Name: Embrionárias com células-tronco derivadas de células endoteliais para tratamento da isquemia dos membros posteriores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a injetar células endoteliais derivadas de células-tronco embrionárias em membros posteriores isquêmicos para tratar doença arterial periférica. Este método utiliza imagem de bioluminescência para rastrear células in vivo e avaliar seus efeitos terapêuticos na regeneração vascular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, e Stanford Núcleo de Imagem de Pequenos Animais para assistência técnica. Os autores também agradecem AM Bickford, Inc. para suporte de equipamentos veterinários. Esta pesquisa foi suportada por concessões de pesquisa do National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), o Programa de Pesquisa do Tabaco Califórnia Related Disease da Universidade da Califórnia (15IT-0257 e 1514RT-0169) , e do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (RS1-00183). NH é apoiado por uma bolsa da American Heart Association. pode Heart Association.

1. Diferenciação dos CES murino em células endoteliais <ol><li> O protocolo para a diferenciação em células endoteliais CES é descrito em outros lugares e não é o foco deste protocolo 2,3. Resumidamente, as células podem se diferenciar, e as células que são positivas para os marcadores endoteliais, tais como CD31 ou caderina endotelial vascular (VE-caderina) são purificados por separação de células ativadas por fluorescência (FACS). </li></ol> 2. Construção da Double Fusion Gene Reporter e Transdução Lentivirus <ol><li> Bioluminescência pode ser usado para rastrear as células que são modificados para expressar genes repórter, como vaga-lume luciferase (flutuações). Para esta aplicação, as nossas células contêm flutuações e aprimorados fluorescência verde da proteína do gene de fusão (EGFP) sob o controle de um promotor interno ubiquitina. , A fim de modificar as células, o vetor de transgene lentiviral contendo a chave otimizado elementos genéticos para cumprir os critérios de biossegurança, bem como a eficiência de transdução de aumento, UFP-FG vector desenvolvidos em nosso laboratório carregando a flutuações de eGFP gene repórter de fusão podem ser usadas para estável transdução de células após a diferenciação. Esta construção de fusão permite tanto a bioluminescência e rastreamento de fluorescência das células transplantadas. O procedimento para a geração de partículas virais, transdução e produção de células marcadas que os genes repórter expressar é descrito em outra parte 4. </li></ol> 3. Transplante de ESC-derivados de células endoteliais ao hindlimb isquêmica <ol><li> Iniciar o procedimento, preparando um rato que sofreu isquemia hindlimb para o transplante de células. Para fazer isso, coloque o mouse na câmara de indução anestésica contendo 1-3% de isoflurano em oxigênio a 100% a taxa de fluxo de 1l/min. </li><li> Deixe o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução. </li><li> Em seguida, coloque o animal em decúbito dorsal sobre a mesa de operação e conectá-lo a um fluxo contínuo de 1-3% isoflurano em oxigênio a 100% a taxa de fluxo de 1l/min. </li><li> Limpe a pele do membro posterior, com três esfrega alternando betadine e álcool. </li><li> Quando a pele é limpa, obter um milhão ESC derivados de células endoteliais em 30 mL de tampão fosfato (PBS). Carregar essas células em uma agulha de calibre 28. </li><li> Quando as células estão prontos, levante com cuidado e ampliar a hindlimb para melhor visualizar a localização do músculo gastrocnêmio. Enquanto a perna é estendida, insira a agulha através da pele até o músculo subjacente. Tome cuidado para não abordar o osso. Suavemente e injecte lentamente a mistura de células 30 mL para o gastrocnêmio. Por via intramuscular, 30 mL está perto do limite de volume que pode ser injetado. Portanto, calibre 28 seringas de insulina são preferidas porque, em nossa experiência, eles eliminam o volume de perda de agulhas de seringa. </li><li> Após a injeção é completa, devolva o mouse para a gaiola de recuperação e monitorá-lo continuamente até que desperto. Permitir que o animal se recuperar durante várias horas e depois prosseguir com a imagem de bioluminescência vivo das células transplantadas. </li></ol> 4. Imagem de bioluminescência de ESC-derivados de células endoteliais in vivo <ol><li> O transplante de células-ESC derivados endothelials foram modificados para expressar tanto flutuações eo gene de fusão eGFP sob o controle de um promotor interno ubiquitina. Portanto, a bioluminescência pode ser usado para rastrear as células dentro do hindlimb isquêmica. </li><li> Para começar esta etapa, ligue o sistema de imagem de bioluminescência e software Vivendo aquisição de imagens. Em seguida, inicializar o sistema de aquisição e especificar as dimensões do campo de visão. </li><li> Em seguida, coloque papel preto fosco para a caixa de imagem para absorver emissões de fundo. </li><li> Uma vez que a caixa de imagem está pronta, coloque o mouse para dentro da câmara de indução anestésica contendo 1-3% de isoflurano em oxigênio na saída de 1l/min. Deixe o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução. </li><li> Remover os pêlos de ambos os membros posteriores usando um barbeador elétrico, se necessário. </li><li> Injectar 10 mL de D-luciferina por grama de peso corporal para o peritônio. A D-luciferina é preparado com antecedência em soluções estoque filtrada de 15 mg / mL em PBS. </li><li> Uma vez que a luciferina é injetado, coloque o animal na caixa de imagem sobre o papel preto em decúbito dorsal, ligada a um fluxo contínuo de isoflurano. </li><li> Colocando o animal em caixa de imagem e conexão com isoflurano. </li><li> Começar a adquirir imagens de 10-60 segundos a fim de determinar um tempo de exposição ideal para que a imagem não está saturado. Se a imagem se torna saturado, reduzir o tempo de exposição. Se o sinal de bioluminescência é muito fraco, aumente o tempo de exposição. </li><li> Using o tempo de exposição ideal, continue aquisição de imagens a cada 1-3 minutos até que o sinal atinge o máximo e depois se desvanece. Quando a aquisição estiver concluída, salve o arquivo. </li><li> Para analisar os dados, selecionar regiões de interesse (ROIs) que cobrem o local da injeção. Como controle negativo, um ROI semelhante pode ser selecionado para a perna não-operada. Usando o software, medir o brilho total, que é expressa em unidades de fótons / segundo / cm 2 / esterradiano (p / s / cm 2 / sr), para a ROIs para cada ponto no tempo. O valor máximo deve ser usado nos dados finais. Os dados também podem ser exportados para planilha Excel para uso futuro. </li><li> Uma vez que todos os dados são adquiridos, devolver o animal para a gaiola de recuperação e monitorar continuamente até que o desperta animal. </li><li> Repita este procedimento para rastrear as células ao longo do tempo. </li><li> Em um ponto de tempo desejado, o animal pode ser sacrificado para avaliação da função do tecido. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/old/1034_2009_1_22_4/figure 1.png" alt="Figura 1" width="600" height="600" /> Uma imagem de bioluminescência representante de células transplantadas na hindlimb deixou isquêmica é mostrado na Figura 1. Durante a aquisição de bioluminescência, a intensidade vai aumentar com o tempo, eo valor máximo obtido durante o curso do tempo deve ser relatado como o valor final.

<ol><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Murine model of hindlimb ischemia.</a> JoVE. , (2008).</li>
<li>Levenberg, S., Golub, J. S., Amit, M., Itsakovitz-Eldor, J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4391-4396 (2002).</li>
<li>Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., Nakao, K., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flk1-positive+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+serve+as+vascular+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors.</a> Nature. 408, 926-926 (2000).</li>
<li>De, A., Yaghoubi, S. S., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+lentiviral+vectors+in+noninvasive+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Applications of lentiviral vectors in noninvasive molecular imaging.</a> Methods Mol Biol. 433, 177-202 (2008).</li>
<li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li>
<li>Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Med. 4, 245-247 (1998).</li>
<li>Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li>
<li>Huang, N. F., Lee, R. J., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+regulation+of+stem+cells+and+progenitor+cells%3A+potential+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical regulation of stem cells and progenitor cells: potential for cardiovascular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1809-1823 (2007).</li>
<li>Cao, F., Lin, S., Xie, X., Ray, P., Patel, M., Zhang, X., Drukker, M., Dylla, S. J., Connolly, A. J., Chen, X., Weissman, I. L., Gambhir, S. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+migration+after+cardiac+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> Circulation. 113, 1005-1114 (2006).</li>
<li>Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+bioluminescence+reporter+gene+imaging+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

CES são uma fonte de células promissora para o tratamento da isquemia tecidual devido à sua plasticidade de diferenciação e sua capacidade de dar origem a linhagens de células compreendendo todas as três camadas germinativas, incluindo células endoteliais. Para superar as preocupações éticas associadas com os CES, as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) pode ser uma alternativa de células-tronco pluripotentes fonte que supera as preocupações éticas. Além CES, as células-tronco adultas, como as células progenitoras endoteliais (EPC...

<table><tbody><tr><td>Ferramentas cirúrgicas</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha de seringa</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Recomenda-se uma seringa de insulina 28G</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Reagente</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td>Preparar a D-luciferina com antecedência em soluções estoque filtradas de 15 mg/mL em PBS</td></tr><tr><td>Sistema de imagem de bioluminescência IVIS 200 e software de aquisição</td><td>Equipamento</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Xenogen Corporation</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

embrionárias com células-tronco derivadas de células endoteliais para tratamento da isquemia dos membros posteriores

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Doença arterial periférica (DAP) resulta de estreitamento das artérias periféricas que fornecem o sangue oxigenado e nutrientes para as pernas e pés, esta patologia provoca sintomas tais como claudicação intermitente (dor com a caminhada), dolorosos ulcerações isquêmicas, ou mesmo gangrena dos membros em risco. Acredita-se geralmente que o endotélio vascular, uma monocamada de células endoteliais que reveste a superfície luminal de todos os vasos sangüíneos e linfáticos, desempenha um papel dominante na homeostase vascular e regeneração vascular. Como resultado, a base de células-tronco a regeneração do endotélio pode ser uma abordagem promissora para o tratamento da PAD. Neste vídeo, demonstramos o transplante de células-tronco embrionárias (ESC) derivados de células endoteliais para o tratamento da isquemia hindimb unilateral como um modelo de PAD, seguido por não-invasiva de rastreamento de celular homing e sobrevivência por imagem de bioluminescência. Os materiais e procedimentos específicos para entrega de células e de imagem serão descritas. Este protocolo segue a outra publicação, ao descrever a indução de isquemia por hindlimb Niiyama et al 1.

O procedimento cirúrgico para a entrega de células-tronco embrionárias derivadas de células endoteliais para hindlimb isquêmica é demonstrada, com não-invasivo de monitoramento por imagem de bioluminescência.

Embrionárias com células-tronco derivadas de células endoteliais para tratamento da isquemia dos membros posteriores

A doença arterial periférica (DAP) resulta do estreitamento das artérias periféricas que fornecem sangue oxigenado e nutrientes para as pernas e pés, Isso ...

Doença arterial periférica. A DAP resulta do estreitamento das artérias periféricas que fornecem sangue e oxigênio para as pernas e os pés, levando à disfunção vascular. Para determinar se as células-tronco podem ser usadas para tratar a DAP, injetamos células endoteliais derivadas de células-tronco embrionárias na pata traseira após a indução de isquemia.Como essas células foram modificadas para expressar luciferase de vaga-lume, elas podem ser monitoradas por imagem de bioluminescência para determinar se migram para o local da lesão e exercem efeito terapêutico. Olá, sou John Cook. Sou professor de medicina na divisão de medicina cardiovascular da Universidade Stanford.Nosso laboratório tem interesse em angiogênese e regeneração vascular. Neste vídeo, dois dos meus pós-doutorandos, Dra. Nan Wong e Hir Niyama, irão apresentar procedimentos para transplante terapêutico de células em isquemia de membro traseiro e imagem não invasiva da sobrevivência celular. Esses procedimentos incluem os seguintes passos: a administração de células-tronco embrionárias direcionadas e células estero para o tratamento da isquemia unilateral de membro traseiro e o rastreamento não invasivo da localizaç

embryonic-stem-cell-derived-endothelial-cells-for-treatment-hindlimb

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O procedimento cirúrgico para a indução de isquemia hindlimb unilateral é demonstrada, com a confirmação de isquemia por laser Doppler imagens de perfusão.

Modelo murino de isquemia dos membros posteriores

Um método para semeadura de titânio de sangue entrar em contato com biomateriais com células autólogas e biocompatibilidade teste é descrito. Este método utiliza células progenitoras endoteliais e tubos de titânio, semeadas em poucos minutos de implante cirúrgico em suínos as cavas. Esta técnica é adaptável a muitas outras implantáveis ​​dispositivos biomédicos.

Autólogas progenitoras endoteliais Cell Technology Semear e Teste de biocompatibilidade para dispositivos Cardiovascular em Modelo Animal Grande

Células endoteliais que formam colônias (ECFCs) estão circulando células endoteliais com potencial clonal proliferativa robusto que exibe...

Caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais Formadoras de Colônias derivado do sangue do cordão umbilical humano

Descreve-se o método de células-tronco de programação para superexpressão fatores terapêuticos para angiogênese utilizando nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Processos descritos incluem a síntese do polímero, a transfecção de células estaminais derivadas de tecido adiposo, in vitro, e para validar a eficácia das células estaminais programadas para promover a angiogénese num modelo de isquemia dos membros posteriores de murino.

Células-tronco de programação para Therapeutic angiogênese Usando nanopartículas poliméricas biodegradáveis

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar engenharia de tecidos enxertos de vasos que são funcionais para enxerto em camundongos por semeadura dupla parcialmente célula-tronco pluripotentes induzidas (PPCPE) - derivados de células musculares lisas e PPCPE - células endoteliais derivadas em um biorreator descelulada navio andaime.

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

Apresentamos três protocolos de novos e mais eficientes para a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas induzida em cardiomiócitos, células endoteliais, e células do músculo liso e um método de entrega que melhora o enxerto de células transplantadas através da combinação de injecção das células com citocinas entrega mediada por remendo.

Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio

O objetivo do presente protocolo é isolar as células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical. Algumas das aplicações incluem o uso dessas células como um biomarcador para identificar pacientes com risco cardiovascular, tratamento de doenças isquêmicas, e criando engenharia de tecido vascular e coração válvula de construções.

Isolamento de células progenitoras endoteliais de sangue humano do Cordão Umbilical

Nós descrevemos um procedimento cirúrgico usado para induzir a isquemia periférica nos coelhos com hiperlipidemia e diabetes. Esta cirurgia actua como um modelo pré-clínico para as circunstâncias experimentadas na doença de artéria periférica nos pacientes. A angiografia também é descrita como um meio de medir a extensão da isquemia introduzida e a recuperação da perfusão.

Modelo pré-clínico de isquemia de membros posteriores em coelhos diabéticos

Aqui, é apresentado um modelo experimental de isquemia do membro posterior crítico, seguido de uma bateria de testes funcionais, histológicos e moleculares para avaliar a efetividade das terapias angiogênicas.

Avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia Retromembro

Apresenta-se aqui um protocolo simples para a diferenciação direcionada de células endoteliais hemogênicas de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente 1 semana.

Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

O presente protocolo descreve um estudo clínico prospectivo, randomizado e controlado que avalia a injeção de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano para o tratamento de úlceras crônicas de pé diabético.

Estudo Prospectivo, Randomizado e Controlado de uma Injeção de Células-Tronco Mesenquimais do Cordão Umbilical Humano no Tratamento de Úlceras do Pé Diabético

Aprenda a injetar células endoteliais derivadas de células-tronco embrionárias em membros posteriores isquêmicos para tratar doença arterial periférica. Este método utiliza imagem de bioluminescência para rastrear células in vivo e avaliar seus efeitos terapêuticos na regeneração vascular.

Embrionárias com células-tronco derivadas de células endoteliais para tratamento da isquemia dos membros posteriores

Explorar mais vídeos