Name: Embrionárias com células-tronco derivadas de células endoteliais para tratamento da isquemia dos membros posteriores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a injetar células endoteliais derivadas de células-tronco embrionárias em membros posteriores isquêmicos para tratar doença arterial periférica. Este método utiliza imagem de bioluminescência para rastrear células in vivo e avaliar seus efeitos terapêuticos na regeneração vascular.

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Os autores agradecem Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, e Stanford Núcleo de Imagem de Pequenos Animais para assistência técnica. Os autores também agradecem AM Bickford, Inc. para suporte de equipamentos veterinários. Esta pesquisa foi suportada por concessões de pesquisa do National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), o Programa de Pesquisa do Tabaco Califórnia Related Disease da Universidade da Califórnia (15IT-0257 e 1514RT-0169) , e do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (RS1-00183). NH é apoiado por uma bolsa da American Heart Association. pode Heart Association.

1. Diferenciação dos CES murino em células endoteliais <ol><li> O protocolo para a diferenciação em células endoteliais CES é descrito em outros lugares e não é o foco deste protocolo 2,3. Resumidamente, as células podem se diferenciar, e as células que são positivas para os marcadores endoteliais, tais como CD31 ou caderina endotelial vascular (VE-caderina) são purificados por separação de células ativadas por fluorescência (FACS). </li></ol> 2. Construção da Double Fusion Gene Reporter e Transdução Lentivirus <ol><li> Bioluminescência pode ser usado para rastrear as células que são modificados para expressar genes repórter, como vaga-lume luciferase (flutuações). Para esta aplicação, as nossas células contêm flutuações e aprimorados fluorescência verde da proteína do gene de fusão (EGFP) sob o controle de um promotor interno ubiquitina. , A fim de modificar as células, o vetor de transgene lentiviral contendo a chave otimizado elementos genéticos para cumprir os critérios de biossegurança, bem como a eficiência de transdução de aumento, UFP-FG vector desenvolvidos em nosso laboratório carregando a flutuações de eGFP gene repórter de fusão podem ser usadas para estável transdução de células após a diferenciação. Esta construção de fusão permite tanto a bioluminescência e rastreamento de fluorescência das células transplantadas. O procedimento para a geração de partículas virais, transdução e produção de células marcadas que os genes repórter expressar é descrito em outra parte 4. </li></ol> 3. Transplante de ESC-derivados de células endoteliais ao hindlimb isquêmica <ol><li> Iniciar o procedimento, preparando um rato que sofreu isquemia hindlimb para o transplante de células. Para fazer isso, coloque o mouse na câmara de indução anestésica contendo 1-3% de isoflurano em oxigênio a 100% a taxa de fluxo de 1l/min. </li><li> Deixe o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução. </li><li> Em seguida, coloque o animal em decúbito dorsal sobre a mesa de operação e conectá-lo a um fluxo contínuo de 1-3% isoflurano em oxigênio a 100% a taxa de fluxo de 1l/min. </li><li> Limpe a pele do membro posterior, com três esfrega alternando betadine e álcool. </li><li> Quando a pele é limpa, obter um milhão ESC derivados de células endoteliais em 30 mL de tampão fosfato (PBS). Carregar essas células em uma agulha de calibre 28. </li><li> Quando as células estão prontos, levante com cuidado e ampliar a hindlimb para melhor visualizar a localização do músculo gastrocnêmio. Enquanto a perna é estendida, insira a agulha através da pele até o músculo subjacente. Tome cuidado para não abordar o osso. Suavemente e injecte lentamente a mistura de células 30 mL para o gastrocnêmio. Por via intramuscular, 30 mL está perto do limite de volume que pode ser injetado. Portanto, calibre 28 seringas de insulina são preferidas porque, em nossa experiência, eles eliminam o volume de perda de agulhas de seringa. </li><li> Após a injeção é completa, devolva o mouse para a gaiola de recuperação e monitorá-lo continuamente até que desperto. Permitir que o animal se recuperar durante várias horas e depois prosseguir com a imagem de bioluminescência vivo das células transplantadas. </li></ol> 4. Imagem de bioluminescência de ESC-derivados de células endoteliais in vivo <ol><li> O transplante de células-ESC derivados endothelials foram modificados para expressar tanto flutuações eo gene de fusão eGFP sob o controle de um promotor interno ubiquitina. Portanto, a bioluminescência pode ser usado para rastrear as células dentro do hindlimb isquêmica. </li><li> Para começar esta etapa, ligue o sistema de imagem de bioluminescência e software Vivendo aquisição de imagens. Em seguida, inicializar o sistema de aquisição e especificar as dimensões do campo de visão. </li><li> Em seguida, coloque papel preto fosco para a caixa de imagem para absorver emissões de fundo. </li><li> Uma vez que a caixa de imagem está pronta, coloque o mouse para dentro da câmara de indução anestésica contendo 1-3% de isoflurano em oxigênio na saída de 1l/min. Deixe o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução. </li><li> Remover os pêlos de ambos os membros posteriores usando um barbeador elétrico, se necessário. </li><li> Injectar 10 mL de D-luciferina por grama de peso corporal para o peritônio. A D-luciferina é preparado com antecedência em soluções estoque filtrada de 15 mg / mL em PBS. </li><li> Uma vez que a luciferina é injetado, coloque o animal na caixa de imagem sobre o papel preto em decúbito dorsal, ligada a um fluxo contínuo de isoflurano. </li><li> Colocando o animal em caixa de imagem e conexão com isoflurano. </li><li> Começar a adquirir imagens de 10-60 segundos a fim de determinar um tempo de exposição ideal para que a imagem não está saturado. Se a imagem se torna saturado, reduzir o tempo de exposição. Se o sinal de bioluminescência é muito fraco, aumente o tempo de exposição. </li><li> Using o tempo de exposição ideal, continue aquisição de imagens a cada 1-3 minutos até que o sinal atinge o máximo e depois se desvanece. Quando a aquisição estiver concluída, salve o arquivo. </li><li> Para analisar os dados, selecionar regiões de interesse (ROIs) que cobrem o local da injeção. Como controle negativo, um ROI semelhante pode ser selecionado para a perna não-operada. Usando o software, medir o brilho total, que é expressa em unidades de fótons / segundo / cm 2 / esterradiano (p / s / cm 2 / sr), para a ROIs para cada ponto no tempo. O valor máximo deve ser usado nos dados finais. Os dados também podem ser exportados para planilha Excel para uso futuro. </li><li> Uma vez que todos os dados são adquiridos, devolver o animal para a gaiola de recuperação e monitorar continuamente até que o desperta animal. </li><li> Repita este procedimento para rastrear as células ao longo do tempo. </li><li> Em um ponto de tempo desejado, o animal pode ser sacrificado para avaliação da função do tecido. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/old/1034_2009_1_22_4/figure 1.png" alt="Figura 1" width="600" height="600" /> Uma imagem de bioluminescência representante de células transplantadas na hindlimb deixou isquêmica é mostrado na Figura 1. Durante a aquisição de bioluminescência, a intensidade vai aumentar com o tempo, eo valor máximo obtido durante o curso do tempo deve ser relatado como o valor final.

<ol><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Murine model of hindlimb ischemia.</a> JoVE. , (2008).</li>
<li>Levenberg, S., Golub, J. S., Amit, M., Itsakovitz-Eldor, J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4391-4396 (2002).</li>
<li>Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., Nakao, K., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flk1-positive+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+serve+as+vascular+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors.</a> Nature. 408, 926-926 (2000).</li>
<li>De, A., Yaghoubi, S. S., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+lentiviral+vectors+in+noninvasive+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Applications of lentiviral vectors in noninvasive molecular imaging.</a> Methods Mol Biol. 433, 177-202 (2008).</li>
<li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li>
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<li>Cao, F., Lin, S., Xie, X., Ray, P., Patel, M., Zhang, X., Drukker, M., Dylla, S. J., Connolly, A. J., Chen, X., Weissman, I. L., Gambhir, S. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+migration+after+cardiac+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> Circulation. 113, 1005-1114 (2006).</li>
<li>Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+bioluminescence+reporter+gene+imaging+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

CES são uma fonte de células promissora para o tratamento da isquemia tecidual devido à sua plasticidade de diferenciação e sua capacidade de dar origem a linhagens de células compreendendo todas as três camadas germinativas, incluindo células endoteliais. Para superar as preocupações éticas associadas com os CES, as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) pode ser uma alternativa de células-tronco pluripotentes fonte que supera as preocupações éticas. Além CES, as células-tronco adultas, como as células progenitoras endoteliais (EPC...

<table><tbody><tr><td>Ferramentas cirúrgicas</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha de seringa</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Recomenda-se uma seringa de insulina 28G</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Reagente</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td>Preparar a D-luciferina com antecedência em soluções estoque filtradas de 15 mg/mL em PBS</td></tr><tr><td>Sistema de imagem de bioluminescência IVIS 200 e software de aquisição</td><td>Equipamento</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Xenogen Corporation</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

embrionárias com células-tronco derivadas de células endoteliais para tratamento da isquemia dos membros posteriores

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Doença arterial periférica (DAP) resulta de estreitamento das artérias periféricas que fornecem o sangue oxigenado e nutrientes para as pernas e pés, esta patologia provoca sintomas tais como claudicação intermitente (dor com a caminhada), dolorosos ulcerações isquêmicas, ou mesmo gangrena dos membros em risco. Acredita-se geralmente que o endotélio vascular, uma monocamada de células endoteliais que reveste a superfície luminal de todos os vasos sangüíneos e linfáticos, desempenha um papel dominante na homeostase vascular e regeneração vascular. Como resultado, a base de células-tronco a regeneração do endotélio pode ser uma abordagem promissora para o tratamento da PAD. Neste vídeo, demonstramos o transplante de células-tronco embrionárias (ESC) derivados de células endoteliais para o tratamento da isquemia hindimb unilateral como um modelo de PAD, seguido por não-invasiva de rastreamento de celular homing e sobrevivência por imagem de bioluminescência. Os materiais e procedimentos específicos para entrega de células e de imagem serão descritas. Este protocolo segue a outra publicação, ao descrever a indução de isquemia por hindlimb Niiyama et al 1.

O procedimento cirúrgico para a entrega de células-tronco embrionárias derivadas de células endoteliais para hindlimb isquêmica é demonstrada, com não-invasivo de monitoramento por imagem de bioluminescência.

Embrionárias com células-tronco derivadas de células endoteliais para tratamento da isquemia dos membros posteriores

A doença arterial periférica (DAP) resulta do estreitamento das artérias periféricas que fornecem sangue oxigenado e nutrientes para as pernas e pés, Isso ...

Doença arterial periférica. A DAP resulta do estreitamento das artérias periféricas que fornecem sangue e oxigênio para as pernas e os pés, levando à disfunção vascular. Para determinar se as células-tronco podem ser usadas para tratar a DAP, injetamos células endoteliais derivadas de células-tronco embrionárias na pata traseira após a indução de isquemia.Como essas células foram modificadas para expressar luciferase de vaga-lume, elas podem ser monitoradas por imagem de bioluminescência para determinar se migram para o local da lesão e exercem efeito terapêutico. Olá, sou John Cook. Sou professor de medicina na divisão de medicina cardiovascular da Universidade Stanford.Nosso laboratório tem interesse em angiogênese e regeneração vascular. Neste vídeo, dois dos meus pós-doutorandos, Dra. Nan Wong e Hir Niyama, irão apresentar procedimentos para transplante terapêutico de células em isquemia de membro traseiro e imagem não invasiva da sobrevivência celular. Esses procedimentos incluem os seguintes passos: a administração de células-tronco embrionárias direcionadas e células estero para o tratamento da isquemia unilateral de membro traseiro e o rastreamento não invasivo da localização celular e sobrevivência por meio de imagem por bioluminescência.Então vamos começar. Inicie o procedimento preparando um camundongo da linhagem SV 1 29 com oito meses de idade que sofreu isquemia de membro posterior para transplante celular. Para isso, coloque o camundongo na câmara de indução anestésica contendo 1 a 3% de isoflurano em oxigênio a 100% com fluxo de um litro por minuto.Deixe o camundongo na câmara de indução até que ele não responda a estímulos externos. Em seguida, remova o animal da câmara de indução. Depois, posicione o animal em posição supina sobre a mesa cirúrgica e conecte-o a um fluxo contínuo de 1 a 3% de ISO em oxigênio a 100%, com uma vazão de um litro por minuto.Limpe a pele da pata traseira com três esfrega&ccedil;&otilde;es alternados de Betadine e &aacute;lcool. Uma vez que a pele esteja limpa, obtenha 1 milh&atilde;o de c&eacute;lulas endoteliais derivadas de c&eacute;lulas-tronco embrion&aacute;rias murinas em 30 microlitros de solu&ccedil;&atilde;o salina tamponada com fosfato. Carregue essas c&eacute;lulas em PBS em uma agulha de calibre 28.Quando as células estiverem prontas, levante e estenda suavemente o membro posterior para visualizar melhor a localização do músculo gastrocnêmio. Enquanto a perna estiver estendida, insira a agulha através da pele até o músculo subjacente. Tenha cuidado para não se aproximar do osso; injete lentamente a mistura de células de 30 microlitros no gastrocnêmio.Para injeção intramuscular, 30 microlitros estão próximos ao limite de volume que pode ser injetado. Portanto, seringas de insulina com agulha 28 são preferidas porque, em nossa experiência, elas eliminam o volume residual nas agulhas das seringas. Após a conclusão da injeção, devolva o camundongo à gaiola de recuperação.Permita que o animal se recupere por várias horas e, em seguida, prossiga com a imagem de bioluminescência in vivo das células transplantadas. As células endoteliais derivadas de ESC transplantadas foram modificadas para expressar tanto o gene da luciferase de vaga-lume quanto o gene de fusão da proteína verde fluorescente melhorada, sob o controle de um promotor interno de ubiquitina. Portanto, a bioluminescência pode ser utilizada para rastrear as células dentro do membro posterior isquêmico.Para iniciar esta etapa, ligue o sistema de imagem de bioluminescência e o software de aquisição de imagem viva. Em seguida, inicialize o sistema de aquisição. Depois, especifique as dimensões do campo de visão.Em seguida, coloque um papel preto fosco dentro da caixa de imagem para absorver a emissão de fundo. Quando a caixa de imagem estiver pronta, coloque o camundongo na câmara de indução anestésica contendo de 1 a 3% de isoflurano em oxigênio, com fluxo de saída de um litro por minuto. Mantenha o camundongo na câmara de indução até que não responda a estímulos externos.Em seguida, retire o animal da câmara de indução. Injete 10 microlitros de Lucifer por grama de peso corporal no peritônio. O luciferina é preparado previamente em soluções estoque filtradas de 15 miligramas por mililitro em PBS.Uma vez injetada a luciferina, posicione o animal na caixa de imagem sobre o papel preto em posição supina, conectado a um fluxo contínuo de fluoreto de isoflurano. Inicie a aquisição de imagens por 10 a 60 segundos para determinar o tempo ótimo de exposição no qual a imagem não esteja saturada. Se a imagem ficar saturada, reduza o tempo de exposição.Se o sinal de bioluminescência for muito fraco, aumente o tempo de exposição. Usando o tempo de exposição ideal, continue adquirindo imagens a cada um a três minutos até que o sinal atinja o máximo e depois desvaneça. Após a conclusão de cada aquisição, salve o arquivo para analisar os dados, selecionando regiões de interesse ou ROI que cubram o local da injeção como controle negativo.Pode-se selecionar uma ROI semelhante para a perna não operada. Utilizando o software, meça a radiação total para as mesmas ROIs em cada arquivo.O valor máximo deve ser utilizado nos dados finais. Os dados também podem ser exportados para uma planilha do Excel para uso futuro. Após a aquisição de todos os dados, devolva o animal à gaiola de recuperação e monitore até que o animal acorde; repita este procedimento para rastrear as células.Com o passar do tempo, em um ponto temporal desejado, o animal pode ser eutanasiado para avaliação da função tecidual. Abaixo, há um curso temporal representativo de imagem de bioluminescência de células transplantadas no membro posterior esquerdo isquêmico, um dia após a injeção das células; a região delimitada em vermelho é a região de interesse (ROI) onde as células foram administradas. A cor correlaciona-se com o número de células transplantadas, em que as cores vermelha e amarela indicam maior intensidade de bioluminescência em comparação com as cores azul e verde.Como é possível observar, o membro controle não apresenta bioluminescência, enquanto o membro injetado com células mostra forte bioluminescência durante a aquisição da imagem. O sinal de bioluminescência na ROI aumentará com o tempo até atingir um valor máximo e, em seguida, diminuirá nesta figura. O valor máximo de bioluminescência, medido pela radiância máxima, é obtido aos 27 minutos a partir do início da aquisição.Esse valor máximo deve ser relatado para a análise dos dados. Nós acabamos de mostrar como administrar e rastrear células derivadas de CSE em células seriadas para o tratamento da isquemia de membro inferior. Este procedimento pode ser precedido pela indução de isquemia de membro inferior, o que é demonstrado em outro vídeo do JoVE por ER et al.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de limitar o volume de células injetadas em PBS a um máximo de 30 microlitros, a fim de evitar o vazamento subcutâneo das células. Além disso, ao adquirir imagens de bioluminescência, evite a saturação da intensidade da imagem com intervalos de exposição muito longos. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

O procedimento cirúrgico para a indução de isquemia hindlimb unilateral é demonstrada, com a confirmação de isquemia por laser Doppler imagens de perfusão.

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Descreve-se o método de células-tronco de programação para superexpressão fatores terapêuticos para angiogênese utilizando nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Processos descritos incluem a síntese do polímero, a transfecção de células estaminais derivadas de tecido adiposo, in vitro, e para validar a eficácia das células estaminais programadas para promover a angiogénese num modelo de isquemia dos membros posteriores de murino.

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