Crescimento de Cristais para Análise de Difração de Raios-X
Fonte: Laboratório do Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
A cristalografia de raios-X é um método comumente usado para determinar o arranjo espacial…
1. Preparação do tubo de cristal e filtro
- Coloque um tubo de RMN em um frasco de Erlenmeyer.
- Prepare um filtro de pipeta.
- Construa o filtro colocando um pedaço de lenço sem fiapos (1 por 1 a 1 polegada)na pipeta e use uma haste para encaixar firmemente a limpeza na porção de gargalo da pipeta(Figura 1).
- Faça dois filtros de pipeta para cada tubo de cristal necessário.
2. Adicionando a amostra ao tubo de cristal
- Dissolva o composto (tetrafenilaporfirina, 10 mg) em 0,75 mL de solvente (diclorometano).
- Com uma pipeta, adicione suavemente a mistura na parte superior do tubo, passando-a pelo filtro.
- As partículas são filtradas para evitar a criação de locais de nucleação, o que pode levar a pequenos cristais múltiplos em vez dos cristais maiores desejados.
- Uma vez que a amostra tenha sido colocada no tubo de cristal, muito lentamente e suavemente, adicione o anti-solvente (1,5 mL de metanol) ao tubo através de uma nova pipeta de filtro. Permita que o anti-solvente se coloque lentamente na solução adicionada anteriormente (Figura 2). Não use uma lâmpada para empurrar o solvente através da pipeta, em vez disso, deixe o solvente fluir através do filtro por si só.
- Certifique-se de que o solvente de maior densidade seja adicionado primeiro ao tubo de cristal.
- Verifique se os dois solventes estão errados um com o outro. Isso é feito antes da adição do solvente.
- Sele o tubo com uma tampa NMR.
3. Crescimento de Cristal
- Sem fazer com que os dois solventes se misturem, coloque o tubo de cristal em um armário onde eles não serão perturbados.
- O tempo de cristalização vai variar com cada composto, normalmente os tubos de cristal devem ficar imperturbáveis por uma semana.
- Depois de uma semana, inspecione os tubos para o crescimento de cristais.
- O crescimento de cristal normalmente ocorre na interface dos dois solventes.
- Inspecione visualmente os tubos em busca de evidências de crescimento de cristais. Tenha cuidado para não facilitar a mistura dos solventes, caso o composto exija tempo adicional para a formação de cristais.
- Se parece que o crescimento do cristal ocorreu, inspecione ainda mais os tubos usando um microscópio.
4. Seleção de Cristal
- Cristais de difração de raios-X devem ter rostos bem definidos.
- Cristais que se agruparam devem ser evitados, se possível.
- Deixe os cristais no tubo de cristal até que estejam prontos para colher o cristal, imediatamente antes de colocar o cristal no difrítômetro.
- Manter os cristais no tubo garantirá que os cristais permaneçam solvados. A dess solvação pode fazer com que os cristais quebrem, e dificultar a difração do cristal.
Figura 1. Uma imagem do filtro de pipeta. Um pequeno pedaço de lenço sem fiapos foi firmemente preso ao gargalo da pipeta. As soluções são passadas embora estes filtros de pipeta antes de serem introduzidos no tubo de cristal.
Figura 2. Uma vez que a solução contendo composto direcionado é colocada no tubo de cristal, o anti-solvente é lentamente em camadas em cima, passando-o através de um novo filtro de pipeta.
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Um único cristal é necessário para a determinação de sua estrutura. A qualidade do cristal influencia fortemente a qualidade e a precisão da determinação estrutural.
Um único cristal é um sólido no qual o arranjo da molécula se repete em todas as três dimensões. O arranjo espacial dos átomos dentro do sólido cristalino pode ser determinado usando cristalografia de raios-X. Nesta técnica, uma amostra cristalina pura é envolvida por um feixe de raios-X. O cristal difrata os raios-X em um padrão distinto relacionado à estrutura dos cristais e à composição molecular. Se um cristal for formado muito rapidamente, as moléculas podem ser desordenadas, impurezas podem ser incorporadas ao cristal ou dois ou mais cristais fundidos podem se formar em vez de um único cristal. Portanto, métodos especializados com ênfase no crescimento lento são necessários para produzir cristais de qualidade suficiente para cristalografia de raios-X.
Este vídeo ilustrará as características desejadas dos cristais com qualidade de raios-X, demonstrará um procedimento para cultivá-los e apresentará algumas aplicações dessa técnica em química.
Os elétrons espalham os raios X emitindo uma onda esférica de raios-X quando atingidos. Se os átomos estiverem em um arranjo ordenado, a interferência construtiva entre as ondas produz um padrão de difração característico em um detector de raios-X. O cristal é girado dentro do feixe para coletar padrões de difração de vários ângulos. Com padrões de difração suficientes, a estrutura molecular pode ser derivada.
Os cristais com qualidade de raios-X geralmente formam formas simétricas e têm faces suaves e refletoras de luz. Quando vistos sob um microscópio polarizador, eles serão transparentes, mas a maioria deve ficar escura quando girada 90?. Isso indica uma estrutura altamente ordenada. Para cultivar esses cristais, a difusão líquido-líquido é freqüentemente usada. Este emprega dois solventes miscíveis: um solvente de baixa densidade, ou precipitante, no qual o composto a ser recristalizado é insolúvel; e um solvente de alta densidade no qual o composto é solúvel. Normalmente, a proporção volumétrica de precipitante para solvente é de 2:1.
O precipitante de baixa densidade é colocado em camadas sobre uma solução concentrada do composto no solvente de alta densidade. Com o tempo, o composto torna-se menos solúvel à medida que o precipitante se mistura com a solução. Uma interface de solvente menor resulta em uma taxa de difusão mais lenta, produzindo cristais maiores e mais puros. Agora que você entende os princípios do cultivo de cristais com qualidade de raios-X, vamos passar por um procedimento para cultivá-los por difusão líquido-líquido.
Para começar, obtenha o equipamento necessário encontrado no protocolo de texto. Adquira um solvente para o composto e um precipitante menos denso.
Para preparar um filtro de pipeta, coloque um pequeno pedaço de Kimwipe na parte superior de uma pipeta de vidro e pressione suavemente o papel até a parte inferior do corpo da pipeta usando uma haste ou a haste de outra pipeta, tomando cuidado para não perfurar o papel. Prepare dois filtros de pipeta. Coloque um no tubo de RMN. Se necessário, prenda o conjunto com um laboratório clamp e suporte de anel. Dissolva cerca de 10 mg do composto a ser recristalizado em 0,75 mL de solvente.
Agora, adicione cuidadosamente a solução de amostra no filtro de pipeta. Fixe uma lâmpada na parte superior e aperte lentamente para passar a solução no tubo de RMN para remover as impurezas sólidas. Não permita que o bulbo se expanda novamente enquanto estiver conectado, pois a sucção desalojará o papel de filtro.
Em seguida, remova o filtro de pipeta usado e coloque o segundo filtro no tubo de RMN. Pipete aproximadamente 1,5 mL de precipitante no tubo. Deixar o solvente passar pelo filtro por gravidade. A partir de agora, tome cuidado para não perturbar o filtro durante qualquer manipulação. Depois que todo o precipitante for filtrado para o tubo, remova o filtro e tampe o tubo. Coloque-o em um armário ou outro local facilmente verificado, onde não seja agitado.
Depois de pelo menos um dia, inspecione os tubos quanto ao crescimento de cristais. Se não houver cristais ou se os cristais forem muito pequenos, deixar o tubo de amostra intacto. Se os cristais estiverem visíveis, verifique seu tamanho e forma sem perturbar as camadas de solvente.
Se os cristais forem grandes, bem definidos e não estiverem agrupados, inspecione os cristais ao microscópio para verificar seu potencial de qualidade de raios-X. Não remova os cristais do tubo até que o difratômetro esteja pronto para iniciar a varredura. Se as moléculas de solvente forem incorporadas à estrutura cristalina, permitir que o cristal seque degradará o cristal. Usando cristalografia de raios-X, a estrutura molecular desses cristais roxo-avermelhados escuros foi verificada como tetrafenilporfirina.
A cristalografia de raios-X é uma ferramenta analítica essencial em química e bioquímica.
Os métodos de recristalização incluem aquecimento e resfriamento, difusão líquido-líquido, difusão de vapor e evaporação lenta. Na evaporação lenta de um único sistema de solvente, o composto é dissolvido em uma pequena quantidade de solvente e colocado em um recipiente com um pequeno orifício na tampa. À medida que o solvente evapora, a concentração aumenta até que o composto comece a cristalizar.
A funcionalidade das proteínas está frequentemente relacionada à sua estrutura. No entanto, as proteínas podem ser muito difíceis de cristalizar. Técnicas especializadas devem ser desenvolvidas para cultivar cristais de proteínas com qualidade de raios-X. Aqui, uma gota de solução proteica é misturada com uma gota de precipitante e essa mistura é selada em uma câmara com precipitante puro. À medida que o vapor do solvente se difunde para fora da gota, a solubilidade da proteína na gota diminui e a proteína cristaliza lentamente. Outra técnica mistura a solução proteica e o precipitante em óleo mineral. Usando essas técnicas, uma variedade de proteínas pode ser cristalizada para análise.
Na difração de pó, cada orientação espacial possível é representada na amostra simultaneamente. A difração de pó não é tão informativa sobre a estrutura quanto a difração de raios-X de cristal único devido à perda de dados de estrutura tridimensional. Em vez disso, a difração de pó se destaca na análise de misturas de sólidos cristalinos e na avaliação da cristalinidade de estruturas amorfas.
Você acabou de assistir à introdução de JoVE ao cultivo de cristais para cristalografia de raios-X. Agora você deve estar familiarizado com as propriedades dos cristais de qualidade de raios-X, um procedimento para cultivá-los e algumas aplicações dessa técnica em química.
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Q1: What makes a crystal suitable for X-ray diffraction analysis?
X-ray-quality crystals form symmetric shapes with smooth, light-reflecting faces. Under a polarizing microscope, they appear transparent but turn dark when rotated 90 degrees, indicating highly ordered molecular arrangement. This ordered structure is essential because crystal quality directly influences the accuracy of structural determination in X-ray crystallography.
Q2: Why does slow crystal growth produce better results for X-ray analysis?
Rapid crystal formation causes molecular disorder, incorporates impurities, or creates fused crystals instead of single crystals. Slow growth allows molecules to arrange orderly and prevents contamination. A smaller solvent interface during liquid-liquid diffusion reduces the diffusion rate, yielding larger, purer crystals suitable for X-ray crystallography.
Q3: How does liquid-liquid diffusion work in crystal growth?
Liquid-liquid diffusion uses two miscible solvents: a low-density precipitant where the compound is insoluble, and a high-density solvent where it dissolves. The precipitant is layered onto the concentrated compound solution. As the precipitant gradually mixes with the solution, the compound becomes less soluble, causing slow, controlled crystallization that produces high-quality crystals.
Q4: What is the role of the pipette filter in the crystal growth procedure?
The pipette filter removes solid impurities from the compound solution before crystallization begins. A small piece of Kimwipe is placed in the glass pipette and pressed to the bottom. The sample solution passes through the filter by gentle bulb pressure, ensuring only pure dissolved compound enters the NMR tube for clean crystal formation.
Q5: How does X-ray crystallography determine molecular structure?
When X-rays hit a crystal with ordered atoms, electrons scatter the rays, producing constructive interference and a characteristic diffraction pattern. The crystal is rotated to collect patterns from multiple angles. With sufficient diffraction data, the three-dimensional spatial arrangement of atoms can be derived, revealing the molecule's complete structure and composition.
Q6: What alternative methods can be used to grow X-ray-quality crystals?
Besides liquid-liquid diffusion, recrystallization methods include vapor diffusion, slow evaporation, and heating-cooling cycles. In slow evaporation, the compound dissolves in solvent in a container with a small hole; as solvent evaporates, concentration increases until crystallization occurs. Protein crystallization often requires specialized techniques like purifying compounds by recrystallization under mineral oil.
Q7: Why is single-crystal X-ray diffraction preferred over powder diffraction?
Single-crystal X-ray diffraction preserves three-dimensional structural information because each crystal orientation is distinct. Powder diffraction loses this spatial data since all possible orientations exist simultaneously in the sample. While powder diffraction excels at analyzing crystalline mixtures and assessing amorphous structure crystallinity, single-crystal methods provide superior structural detail for determining molecular shape.