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Um único cristal é necessário para a determinação de sua estrutura. A qualidade do cristal influencia fortemente a qualidade e a precisão da determinação estrutural.
Um único cristal é um sólido no qual o arranjo da molécula se repete em todas as três dimensões. O arranjo espacial dos átomos dentro do sólido cristalino pode ser determinado usando cristalografia de raios-X. Nesta técnica, uma amostra cristalina pura é envolvida por um feixe de raios-X. O cristal difrata os raios-X em um padrão distinto relacionado à estrutura dos cristais e à composição molecular. Se um cristal for formado muito rapidamente, as moléculas podem ser desordenadas, impurezas podem ser incorporadas ao cristal ou dois ou mais cristais fundidos podem se formar em vez de um único cristal. Portanto, métodos especializados com ênfase no crescimento lento são necessários para produzir cristais de qualidade suficiente para cristalografia de raios-X.
Este vídeo ilustrará as características desejadas dos cristais com qualidade de raios-X, demonstrará um procedimento para cultivá-los e apresentará algumas aplicações dessa técnica em química.
Os elétrons espalham os raios X emitindo uma onda esférica de raios-X quando atingidos. Se os átomos estiverem em um arranjo ordenado, a interferência construtiva entre as ondas produz um padrão de difração característico em um detector de raios-X. O cristal é girado dentro do feixe para coletar padrões de difração de vários ângulos. Com padrões de difração suficientes, a estrutura molecular pode ser derivada.
Os cristais com qualidade de raios-X geralmente formam formas simétricas e têm faces suaves e refletoras de luz. Quando vistos sob um microscópio polarizador, eles serão transparentes, mas a maioria deve ficar escura quando girada 90?. Isso indica uma estrutura altamente ordenada. Para cultivar esses cristais, a difusão líquido-líquido é freqüentemente usada. Este emprega dois solventes miscíveis: um solvente de baixa densidade, ou precipitante, no qual o composto a ser recristalizado é insolúvel; e um solvente de alta densidade no qual o composto é solúvel. Normalmente, a proporção volumétrica de precipitante para solvente é de 2:1.
O precipitante de baixa densidade é colocado em camadas sobre uma solução concentrada do composto no solvente de alta densidade. Com o tempo, o composto torna-se menos solúvel à medida que o precipitante se mistura com a solução. Uma interface de solvente menor resulta em uma taxa de difusão mais lenta, produzindo cristais maiores e mais puros. Agora que você entende os princípios do cultivo de cristais com qualidade de raios-X, vamos passar por um procedimento para cultivá-los por difusão líquido-líquido.
Para começar, obtenha o equipamento necessário encontrado no protocolo de texto. Adquira um solvente para o composto e um precipitante menos denso.
Para preparar um filtro de pipeta, coloque um pequeno pedaço de Kimwipe na parte superior de uma pipeta de vidro e pressione suavemente o papel até a parte inferior do corpo da pipeta usando uma haste ou a haste de outra pipeta, tomando cuidado para não perfurar o papel. Prepare dois filtros de pipeta. Coloque um no tubo de RMN. Se necessário, prenda o conjunto com um laboratório clamp e suporte de anel. Dissolva cerca de 10 mg do composto a ser recristalizado em 0,75 mL de solvente.
Agora, adicione cuidadosamente a solução de amostra no filtro de pipeta. Fixe uma lâmpada na parte superior e aperte lentamente para passar a solução no tubo de RMN para remover as impurezas sólidas. Não permita que o bulbo se expanda novamente enquanto estiver conectado, pois a sucção desalojará o papel de filtro.
Em seguida, remova o filtro de pipeta usado e coloque o segundo filtro no tubo de RMN. Pipete aproximadamente 1,5 mL de precipitante no tubo. Deixar o solvente passar pelo filtro por gravidade. A partir de agora, tome cuidado para não perturbar o filtro durante qualquer manipulação. Depois que todo o precipitante for filtrado para o tubo, remova o filtro e tampe o tubo. Coloque-o em um armário ou outro local facilmente verificado, onde não seja agitado.
Depois de pelo menos um dia, inspecione os tubos quanto ao crescimento de cristais. Se não houver cristais ou se os cristais forem muito pequenos, deixar o tubo de amostra intacto. Se os cristais estiverem visíveis, verifique seu tamanho e forma sem perturbar as camadas de solvente.
Se os cristais forem grandes, bem definidos e não estiverem agrupados, inspecione os cristais ao microscópio para verificar seu potencial de qualidade de raios-X. Não remova os cristais do tubo até que o difratômetro esteja pronto para iniciar a varredura. Se as moléculas de solvente forem incorporadas à estrutura cristalina, permitir que o cristal seque degradará o cristal. Usando cristalografia de raios-X, a estrutura molecular desses cristais roxo-avermelhados escuros foi verificada como tetrafenilporfirina.
A cristalografia de raios-X é uma ferramenta analítica essencial em química e bioquímica.
Os métodos de recristalização incluem aquecimento e resfriamento, difusão líquido-líquido, difusão de vapor e evaporação lenta. Na evaporação lenta de um único sistema de solvente, o composto é dissolvido em uma pequena quantidade de solvente e colocado em um recipiente com um pequeno orifício na tampa. À medida que o solvente evapora, a concentração aumenta até que o composto comece a cristalizar.
A funcionalidade das proteínas está frequentemente relacionada à sua estrutura. No entanto, as proteínas podem ser muito difíceis de cristalizar. Técnicas especializadas devem ser desenvolvidas para cultivar cristais de proteínas com qualidade de raios-X. Aqui, uma gota de solução proteica é misturada com uma gota de precipitante e essa mistura é selada em uma câmara com precipitante puro. À medida que o vapor do solvente se difunde para fora da gota, a solubilidade da proteína na gota diminui e a proteína cristaliza lentamente. Outra técnica mistura a solução proteica e o precipitante em óleo mineral. Usando essas técnicas, uma variedade de proteínas pode ser cristalizada para análise.
Na difração de pó, cada orientação espacial possível é representada na amostra simultaneamente. A difração de pó não é tão informativa sobre a estrutura quanto a difração de raios-X de cristal único devido à perda de dados de estrutura tridimensional. Em vez disso, a difração de pó se destaca na análise de misturas de sólidos cristalinos e na avaliação da cristalinidade de estruturas amorfas.
Você acabou de assistir à introdução de JoVE ao cultivo de cristais para cristalografia de raios-X. Agora você deve estar familiarizado com as propriedades dos cristais de qualidade de raios-X, um procedimento para cultivá-los e algumas aplicações dessa técnica em química.
Obrigado por assistir!
