples can be cultured with media containing chemicals that are altered to produce color or fluorescence in the presence of the indicator organisms. By performing multiple small replicates of this experiment in individual cells, with samples diluted to a known concentration, the ratio of positive cells can be referenced to an MPN table for the specific indicator organism, and the starting concentration in the samples determined.

Algae may also be cultured for commercial applications. For example, some types of biofertilizer utilize blue-green algae, which can act as symbionts with plants, aiding their fixture and take-up of nitrogen, which is particularly useful in aiding crop growth in areas with poor soil. Similarly, algae can be grown for biofuels, or as a source of nutrient rich food for livestock.

You’ve just watched JoVE’s introduction to algal culture and enumeration. You should now understand how to dilute soil samples for algal growth, how to culture algae in the laboratory, and how to enumerate the algal concentration of your starting samples. Thanks for watching!

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Algae Enumeration Culturable Methodology Photosynthetic Organisms Laboratory Culture Concentration Calculation Photosynthetic Pigments Algal Blooms Surface Waters Algal Overgrowth Ecosystem Health Risk Assessment Soil Algae Population Sunlight Requirement Soil Surface Penetration Algae Culturing From Soil Algae Concentration Enumeration Beneficial Effects Of Algae