Síntese de Fase Sólida

Solid Phase Synthesis

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Organic Chemistry II

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JoVE Science Education Organic Chemistry II

Solid Phase Synthesis

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09:42 min

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February 22, 2017

Overview

Fonte: Vy M. Dong e Diane Le, Departamento de Química da Universidade da Califórnia, Irvine, CA

A síntese em fase sólida de Merrifield é uma invenção vencedora do Prêmio Nobel onde uma molécula reagente é ligada a um suporte sólido e sofre sucessivas reações químicas para formar um composto desejado. Quando as moléculas estão ligadas a um suporte sólido, reagentes e subprodutos em excesso podem ser removidos lavando as impurezas, enquanto o composto alvo permanece ligado à resina. Especificamente, mostraremos um exemplo de síntese de peptídeos de fase sólida (SPPS) para demonstrar esse conceito.

Principles

A síntese em fase sólida é um método usado para simplificar a síntese das moléculas. É frequentemente usado em química combinatória (técnica usada para preparar um grande número de moléculas em um curto período de tempo), para gerar bibliotecas de compostos devido à facilidade de purificação, e síntese química global. A síntese em fase sólida normalmente envolve o uso de uma resina; um material não solúvel, à base de polímero, que é pré-funcionalizado para que o bloco de construção inicial possa se ligar facilmente. Os blocos de construção são geralmente protegidos uma vez que são adicionados à resina, e eles podem ser facilmente desprotegidos e tratados com o próximo bloco de construção desejado na solução(Figura 1). Uma vez que a molécula desejada tenha sido sintetizada, ela pode ser facilmente cortada da resina.

Por ser robusta, a síntese em fase sólida tem sido usada para sintetizar ácidos nucleicos, oligossacarídeos e, mais comumente, peptídeos. Descoberto e relatado por Robert Bruce Merrifield em 1963, o SPPS tornou-se o método mais utilizado para gerar bibliotecas de peptídeos. Merrifield ganhou o Prêmio Nobel de 1984 pela invenção do SPPS. SpPS pode facilmente tirar proveito de grupos de proteção de Fmoc (base sensível) ou Boc (sensível a ácido)Nnos aminoácidos para construir bibliotecas de peptídeos em um curto espaço de tempo. HBTU (agente de acoplamento) e i-Pr₂EtN (base) ativam o C-terminus do aminoácido para acoplamento com outro aminoácido. Grupos de proteção de afoc podem ser removidos por 4-metilpiperidina, enquanto grupos de proteção de Boc podem ser removidos por ácidos fortes, como o ácido trifluoroacético. Neste experimento, demonstraremos SPPS através da síntese de um dipeptídeo. Usaremos o teste Kaiser, um método qualitativo para testar a presença de aminas primárias, para monitorar o progresso da reação.

Figura 1. Conceito por trás da síntese de peptídeos de fase sólida (SPPS).

Procedure

1. Carregando a resina

Para um vaso de síntese de peptídeos de 100mL, adicione resina de cloreto de clororitil (CTC) de 2ml (1,1 mmol/g, 0,360 g, 0,400 mmol). Adicione 20 mL DMF e deixe-os inchar por 30 minutos sob N_2.
Escorra as contas sob vácuo e adicione 10 mL DMF.
Adicione 500 mg Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) e 2,5 mL i-Pr₂EtN, e misture sob N₂ por 15 min.
Escorra o solvente sob vácuo e repita o carregamento com Fmoc-Ala-OH por 15 min.
Escorra o solvente sob vácuo e lave as contas com 10 mL DMFunder N₂, e escorra sob vácuo 3x.

2. Desproteção do Grupo Fmoc

Adicione 10 mL 20% 4-metilpiperidina em DMF e mexa as contas sob N₂ por 15 minutos.
Escorra o solvente sob vácuo e repita a desproteção.
Lave as contas com 10 mL DMF sob n₂ e escorra sob vácuo 3x.

3. Realizando o Teste Kaiser

Realize o teste Kaiser adicionando 1-2 gotas de solução A (0,5 mL 0,01 M KCN, 24,5 mL pyridine), solução B (1 g ninhydrin, 20 mL n-butanol) e solução C (20 g de fenol, 10 mL n-butanol) cada um em dois tubos de teste. Um tubo de ensaio será o controle, enquanto o outro monitorará a reação.
Adicione algumas contas da resina do vaso de reação ao tubo de ensaio de reação e aqueça os dois tubos de ensaio a 110 °C.
Se a desproteção estiver completa, o conteúdo do tubo de ensaio ficará uma cor azul/roxo escuro. Se a desproteção estiver incompleta ou falhar, a solução permanecerá amarela. Compare o tubo de ensaio de reação com o tubo de teste de controle.

4. Acoplamento dos próximos blocos de construção

Escorra o solvente sob vácuo.
Lave as contas com 10 mL N-metil-2-pyrrolidona sob n₂ e escorra o solvente sob vácuo.
Para iniciar o próximo acoplamento, adicione 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), HBTU de 610 mg (1,6 mmol) e 2,5 mLi-Pr₂EtN, e deixe a resina borbulhar sob n₂ por 30 minutos.
Escorra o solvente sob vácuo.
Lave as contas com 10 mL DMF sob n₂ e escorra sob vácuo 3x.
Realize o teste Kaiser (ver etapas 3.1-3.3) para procurar a conclusão do acoplamento. As contas e a solução no tubo de ensaio devem ser amarelas.

5. Cleaving o Peptídeo Fora da Resina

Adoça o restante do grupo Fmoc utilizando as etapas 2.1-2.3.
Depois que o solvente for drenado sob vácuo, adicione 40 mL de solução de decote (95% TFA, 2,5% H₂O, 2,5% TIPS) à resina e bolha sob N₂ por 3h.
Coloque um novo frasco receptor no sintetizador de peptídeo e escorra a soluçãoTFA contendo o peptídeo desejado sob vácuo no novo frasco.

6. Precipitação e eu solação do Peptídeo

Separe a solução TFA em 4 frascos cônicos e adicione 25 mL de éter frio (−20 °C) a cada frasco para precipitar o peptídeo.
Centrifugar os frascos (3.000 rpm, 0-4 °C) por 20 min. Decante a solução tfa restante e éter dos frascos cônicos e concentre o peptídeo precipitado para pagar o dipeptídeo desejado como um sólido branco.

A síntese de fase sólida é um método no qual o produto é sintetizado enquanto vinculado a um material insolúvel.

A síntese de fase sólida é frequentemente usada para produzir oligômeros biológicos e polímeros como peptídeos, ácidos nucleicos e oligossacarídeos. Essas moléculas são compostas de cadeias de subunidades moleculares menores, chamadas monômeros. Sintetizar um oligômero ou polímero dá muitos passos, pois os monômeros devem ser adicionados na ordem correta.

Um problema com as sintetizações em várias etapas é que a purificação e o isolamento dos produtos estáveis de cada etapa, chamados de produtos intermediários,diminui o rendimento geral. Em síntese de fase sólida, o produto intermediário permanece vinculado ao suporte sólido ao longo da síntese. Isso permite que reagentes, solventes e subprodutos da fase de solução sejam lavados, eliminando a necessidade de purificar e isolar cada produto intermediário entre as etapas.

Este vídeo ilustrará o procedimento para síntese de peptídeos de fase sólida e introduzirá algumas aplicações de síntese de fase sólida em química.

Na síntese em fase sólida, uma molécula é sintetizada em um suporte sólido em uma sequência de reações. Por exemplo, um oligômero ou polímero será sintetizado um monômero de cada vez para formar o produto final. O oligômero ou polímero em crescimento permanece fortemente ligado ao suporte sólido até que seja separado, ou cortado,do suporte com reagentes.

Cada monômero deve ter pelo menos dois locais de ligação para fazer parte da cadeia de polímeros, mas apenas um local de ligação pode estar disponível por vez para garantir que o monômero se ligue ao átomo correto. Isso é conseguido com grupos de proteção, que são grupos funcionais que não são reativos durante uma ou mais etapas da síntese. O local de ligação é restaurado, ou desprotegido,tratando a molécula com reagentes específicos para converter o grupo de proteção em um grupo funcional reativo.

Para iniciar a síntese em fase sólida, o material de partida está vinculado a uma resina especialmente projetada ou polímero insolúvel em seu único local de ligação disponível. Em seguida, o material de partida vinculado é desprotegido para permitir a ligação do segundo monômero na cadeia. Em seguida, adiciona-se uma solução do segundo monômero da cadeia, juntamente com um agente de acoplamento para facilitar a ligação entre os monômeros.

Uma vez que o segundo monômero se liga ao material inicial, o produto intermediário dimeric resultante é desprotegido. Este processo é repetido até que o oligômero ou polímero alvo se forme. O produto é cortado do suporte sólido para a solução, a partir do qual pode ser purificado, isolado e analisado.

A síntese de fase sólida é frequentemente usada para a síntese de peptídeos, que são cadeias de aminoácidos. Os aminoácidos têm um grupo de amina, um grupo carboxyl, e um substituto, ou “cadeia lateral”. A amina é inicialmente protegida. Uma vez desprotegida, a amina forma uma ligação de peptídeo com o grupo carboxíl do próximo aminoácido.

Agora que você entende os princípios da síntese de fase sólida, vamos passar por um procedimento para síntese de peptídeos de fase sólida, no qual demonstraremos a adição dos dois primeiros aminoácidos.

Para iniciar o procedimento, conecte um frasco receptor para resíduos a um vaso de síntese manual de peptídeos de 100 mL. Em seguida, coloque 0,360 g de resina de cloreto de 2 clorororizais no vaso. Conecte uma linha de gás nitrogênio ao sidearm do vaso e uma linha de vácuo ao adaptador de mangueira serrilhada.

Adicione 20 mL de dimetilformamida à resina e deixe as contas de resina incharem por 30 minutos sob um fluxo de gás nitrogênio. Em seguida, aplique vácuo para drenar o solvente.

Adicione 10 mL de DMF, 1,6 mmol de aminoácido protegido por Afoc e 2,5 mL de N,N-diisopropylethylamina ao vaso. Bolha sob o gás nitrogênio, que mistura a solução, por 15 minutos para carregar o aminoácido protegido na resina.

Remova o solvente sob vácuo e realize um segundo carregamento. Depois de remover o solvente, agitar as contas de resina carregada três vezes em porções de 10 mL de DMF, drenando cada lavagem no frasco receptor.

Em seguida, adicione às contas carregadas 10 mL de uma solução de 20% de 4-metilpiperidina em DMF. Misture a mistura por 15 minutos para remover o grupo Fmoc.

Escorra o solvente e repita o procedimento de desproteção. Lave e escorra a resina carregada três vezes, como antes. Armazene as contas sob solvente até que estejam prontas para o próximo passo.

Para verificar se o composto carregado estava completamente desprotegido, primeiro lugar 1 a 2 gotas de cada solução de teste Kaiser em dois tubos de ensaio.

Coloque algumas contas carregadas em um tubo de ensaio e aqueça ambos os tubos a 110 graus em um banho de óleo. A desproteção é completa se a mistura de resina ficar azul escuro para roxo, indicando a presença de grupos de amina na mistura.

Para começar o passo de acoplamento, primeiro lave as contas com 10 mL de NMP sob um fluxo de gás N2.

Em seguida, adicione 10 mL de NMP, 1,6 mmol do aminoácido protegido por Afoc, 1,6 mmol do agente de acoplamento HBTU e 2,5 mL de DIPEA à resina carregada.

Bolha N2 gás através da mistura de resina por 30 minutos, e, em seguida, drenar o solvente. Lave e escorra as contas com porções de 10 mL de DMF três vezes, como antes.

Repita o teste kaiser. O acoplamento ocorreu com sucesso se as contas e a solução ficarem amarelas, indicando que não há grupos de amina presentes.

Em seguida, aperte o novo grupo Fmoc com 20% de 4-metilpiperidina em DMF e lave as contas com porções de 10 mL de DMF. Repita o acoplamento e a desproteção de cada aminoácido restante no peptídeo alvo.

Depois que o último aminoácido tiver sido desprotegido e as contas de resina terem sido lavadas, adicione 40 mL de solução de decote peptídeo para separar o produto peptídeo da resina.

Bolha de gás nitrogênio através da mistura de resina por 3h, e, em seguida, substituir o frasco receptor. Transfira a solução da mistura de resina para o novo frasco receptor sob vácuo.

Para gerar o produto final, remova o solvente com um evaporador rotativo.

A síntese de fase sólida é amplamente utilizada em biologia e química. Vamos ver alguns exemplos.

A síntese em fase sólida abriu muitas novas vias sintéticas para oligossacarídeos, que são cadeias curtas de monômeros de açúcar simples com importantes papéis biológicos, como o armazenamento de energia. Ao contrário das ligações de peptídeos, cada ligação entre açúcares contém um estereótipo. Para sintetizar um oligosacarídeo, não só os monômeros devem estar na ordem correta, mas os laços também devem ter a estereoquímica correta. Técnicas de síntese em fase sólida foram desenvolvidas para acoplar cada monômero por um processo altamente estereoselétrico, que hoje é suficientemente refinado para ser automatizado.

A síntese em fase sólida é uma abordagem comum da química combinatória,que é a prática de sintetizar muitas variantes de um composto em um único processo sintético. A resina carregada pode ser facilmente dividida em porções para reagir com diferentes monômeros ou moléculas. Após cada reação, as porções são lavadas e recombinadas. Isso se repete até que o número desejado de produtos tenha sido gerado. Esta técnica é particularmente útil em pesquisas farmacêuticas, pois pode ser usada para gerar novos compostos ou para avaliar a reatividade de um composto com uma ampla gama de moléculas.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à síntese de fase sólida. Agora você deve entender os princípios subjacentes da síntese de fase sólida, o procedimento para a síntese de peptídeos de fase sólida, e alguns exemplos de como a síntese de fase sólida é usada na química orgânica. Obrigado por assistir!

Results

Resultados representativos para a síntese de peptídeos de fase sólida para o Procedimento 3.

Etapa do procedimento	Cor da solução
3.1	Controle – Amarelo claro e claro Reação – Amarelo claro e claro
3.2	Controle – Amarelo claro e claro Reação – Azul escuro
3.3	Solução azul escuro, azul das contas – desproteção completa ou falha no acoplamento Incolor, contas amarelas – desproteção falha ou completa Solução incolor, contas vermelhas – acoplamento incompleto ou desproteção incompleta

Mesa 1. Resultados representativos para Procedure 3.

Applications and Summary

Neste experimento, demonstramos um exemplo de síntese em fase sólida via SPPS através da síntese de um dipeptídeo.

A síntese em fase sólida é amplamente utilizada na química combinatória para construir bibliotecas de compostos para triagem rápida. Tem sido comumente usado para sintetizar peptídeos, oligossacarídeos e ácidos nucleicos. Além disso, esse conceito foi implementado na síntese química. Por ser heterogêneo, esses reagentes de suporte sólido podem muitas vezes ser reciclados e reutilizados em reações subsequentes.

Transcript

Solid phase synthesis is a method in which the product is synthesized while bound to an insoluble material.

Solid phase synthesis is often used to produce biological oligomers and polymers such as peptides, nucleic acids, and oligosaccharides. These molecules are composed of chains of smaller molecular subunits, called monomers. Synthesizing an oligomer or polymer takes many steps, as the monomers must be added in the correct order.

An issue with multi-step syntheses is that purification and isolation of the stable products of each step, called intermediate products, decreases the overall yield. In solid phase synthesis, the intermediate product remains bound to the solid support throughout synthesis. This allows solution-phase reagents, solvents, and byproducts to be washed away, eliminating the need to purify and isolate each intermediate product between steps.

This video will illustrate the procedure for solid phase peptide synthesis and introduce a few applications of solid phase synthesis in chemistry.

In solid-phase synthesis, a molecule is synthesized on a solid support in a sequence of reactions. For instance, an oligomer or polymer will be synthesized one monomer at a time to form the final product. The growing oligomer or polymer remains strongly bound to the solid support until it is separated, or cleaved, from the support with reagents.

Each monomer must have at least two binding sites to be part of the polymer chain, but only one binding site can be available at a time to ensure that the monomer binds to the correct atom. This is achieved with protecting groups, which are functional groups that are not reactive during one or more steps of the synthesis. The binding site is restored, or deprotected, by treating the molecule with specific reagents to convert the protecting group to a reactive functional group.

To begin solid-phase synthesis, the starting material is bound to a specially designed resin or insoluble polymer at its only available binding site. Then, the bound starting material is deprotected to allow binding of the second monomer in the chain. Next, a solution of the second monomer in the chain is added, along with a coupling agent to facilitate bonding between the monomers.

Once the second monomer binds to the starting material, the resulting dimeric intermediate product is deprotected. This process is repeated until the target oligomer or polymer has formed. The product is cleaved from the solid support into solution, from which it can be purified, isolated, and analyzed.

Solid phase synthesis is often used for the synthesis of peptides, which are chains of amino acids. Amino acids have an amine group, a carboxyl group, and a substituent, or ‘side chain’. The amine is initially protected. Once deprotected, the amine forms a peptide bond with the carboxyl group of the next amino acid.

Now that you understand the principles of solid phase synthesis, let’s go through a procedure for solid phase peptide synthesis, in which we will demonstrate the addition of the first two amino acids.

To begin the procedure, connect a receiving flask for waste to a 100-mL manual peptide synthesis vessel. Then place 0.360 g of 2-chlorotrityl chloride resin into the vessel. Connect a nitrogen gas line to the vessel sidearm and a vacuum line to the serrated hose adapter.

Add 20 mL of dimethylformamide to the resin and allow the resin beads to swell for 30 min under a flow of nitrogen gas. Then, apply vacuum to drain the solvent.

Add 10 mL of DMF, 1.6 mmol of an Fmoc-protected amino acid, and 2.5 mL of N,N-diisopropylethylamine to the vessel. Bubble under the nitrogen gas, which mixes the solution, for 15 min to load the protected amino acid onto the resin.

Remove the solvent under vacuum and perform a second loading. After removing the solvent, agitate the loaded resin beads three times in 10-mL portions of DMF, draining each wash into the receiving flask.

Next, add to the loaded beads 10 mL of a 20% solution of 4-methylpiperidine in DMF. Bubble the mixture for 15 min to remove the Fmoc group.

Drain the solvent and repeat the deprotection procedure. Wash and drain the loaded resin three times, as before. Store the beads under solvent until they are ready for the next step.

To verify that the loaded compound was completely deprotected, first place 1 to 2 drops of each Kaiser test solution in two test tubes.

Place a few loaded beads in a test tube and heat both tubes to 110 degrees in an oil bath. Deprotection is complete if the resin mixture turns dark blue to purple, indicating the presence of amine groups in the mixture.

To begin the coupling step, first wash the beads with 10 mL of NMP under a flow of N2 gas.

Then, add 10 mL of NMP, 1.6 mmol of the next Fmoc-protected amino acid, 1.6 mmol of the coupling agent HBTU, and 2.5 mL of DIPEA to the loaded resin.

Bubble N2 gas through the resin mixture for 30 minutes, and then drain the solvent. Wash and drain the beads with 10-mL portions of DMF three times, as before.

Repeat the Kaiser test. Coupling has occurred successfully if the beads and solution turn yellow, indicating that no amine groups are present.

Next, cleave the new Fmoc group with 20% 4-methylpiperidine in DMF and wash the beads with 10-mL portions of DMF. Repeat the coupling and deprotection for each remaining amino acid in the target peptide.

After the last amino acid has been deprotected and the resin beads have been washed, add 40 mL of peptide cleavage solution to separate the peptide product from the resin.

Bubble nitrogen gas through the resin mixture for 3 h, and then replace the receiving flask. Transfer the solution from the resin mixture to the new receiving flask under vacuum.

To generate the final product, remove the solvent with a rotary evaporator.

Solid phase synthesis is widely used in biology and chemistry. Let’s look at a few examples.

Solid-phase synthesis opened many new synthetic pathways to oligosaccharides, which are short chains of simple sugar monomers with important biological roles, such as energy storage. Unlike peptide bonds, each bond between sugars contains a stereocenter. To synthesize an oligosaccharide, not only must the monomers be in the correct order, but the bonds must also have the correct stereochemistry. Solid-phase synthesis techniques were developed to couple each monomer by a highly stereoselective process, which today is sufficiently refined to be automated.

Solid-phase synthesis is a common approach to combinatorial chemistry, which is the practice of synthesizing many variants of a compound in a single synthetic process. The loaded resin can easily be split into portions to react with different monomers or molecules. After each reaction, the portions are washed and recombined. This is repeated until the desired number of products has been generated. This technique is particularly useful in pharmaceutical research, as it can be used to generate new compounds or to evaluate the reactivity of a compound with a wide array of molecules.

You’ve just watched JoVE’s introduction to solid phase synthesis. You should now understand the underlying principles of solid phase synthesis, the procedure for solid phase peptide synthesis, and a few examples of how solid phase synthesis is used in organic chemistry. Thanks for watching!

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