Fabricação de eletrodos amperométrica

Este protocolo descreve como gerar eletrodos de fibra de carbono. Primeiro, preencheremos as capilares de vidro com fibras de carbono das quais o revestimento foi removido. Em seguida, puxaremos o conjunto capilar com fibra para formar dois eletrodos e cortaremos a fibra.

Em seguida, organizaremos os eletrodos para mergulhá-los na resina epóxi. Para selar a fibra no eletrodo, armazenaremos os eletrodos de fibra em uma grade dentro de uma estufa aquecida. Esses eletrodos são posteriormente utilizados para detectar a liberação de catecolaminas de vesículas em células individuais com fibra de carbono e barometria.

Gravações bem-sucedidas apresentam baixo ruído e picos ascendentes bem definidos no traçado da gravação. Olá, sou Carrie Pike do laboratório da Dra. Amy Harkins, do Departamento de Ciência Farmacológica e Fisiológica da Escola de Medicina da Universidade de St. Louis. Vou mostrar um procedimento para gerar eletrodos de fibra de carbono com baixo ruído, a serem utilizados em pirografia para medir a liberação de catecolaminas de células individuais.

Vamos começar a preparar as fibras de carbono para a fabricação dos eletrodos. Primeiro, corte um feixe de fibras de carbono em um comprimento aproximadamente 1,25 vezes o comprimento da pipeta capilar na cabine de segurança. Remova o revestimento fervendo cerca de 100 mililitros de acetona em um recipiente e adicionando as fibras à acetona quente em ebulição por 30 minutos ou mais.

Após ferver, remova as fibras da acetona aquecida e transfira-as para um béquer limpo contendo de 50 a cem mililitros de acetona fresca. Transfira as fibras novamente para uma folha de papel alumínio, que pode ser retirada da cabine de segurança. Seque as fibras colocando o feixe sobre uma placa de Petri aberta de 150 milímetros e deixando as fibras de carbono secarem ao ar durante a noite.

Agora que as fibras de carbono estão preparadas, prossiga para o preparo dos tubos capilares de vidro para polir as extremidades com chama. Utilize tubos capilares de vidro micro-hematocrito, com 7,5 centímetros de comprimento, diâmetro externo de 1,5 milímetro e diâmetro interno de 1,3 milímetro. Segure o tubo no centro e exponha uma das extremidades à chama.

Gire o tubo cerca de três vezes enquanto ele estiver na chama. Inverta o tubo e coloque a extremidade oposta na chama, girando novamente três vezes. Ambas as extremidades do tubo capilar agora estão polidas pelo fogo.

Coloque os tubos com bordas arredondadas pelo fogo em uma bandeja de vidro e transfira-os para o forno até que estejam prontos para serem preenchidos com fibras de carbono. Antes de começar a inserir uma fibra de carbono em um tubo capilar, certifique-se de usar uma máscara facial de proteção. Em seguida, use uma tubulação de plástico conectada a um vácuo com filtro para puxar a fibra para dentro do tubo de vidro.

Em seguida, corte a fibra usando um bisturi. Certifique-se de deixar um quarto de polegada de fibra para fora em ambas as extremidades do tubo. A fibra de carbono com rosca está agora pronta para ser puxada a fim de formar o eletrodo de fibra para pipeta.

Coloque o tubo capilar no eletrodo polar e aperte os botões para fixar o tubo capilar no lugar. Em seguida, ajuste o polar nas configurações ideais e manipule as chaves para executar dois polos. Uma vez que a pipeta seja puxada ao meio, separe as duas metades cortando a fibra nua no centro.

Usando tesoura, remova cada metade do eletrodo e puxe a fibra saliente para romper a vedação de vidro. Corte a fibra com tesoura de modo que apenas um oitavo de polegada da fibra permaneça fora do tubo.

Repita esses passos até obter cerca de 16 eletrodos. Os eletrodos de fibra são puxados antes de prosseguir para o selamento dos eletrodos, a fim de criar o selo de vidro com epóxi. Primeiro, aqueça uma alíquota pré-fabricada de epóxi em uma placa aquecedora regulada em 55 graus Celsius por seis minutos em uma cabine de exaustão. Enquanto o epóxi estiver aquecendo, enrole cerca de 16 dos eletrodos puxados em um feixe.

Após aquecer a epóxi por seis minutos, utilize fita adesiva para adicionar 0,7 gramas de endurecedor à epóxi quente. Misture isso girando o vial. Mergulhe o feixe de eletrodos na solução de epóxi quente mais endurecedor.

Mergulhe o feixe duas vezes a cada vez por cerca de cinco segundos, para que uma quantidade suficiente de epóxi penetre nas pontas de vidro por ação capilar. Desfaça o feixe e coloque os eletrodos em um suporte de papelão com ranhuras. Coloque esta bandeja em um forno regulado em 100 graus Fahrenheit.

Após pelo menos 48 horas, examine cada eletrodo sob um microscópio estereoscópico. Descarte os eletrodos que não foram preenchidos com epóxi. Tenha uma ponta esmagada.

Têm mais de uma fibra ou não podem ser usadas por outros motivos. Após inspecionar cada eletrodo, coloque-os de volta no suporte de papelão e devolva-os ao forno. Os eletrodos geralmente são utilizáveis por cerca de um mês após a fabricação e exigem o corte da fibra de carbono antes de serem usados em pirômetria em uma célula.

Para cortar a fibra de carbono, coloque cuidadosamente o eletrodo de fibra de carbono sobre uma lâmina de vidro com fita de teflon. Visualize a ponta sob um microscópio estereoscópico. Em seguida, use uma lâmina de bisturi limpa para cortar perpendicularmente à fibra de carbono, deixando uma superfície plana e limpa para o posicionamento da fibra de carbono contra uma célula.

Imediatamente antes das gravações. Encha a capilar com cloreto de potássio 3 molar usando uma seringa de enchimento e certifique-se de secar a extremidade oposta à fibra, para remover o excesso de sal.

Coloque o eletrodo sobre o pellet de prata, cloreto de prata do suporte do eletrodo. Conectado eletricamente ao estágio da cabeça da pirometria. Aperte o suporte do eletrodo para manter o eletrodo estável.

Posicione o eletrodo adjacente à célula e prossiga para o registro de eventos métricos de RO. Este protocolo descreve como gerar e cortar eletrodos tric. Durante as gravações tric, um eletrodo de fibra de carbono é colocado contra a superfície de uma célula secretora.

A atividade exocitótica é observada como picos tríplices, o que indica a corrente eletroquímica causada pela transferência de elétrons após a oxidação das catecolaminas. Com a prática na confecção e corte de eletrodos métricos EmPro, os níveis de ruído podem ser grandemente melhorados em comparação com muitos dos eletrodos disponíveis comercialmente. Acabei de mostrar como fabricar e parametrizar eletrodos de fibra de carbono ao realizar este procedimento.

É importante prestar muita atenção aos detalhes do protocolo para obter eletrodos consistentes e com baixo ruído. Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.