Modelo murino de isquemia dos membros posteriores

Na doença arterial periférica dos Estados Unidos, a DAP afeta cerca de 10 milhões de indivíduos em particular, fumantes, diabéticos e pessoas com mais de 70 anos. O objetivo geral desta cirurgia é induzir isquemia de membros posteriores ligando os segmentos proximal e distal da artéria femoral. O procedimento começa com a anestesia, o barbear e o posicionamento do mouse na mesa cirúrgica em decúbito dorsal.

Em seguida, é feita uma incisão na pele do joelho em direção à coxa medial, expondo a artéria femoral subjacente. Em seguida, a artéria femoral é cuidadosamente separada da veia femoral. Nós duplos são feitos no local da ligadura distal, bem como no local da ligadura proximal.

O segmento da artéria femoral é então excisado. O local da incisão é fechado por suturas e o animal pode se recuperar da anestesia. Para confirmar a indução de isquemia de membros posteriores, o camundongo anestesiado é colocado em decúbito dorsal.

Em seguida, ambos os membros posteriores são escaneados pelo laser doppler. A imagem é então salva e avaliada para perfusão. Olá, sou John Cook.

Sou professor de medicina aqui na divisão de medicina cardiovascular da Universidade de Stanford. Nosso laboratório está interessado em angiogênese e regeneração vascular. Neste vídeo, dois de meus colegas de pós-doutorado, Dr. Nan Wong e Hir Niyama, apresentarão a preparação de isquemia de membros posteriores de Muren, que é um modelo importante para doença arterial periférica e frequentemente usado em nosso laboratório para avaliar os efeitos de fatores de crescimento e terapia celular na angiogênese.

Usamos esses procedimentos em nosso laboratório para estudar o efeito de células-tronco derivadas de células-tronco endoteliais para reparo vascular. Então, vamos começar. As ferramentas cirúrgicas necessárias para esta operação incluem pinças pontiagudas, pinças pontiagudas, tesouras de mola, tesouras cirúrgicas, porta-agulhas e afastadores.

Fabricamos nosso próprio afastador usando um clipe de papel porque é menor do que o disponível comercialmente. Os afastadores esterilizam essas ferramentas antes da cirurgia com um esterilizador de esferas quentes, uma ferramenta de cautério e cotonetes estéreis de ponta fina também serão necessários para esta cirurgia. Quando as ferramentas estiverem prontas, coloque o mouse na câmara de indução de anestesia contendo um a 3% de iso de flúor em cem por cento de oxigênio a uma taxa de fluxo de um litro por minuto.

Deixe o mouse na câmara de indução até que ele não responda a estímulos externos. Em seguida, remova o animal da câmara de indução. Em seguida, coloque o animal em decúbito dorsal na mesa de pré-operação e conecte-o a um fluxo contínuo de isoflurano.

Usando um barbeador elétrico, remova os pelos do membro posterior. Aplique creme depilatório para remover completamente os pelos. Depois de raspar o mouse, estenda e prenda o membro posterior com um pedaço de fita adesiva.

Quando o membro posterior estiver seguro, limpe a pele com três esfoliantes alternados de Betadine e álcool. Usando pinças finas e tesouras cirúrgicas, faça uma incisão na pele com aproximadamente um centímetro de comprimento do joelho em direção à coxa medial usando solução salina tamponada com fosfato. Cotonetes PBS úmidos e pontiagudos definidos.

Escove suavemente o tecido adiposo subcutâneo ao redor do músculo da coxa. Em seguida, aplique o cautério transversalmente em tamanhos e disseque através do tecido adiposo subcutâneo para revelar a artéria femoral subjacente. Em seguida, use um afastador para abrir a ferida e obter uma melhor visão da vasculatura da extremidade inferior.

Usando uma pinça fina em um cotonete pontiagudo, perfure suavemente a bainha femoral membranosa para expor o feixe neurovascular. Em seguida, usando um conjunto limpo de pinças finas e cotonete, disseque e separe a artéria femoral da veia e do nervo femoral no local proximal próximo à virilha. Após a dissecção, passe um fio de sutura de seda de sete oh sob a extremidade proximal da artéria femoral.

Ocluir a artéria femoral proximal usando nós duplos. Coloque a amarração no vaso o mais proximal possível na ferida para deixar o comprimento para a segunda amarração e um segmento intermediário que será seccionado. Separe a artéria femoral da veia femoral no local distal próximo ao joelho.

Passe um fio de sete oh sutura sob a extremidade distal da artéria femoral proximal à artéria poplítea. Ocluir a embarcação usando nós duplos. Oclua a artéria femoral distal com um segundo conjunto de nós duplos logo proximal ao primeiro conjunto de nós.

Este segundo conjunto de suturas será usado para agarrar a artéria durante o procedimento de transação. Da mesma forma, para fins de preensão, oclua a artéria fal proximal com o segundo conjunto de nós duplos imediatamente distal ao primeiro conjunto de nós. Passe o segmento da artéria femoral entre os nós distal e proximal com um cotonete fino e pontiagudo e uma tesoura de mola.

Tenha cuidado para não perfurar a parede da veia femoral. Remova o afastador e feche a incisão usando cinco suturas oh quil. Assim que a incisão estiver fechada, retorne o animal à gaiola de recuperação e monitore até acordar Depois que o animal se recuperar por uma hora, prossiga com a perfusão sanguínea doppler a laser.

Etapa para confirmar a indução da isquemia. Para iniciar a etapa de perfusão doppler a laser, coloque o camundongo na câmara de indução de anestesia contendo um a 3% de iso de flúor em cem por cento de oxigênio a uma taxa de fluxo de um litro por minuto. Deixe o mouse na câmara de indução até que ele não responda a estímulos externos.

Em seguida, retire o animal da câmara de indução e coloque-o na mesa de pré-operação conectada ao fluxo contínuo de isof flúor. Em seguida, remova os pelos do membro posterior usando um barbeador elétrico seguido de creme depilatório, conforme necessário. Depois de remover os pelos, coloque o animal em uma superfície aquecida a 37 graus Celsius por cinco minutos sob fluxo contínuo de flúor iso.

Após cinco minutos, coloque o animal em decúbito dorsal sobre uma superfície absorvente de luz não reflexiva, como um pano de cor verde conectado a um fluxo contínuo de iso flúor. Estenda os membros posteriores. Em seguida, ligue o gerador de imagens doppler a laser e o software de aquisição e inicialize o software.

Especifique o tamanho do campo de visão e resolução. É melhor manter o campo de visão e a densidade de pixels consistentes entre os animais. Para facilitar a análise futura, abra um novo arquivo.

Pressione start para começar a adquirir os dados da imagem. Quando solicitado, especifique a distância do animal até o gerador de imagens. O laser mostrará as bordas do campo de visão e, em seguida, começará a adquirir dados.

Após a conclusão da aquisição, a imagem começará a mostrar uma gama de cores indicativas do nível de profusão de sangue nas pernas. As cores podem ser definidas para uma faixa de profusão específica. Para comparar melhor os dados entre os animais quando a aquisição de dados estiver concluída, salve o arquivo, retorne o animal à gaiola de recuperação e monitore o animal continuamente até acordar.

Para analisar os dados, use o ajuste de limite no software de análise para subtrair qualquer ruído de fundo. Um limite de 0,2 geralmente é um valor razoável. Selecione duas regiões de interesse ou ROIs que cubram cada área dos membros posteriores.

Uma variedade de pontos de referência pode ser usada para padronizar a ROI entre membros e animais e, em seguida, determinar a perfusão média e a variabilidade na ROI. A diferença de perfusão e a taxa de perfusão entre o membro isquêmico e o membro controle podem ser facilmente determinadas. Este procedimento pode ser repetido para acompanhar as alterações na perfusão dos membros posteriores.

Com o tempo, em um ponto de tempo desejado, o animal pode ser sacrificado para avaliação da função tecidual. Em comparação com os dados da imagem de perfusão, um diagrama representativo do membro posterior após a explicação da artéria femoral é mostrado aqui. As suturas marcam a localização dos locais de ligadura proximal e distal.

Quando a cirurgia é realizada com cuidado, há sangramento mínimo e a cirurgia pode ser concluída em menos de uma hora. E aqui estão os resultados da análise da imagem de perfusão doppler a laser. A imagem à esquerda mostra a profusão de ambos os membros antes da indução isquêmica.

Enquanto a imagem à direita mostra a profusão de ambos os membros. Após o membro esquerdo ter sido submetido à indução isquêmica. A intensidade da cor na imagem indica a quantidade de fluxo sanguíneo.

Em comparação com o membro controle, o membro isquêmico mostra muito pouca cor, o que sugere uma redução dramática no fluxo sanguíneo. Usando esses dados, o software pode quantificar a perfusão média no membro isquêmico e controle para determinar a diferença de perfusão e a taxa de perfusão. Portanto, esses resultados confirmam a indução de isquemia para o membro posterior.

Acabamos de mostrar como induzir isquemia unilateral de membros posteriores no modelo de camundongo e confirmar a indução de isquemia por profusão de sangue com Doppler a laser. O modelo de isquemia de membros posteriores com análise de imagem com laser doppler é um excelente sistema para o estudo de patologias vasculares e para a avaliação de candidatos terapêuticos. Este procedimento pode ser seguido pelo transplante e rastreamento não invasivo de células, o que é demonstrado em outro vídeo jve de Huang et al.

Ao fazer esses procedimentos, é importante lembrar de ter cuidado para não perfurar a parede da veia femoral ao extirpar a artéria femoral com uma tesoura de entorse. Use também local de ligadura semelhante para todos os animais do experimento para consistência do modelo de alta isquemia. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.