Detecção de Bacteriófagos em Amostras Ambientais

Os vírus são partículas biológicas infecciosas responsáveis por muitas doenças, desde resfriados e gripes, até hepatites e HIV.

Os vírus são partículas biológicas que consistem em um genoma de DNA ou RNA, envolto em uma camada de proteína conhecida como capsídeo, às vezes com um envelope lipídico adicional. Os vírus não têm capacidade metabólica ou reprodutiva por conta própria e devem invadir células vivas e sequestrar sua maquinaria celular para fazer mais cópias de si mesmos.

Tanto as células procarióticas, como as bactérias, quanto as células eucarióticas, como as dos humanos, podem ser infectadas por classes específicas de vírus. Especificamente, bacteriófagos são vírus que infectam bactérias. Por exemplo, colifagos são aqueles fagos que infectam E. coli, uma bactéria intestinal comum, algumas cepas das quais podem causar intoxicação alimentar e que é uma indicação de contaminação fecal do abastecimento de água.

Embora os fagos em si não sejam geralmente conhecidos por serem patogênicos em humanos, há evidências de que eles são indicadores substitutos confiáveis para enterovírus causadores de doenças que também são transmitidos por fezes, mas difíceis de analisar. A disponibilidade de métodos relativamente rápidos e baratos para enumerar bacteriófagos os torna uma ferramenta atraente para a avaliação da contaminação fecal em amostras ambientais.

Este vídeo apresentará os princípios por trás da enumeração de fagos; demonstrar um protocolo para quantificar fagos, conhecido como ensaio de placa; e, finalmente, explorar várias aplicações da ciência ambiental para a detecção e contagem de fagos e outros vírus.

Os bacteriófagos, como todos os vírus, devem parasitar células vivas, neste caso bactérias, para se reproduzir.

Os fagos fazem isso pousando e se ligando à superfície da célula bacteriana e injetando seus materiais genéticos na célula. Uma vez dentro da célula, o genoma viral é replicado e os componentes proteicos do capsídeo viral são produzidos, ambos usando a maquinaria bioquímica da célula hospedeira. Uma vez que as partículas de fago são montadas, elas são liberadas da bactéria, muitas vezes lisando o hospedeiro e explodindo, matando a célula hospedeira no processo.

Um método amplamente utilizado para determinar a concentração de fagos em uma amostra aproveita essa atividade lítica. Nesta técnica, o fago da amostra é misturado com bactérias e ágar mole. Esta mistura é derramada em placas de Petri com ágar regular como substrato, e a camada superior forma uma sobreposição.

As bactérias estão em uma concentração tão alta que formam um gramado contínuo. A bactéria deve ser obtida a partir de cultura que está na fase logarítmica de crescimento, para garantir que todas as bactérias infectadas pelos fagos estejam vivas e permitam que o fago produza progênie.

Quando uma partícula de fago infecta e lisa uma bactéria, a progênie do fago se espalha para as células bacterianas próximas e continua a infecção. O ágar mole restringe a difusão das partículas do fago. Eventualmente, uma área de clareira, conhecida como placa, será formada.

Se o fago for diluído a uma concentração baixa o suficiente, placas individuais discretas podem ser observadas no gramado bacteriano. Estes podem ser contados e usados para calcular o número de unidades formadoras de placas, ou PFUs, de fago por mL da amostra original.

Agora que você entende como os fagos infectam bactérias e como essa atividade pode ser usada para medir a concentração de fagos, vamos passar por um protocolo para usar um ensaio de placa para enumerar fagos em amostras de água ambiental.

Um dia antes de realizar o ensaio, inocular uma colônia de E. coli cepa ATCC 15597 em 100 mL de caldo de soja tripticase em um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Incube-o com agitação a 35 ? C durante a noite.

3 h antes do ensaio, inocular 1 mL da cultura de E. coli durante a noite em 100 mL de caldo fresco. Coloque esta nova cultura em banho-maria agitado a uma temperatura entre 35 e 37 °C. Isso garante que as bactérias estejam na fase logarítmica de crescimento quando o ensaio começar.

Para iniciar o ensaio de placa, faça diluições seriadas de 10 e 100 vezes da amostra de água, usando 9 mL de tampão Tris.

Usando um banho de vapor, derreta três tubos de 5 mL de ágar soft top a 0,7%, soja tripticase ou ágar nutriente. Depois de derretido, coloque em banho-maria a 45 a 48 ? C por pelo menos 15 min para que a temperatura do ágar caia para 45 ?C.

Ao primeiro tubo de ágar mole, adicione 1 mL da cultura de E. coli em fase logarítmica previamente preparada e 1 mL da amostra de água não diluída. Remova o tubo do banho-maria e balance suavemente entre as mãos por 2-3 s para misturar a suspensão.

Despeje o ágar macio sobre uma placa de Petri previamente preparada com tripticase, soja ou ágar nutriente. Gire rapidamente a placa para espalhar, certificando-se de que ela cubra toda a superfície.

Repita a inoculação e o plaqueamento para os outros dois tubos, usando 1 mL de cada uma das amostras diluídas.

Assim que o ágar superior solidificar, inverta os pratos e incube-os a 37 ? C por 48 h.

Após a incubação, conte o número de pragas em cada placa. A partir da contagem, calcule a concentração de fagos na amostra original

Por exemplo, se 9 placas foram obtidas da placa de diluição de 10 vezes, então há 9 vezes 10 dividido por 1 mL, ou 90 PFUs/mL de colifago na amostra de água original.

Agora que você viu como os ensaios de placa de fago são realizados, vamos ver como os ensaios de placa podem ser usados para enumerar fagos e outros tipos de vírus de várias fontes.

Métodos baseados em ensaio de placa podem ser usados para isolar bacteriófagos de diferentes amostras ambientais, como solo. Neste exemplo, os pesquisadores primeiro coletaram fagos do solo por filtração. O fago foi então usado para infectar a bactéria comum do solo Arthrobacter em um ensaio de placa. Os fagos foram colhidos de placas individuais e listrados em novas placas de ágar e, em seguida, revestidos com ágar superior contendo bactérias. A concentração de fagos diminui ao longo do comprimento da linha, de modo que placas discretas, provavelmente formadas por um único tipo de fago, podem ser obtidas. Essas placas individuais podem então ser escolhidas para analisar melhor os fagos dentro.

Além dos bacteriófagos, os ensaios de placa também podem ser realizados com outros vírus, incluindo aqueles, como a gripe, que infectam mamíferos. Para fazer isso, as células de mamíferos são primeiro cultivadas como monocamadas em placas de cultura de tecidos. Os meios contendo os vírus são então adicionados às células para permitir que a infecção ocorra, antes que as células sejam revestidas com um meio imobilizador, como a agarose gelatinosa. Após um período de incubação que pode durar até duas semanas, as células infectadas são fixadas e coradas para permitir que as placas sejam visualizadas e contadas.

Finalmente, além das amostras coletadas do ambiente, os ensaios de placa são úteis para detectar e enumerar vírus em amostras de tecido de indivíduos infectados. Aqui, os pesquisadores obtiveram e homogeneizaram tecidos pulmonares de camundongos infectados com gama-herpesvírus. Este homogeneizado contendo vírus foi então usado para infectar a cultura de células de mamíferos. O número de placas poderia então ser contado para fornecer uma estimativa do título viral nos tecidos pulmonares infectados.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre a detecção de bacteriófagos em amostras ambientais. Agora você deve entender a biologia básica dos fagos, como realizar um ensaio de placa para quantificar fagos em uma amostra ambiental e como os ensaios de placa podem ser usados para estudar fagos e outros vírus em amostras ambientais ou clínicas. Como sempre, obrigado por assistir!