Detecção de Bacteriófagos em Amostras Ambientais

1. Obtenha uma amostra de esgoto ou água contendo colifago.
2. Diluir a amostra 1:10 e 1:100 usando tampão Tris. Faça isso transferindo 1,0 mL de cultura para 9 mL de buffer Tris, e depois fazendo uma segunda diluição de 10 vezes.
3. Derreta três tubos de ágar macio (0,7% de ágar nutriente ou ágar de soja de tripática por tubo de 3 mL) colocando-os em um banho de vapor ou autoclave.
4. Coloque o ágar em um banho de água a 45-48 °C por 15 minutos para permitir que a temperatura do ágar se ajuste a 45 °C.
5. Ao primeiro tubo, adicione 1 mL de uma cultura de caldo de fase de tronco de E. coli¹ e 1 mL de amostra não diluída.
6. Retire o tubo do banho de água e balance suavemente entre as mãos para misturar a suspensão por 2-3 s.
7. Limpe a água do tubo com uma toalha de papel e despeje o ágar sobre uma placa de Petri previamente preparada contendo ágar inferior (ágar de nutrientes regular ou ágar de soja de tripática).
8. Gire rapidamente a placa para espalhar o ágar superior. Certifique-se de que o ágar cubra toda a superfície.
9. Repita as etapas 5-8 com os outros dois tubos de ágar macio, utilizando 1 mL de bactérias e 1 mL de cada diluição amostral(Figura 2).
10. Depois que o ágar se solidificar, inverta as placas de Petri e incubar a 37 °C por 48 h. Tire qualquer umidade da tampa da placa de Petri. Se uma gota de umidade cair sobre uma placa, fará com que o vírus se espalhe pela superfície do ágar.
11. Após a incubação, conte o número de placas em cada diluição(Figura 3) e calcule a concentração de phage na amostra original. Regisso regissário de diferenças no tamanho ou aparência das placas.

Figura 2. Procedimento para a preparação de um gramado bacteriano utilizando ágar superior para enumeração colifa.

Figura 3. Placas de phage em um gramado bacteriano.

¹E. coli strain ATCC 15597 geralmente produzirá o maior número de placas a partir de amostras de esgoto. Deve ser cultivado durante a noite em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de nutrientes ou caldo de soja de trippticase e incubado em condições de agitação a 35 °C. 3 h antes do ensaio de phage inocular um mL desta cultura em um frasco fresco contendo 100 mL de nutrientes ou caldo de soja tripática e colocar em um banho de água tremendo a 35-37 °C. Isso garantirá que as bactérias estejam na fase de registro do crescimento.