Extração de DNA de comunidades de colônias bacterianas

1. Extração de DNA da comunidade bacteriana

1. Para iniciar o procedimento, pese 100 g de solo peneirado. Adicione isso a um vaso de polipropileno, e adicione 100 mL de tampão de extração composto de tampão Tris alterado com EDTA para promover a liberação de bactérias da matriz do solo, em seguida, aperte à mão.
2. Em seguida, pese 100 g de contas de vidro, e adicione-as ao recipiente de mistura. Agitar a amostra por 5 min usando um dispositivo de batida de contas ou um agitador mecânico de ação de pulso por 15 minutos. Adicione 10 mL 20% de sulfato de dodecil de sódio, ou SDS, à mistura e, em seguida, agitar por mais um minuto. Incubar a uma alta temperatura de 60 - 65 °C por 60 min.
3. Distribua igualmente a amostra entre tubos separados de 50 mL e centrífuga por 10 minutos a 6.000 x g. Transfira o supernatante dos tubos para um único recipiente estéril. Em seguida, repita a extração na pelota do solo como descrito anteriormente, utilizando um novo volume de tampão de extração.
4. Em seguida, adicione o volume total de supernanato processado, aproximadamente 200 mL, a um tubo limpo de 50 mL preenchido a meio volume com uma solução de 30% de polietileno glicol e cloreto de sódio de 1,6 M. Inverta as garrafas várias vezes à mão para misturar e incubar à temperatura ambiente por 2h. Centrífuga amostras a 10.000 x g por 20 minutos para pelotar o DNA.
5. Remova o supernatante cuidadosamente do tubo centrífuga, deixando para trás a pelota de ácido nucleico parcialmente purificada. Adicione 20 mL de TE Buffer e 1,5 mL de uma solução de acetato de potássio de 7,5 M para resuspensar a pelota, depois vórtice. Coloque a suspensão no gelo por 5 minutos. Centrifugar a 16.000 x g por 30 min a 4 °C para precipitar proteínas e polissacarídeos.
6. Em seguida, adicione um RNAse e proteinase K à amostra, misture suavemente à mão e deixe descansar por momento. Adicione um volume equivalente de fenol:clorofórmio:álcool isoamyl (mistura de razão de 25:24:1) à suspensão a ser extraída, e misture suavemente à mão. Centrifugar a preparação para 10 min a 13.000 x g. Remova cuidadosamente o vaso da centrífuga e observe as duas camadas.
7. A camada inferior e mais pesada é composta do fenol:clorofórmio: álcool isoamyl e detritos extraídos, e a camada superior é a aquosa e contém o DNA. Coloque a fase aquosa em um vaso estéril, adicione um volume equivalente de isopropanol e inverta suavemente para iniciar a precipitação do DNA. Incubar a suspensão em temperatura ambiente por 2h. Pellet o DNA purificado por centrifugação a 16.000 x g por 30 min. Remova cuidadosamente o supernasciente, pois o DNA pelleted pode ou não ser visível na parte inferior do vaso e, em seguida, resuspend em 1 mL de TE Buffer.
8. Usando um fluorímetro de quantificação de DNA/RNA, meça o nível de DNA extraído da amostra. A quantidade de DNA é estimada a partir da leitura de 260 nm. Uma leitura de absorvância de 1,0 equivale a 50 μg de DNA por mL de solução. Se a concentração for muito alta para leituras precisas, dilui a suspensão de 1 a 10, ou 1 a 100 usando água de grau molecular.
9. A pureza do DNA é estimada da razão da leitura em 260 nm para a de 280 nm. Um valor > 1,7 indica DNA relativamente puro. O valor teórico máximo é 2.0.