2.6: Extração de DNA de comunidades de colônias bacterianas

1. Extração de DNA da comunidade bacteriana

1. Para iniciar o procedimento, pese 100 g de solo peneirado. Adicione isso a um vaso de polipropileno, e adicione 100 mL de tampão de extração composto de tampão Tris alterado com EDTA para promover a liberação de bactérias da matriz do solo, em seguida, aperte à mão.
2. Em seguida, pese 100 g de contas de vidro, e adicione-as ao recipiente de mistura. Agitar a amostra por 5 min usando um dispositivo de batida de contas ou um agitador mecânico de ação de pulso por 15 minutos. Adicione 10 mL 20% de sulfato de dodecil de sódio, ou SDS, à mistura e, em seguida, agitar por mais um minuto. Incubar a uma alta temperatura de 60 - 65 °C por 60 min.
3. Distribua igualmente a amostra entre tubos separados de 50 mL e centrífuga por 10 minutos a 6.000 x g. Transfira o supernatante dos tubos para um único recipiente estéril. Em seguida, repita a extração na pelota do solo como descrito anteriormente, utilizando um novo volume de tampão de extração.
4. Em seguida, adicione o volume total de supernanato processado, aproximadamente 200 mL, a um tubo limpo de 50 mL preenchido a meio volume com uma solução de 30% de polietileno glicol e cloreto de sódio de 1,6 M. Inverta as garrafas várias vezes à mão para misturar e incubar à temperatura ambiente por 2h. Centrífuga amostras a 10.000 x g por 20 minutos para pelotar o DNA.
5. Remova o supernatante cuidadosamente do tubo centrífuga, deixando para trás a pelota de ácido nucleico parcialmente purificada. Adicione 20 mL de TE Buffer e 1,5 mL de uma solução de acetato de potássio de 7,5 M para resuspensar a pelota, depois vórtice. Coloque a suspensão no gelo por 5 minutos. Centrifugar a 16.000 x g por 30 min a 4 °C para precipitar proteínas e polissacarídeos.
6. Em seguida, adicione um RNAse e proteinase K à amostra, misture suavemente à mão e deixe descansar por momento. Adicione um volume equivalente de fenol:clorofórmio:álcool isoamyl (mistura de razão de 25:24:1) à suspensão a ser extraída, e misture suavemente à mão. Centrifugar a preparação para 10 min a 13.000 x g. Remova cuidadosamente o vaso da centrífuga e observe as duas camadas.
7. A camada inferior e mais pesada é composta do fenol:clorofórmio: álcool isoamyl e detritos extraídos, e a camada superior é a aquosa e contém o DNA. Coloque a fase aquosa em um vaso estéril, adicione um volume equivalente de isopropanol e inverta suavemente para iniciar a precipitação do DNA. Incubar a suspensão em temperatura ambiente por 2h. Pellet o DNA purificado por centrifugação a 16.000 x g por 30 min. Remova cuidadosamente o supernasciente, pois o DNA pelleted pode ou não ser visível na parte inferior do vaso e, em seguida, resuspend em 1 mL de TE Buffer.
8. Usando um fluorímetro de quantificação de DNA/RNA, meça o nível de DNA extraído da amostra. A quantidade de DNA é estimada a partir da leitura de 260 nm. Uma leitura de absorvância de 1,0 equivale a 50 μg de DNA por mL de solução. Se a concentração for muito alta para leituras precisas, dilui a suspensão de 1 a 10, ou 1 a 100 usando água de grau molecular.
9. A pureza do DNA é estimada da razão da leitura em 260 nm para a de 280 nm. Um valor > 1,7 indica DNA relativamente puro. O valor teórico máximo é 2.0.

A extração de DNA da comunidade bacteriana é um processo pelo qual o DNA é obtido de várias espécies bacterianas dentro de uma comunidade durante um único procedimento de extração.

As análises tradicionais de comunidades microbianas no solo geralmente envolvem ensaios culturais, utilizando metodologia de diluição e plaqueamento em diferentes meios seletivos. No entanto, muitas bactérias crescem mal em condições de laboratório ou nas condições específicas do meio de crescimento selecionadas, o que significa que podem ser perdidas ou severamente sub-representadas.

Recentemente, a extração de DNA comunitário de amostras bacterianas do solo permitiu uma amostragem mais abrangente das comunidades bacterianas. Acredita-se que essa abordagem não baseada na cultura seja mais representativa das comunidades reais presentes do que os métodos tradicionais baseados na cultura.

Este vídeo demonstrará um método de não cultura de extração de DNA da comunidade bacteriana, como verificar a qualidade e a quantidade de DNA extraído e explorar como esse DNA pode ser utilizado para estudar a diversidade bacteriana.

A extração de DNA do solo pode ser conduzida de duas maneiras. No método de fracionamento, as células são primeiro separadas da matriz do solo antes da extração do material genético. A amostra é então submetida a ciclos sucessivos de mistura e centrifugação lenta para coletar células intactas em um pellet.

As lisozimas são então adicionadas às células e a suspensão é incubada. As lisozimas são enzimas que quebram as paredes celulares bacterianas. Uma vez que a estrutura da parede celular tenha sido comprometida, o DNA pode ser liberado para purificação. No entanto, um segundo método de extração de DNA comunitário, o método in situ, demonstrou produzir maior concentração de DNA.

Aqui, uma massa de solo é combinada com um volume equivalente de tampão de extração Tris-EDTA e contas de vidro, e misturada agressivamente para facilitar a separação das células das partículas do solo. Um detergente é então adicionado, geralmente dodecil sulfato de sódio, ou SDS, e a amostra é misturada para promover a lise das células e a liberação de seu conteúdo, incluindo DNA.

A incubação em alta temperatura é então realizada para lisar quaisquer células bacterianas remanescentes. As amostras são centrifugadas e uma extração e incubação de polietilenoglicol são realizadas no sobrenadante para precipitar o DNA, que é então centrifugado em um pellet.

O DNA é ressuspenso em tampão TE e acetato de potássio para lavar ainda mais o DNA de proteínas e polissacarídeos e, em seguida, a centrifugação é realizada para pellet esses componentes indesejáveis. O sobrenadante aquoso contendo o DNA é removido e submetido a uma extração de fenol-clorofórmio e precipitação de isopropanol para limpar e concentrar ainda mais o DNA. Após um período de incubação à temperatura ambiente de duas horas, o DNA é centrifugado e ressuspenso em tampão TE para armazenamento até a análise.

Agora que estamos familiarizados com os conceitos e processos por trás da extração de DNA da comunidade bacteriana, vamos dar uma olhada em como ela é realizada em laboratório.

Para iniciar o procedimento, pesar 100 g de terra peneirada. Adicione isso a um recipiente de polipropileno e adicione 100 mL de tampão de extração composto de tampão Tris alterado com EDTA para promover a liberação de bactérias da matriz do solo e, em seguida, agite com a mão.

Em seguida, pese 100 g de contas de vidro e adicione-as ao recipiente de mistura. Agite a amostra por 5 minutos usando um dispositivo de batimento de esferas ou agitador mecânico de ação de pulso. Adicione 10 mL de dodecil sulfato de sódio a 20%, ou SDS, à mistura e agite por mais um minuto. Incube em alta temperatura por 60 min.

Distribua igualmente a amostra entre tubos separados de 50 mL e centrifugue por 10 min?a 6.000 x g. Transfira o sobrenadante dos tubos para um único recipiente estéril. Em seguida, repita a extração no pellet de solo conforme descrito anteriormente, usando um novo volume de tampão de extração.

Em seguida, adicione o volume total de sobrenadante processado a um tubo limpo de 50 mL cheio até a metade do volume com uma solução de polietilenoglicol a 30% e cloreto de sódio 1,6 M. Inverta as garrafas várias vezes à mão para misturar e incube em temperatura ambiente por 2 h. Centrifugue amostras a 10.000 x g por 20 minutos para pellet o DNA.

Retirar cuidadosamente o sobrenadante do tubo de centrifugação, deixando para trás o sedimento de ácido nucleico parcialmente purificado. Adicione 20 mL de tampão TE e 1,5 mL de uma solução de acetato de potássio 7,5 M para ressuspender o pellet e, em seguida, vórtice. Coloque a suspensão no gelo por 5 min. Centrifugue a 16.000 x g por 30 min a 4 ? C para precipitar proteínas e polissacarídeos.

Em seguida, adicione uma RNAse e proteinase K à amostra, misture delicadamente à mão e deixe descansar por um momento. Adicionar um volume equivalente de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico à suspensão a extrair e misturar delicadamente à mão. Centrifugue a preparação por 10 min a 13.000 x g. Remova cuidadosamente o recipiente da centrífuga e observe as duas camadas.

A camada inferior, mais pesada, é composta pelo fenol: clorofórmio: álcool isoamílico e detritos extraídos, e a camada superior é aquosa e contém o DNA. Coloque a fase aquosa em um recipiente estéril, adicione um volume equivalente de isopropanol e inverta suavemente para iniciar a precipitação do DNA. Incubar a suspensão à temperatura ambiente durante 2 h. Pulverize o DNA purificado por centrifugação a 16.000 x g por 30 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante, pois o DNA peletizado pode ou não ser visível no fundo do vaso e, em seguida, ressuspenda em 1 mL de tampão TE.

Usando um espectrofotômetro ou fluorímetro de quantificação de DNA / RNA, meça o nível de DNA extraído da amostra. Os fluorímetros de DNA / RNA produzirão os níveis de DNA em unidades de nanogramas por mililitro. Se a concentração for muito alta para leituras precisas, dilua a suspensão de 1 a 10 ou 1 a 100 usando água de grau molecular.

Uma vez que o DNA é obtido de uma comunidade bacteriana, isso pode ser utilizado de várias maneiras diferentes. Algumas dessas aplicações são exploradas aqui.

Análises espectrofotográficas do DNA extraído do DNA da comunidade podem fornecer uma visão sobre o número de células bacterianas presentes em uma determinada amostra de solo. A quantidade estimada de DNA em ng por mL de solução pode ser relacionada ao volume total de DNA extraído em solução, para dar a quantidade total de DNA por g de solo. Conhecendo o valor teórico do DNA por célula, o número total de células por g de solo pode ser calculado.

Para aplicações mais direcionadas, o DNA extraído de comunidades bacterianas pode ser submetido a PCR para determinar se uma determinada espécie está presente na comunidade. Por exemplo, os cientistas podem querer identificar se as amostras de solo contêm patógenos específicos, como Clostridium perfringens ou Bacillus anthracis.

Finalmente, para obter uma compreensão mais abrangente das bactérias presentes em uma comunidade, as amostras de DNA podem ser submetidas a caracterização "ômica" e bioinformática que permitem uma análise mais profunda das bactérias originais dentro da amostra. ? Ômicas? descreve uma gama de tecnologias que exploram papéis, relacionamentos e ações de moléculas em organismos ou comunidades. Isso inclui os estudos de genes e sua função, ou ? Genômica?, e ? Proteômica?, o estudo das proteínas e seus papéis. Por exemplo, sequenciamento de 16S? O RNA das amostras pode permitir uma determinação metagenômica de espécies específicas dentro da comunidade, fornecendo uma estimativa mais detalhada da diversidade. Essa abordagem pode dar aos cientistas uma melhor compreensão da composição das espécies de uma comunidade e quais papéis eles podem estar desempenhando.

Você acabou de assistir à introdução de JoVE à extração de DNA da comunidade bacteriana. Agora você deve entender como extrair DNA de uma comunidade bacteriana, como verificar a qualidade desse DNA e como esse DNA pode ser usado para investigações da composição da comunidade bacteriana. Obrigado por assistir!