Um sistema de acoplamento magnético para Investigar controle de vôo visual e olfativo Mediated em Drosophila

O crescente campo da olfação em Drosophila motivou ensaios comportamentais cada vez mais sofisticados, como o aparato olfativo com pino magnético ou OMT. Este procedimento envolve colar o tórax dorsal da mosca em um pino de mnuchin. A mosca é suspensa em um ângulo de 30 graus com o pino em uma inclinação adequada, e então alinhada entre dois ímãs de terras raras.

Quando feito corretamente, isso resultará em uma amplitude de movimento livre. Uma porta de odor é então alinhada para produzir uma pluma que passa suavemente do bico de entrega sobre a cabeça da mosca até a câmara de vácuo. A capacidade da mosca de localizar o odorante é então testada na presença de estímulos visuais.

Olá, sou Brian DeMars do laboratório do Dr. Mark Fry, do Departamento de Ciência Fisiológica da Universidade da Califórnia, Los Angeles. Hoje vamos mostrar como prender moscas para utilização em um aparato magnético com tornozeleira olfativa. Também mostraremos como alinhar os ímãs e as portas de odor, além de ajustar as taxas de fluxo mássico para o sistema de entrega de odor.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o controle de voo mediado por estímulos visuais e olfativos em moscas-das-frutas. Então, vamos começar. Para iniciar o aprisionamento, colete moscas com quatro a seis dias após a emergência dos adultos (ELOs) e as prive de alimento por quatro a seis horas.

Em um frasco de lista de alimentos contendo um lenço de papel umedecido para prevenir a dessecação, transfira em seguida um lote de moscas marcadas para um frasco pequeno inserido em um bloco de latão sobre uma plataforma de resfriamento peltier ajustada a quatro graus Celsius. A essa temperatura, as moscas ficarão anestesiadas em aproximadamente 30 segundos.

Coloque uma toalha de papel Kim sobre a platina de resfriamento para absorver a umidade. Em seguida, coloque as moscas anestesiadas sobre a platina para separação e selecione as fêmeas maiores para fixação. Usando um pincel fino, posicione uma única mosca dentro do sarcófago personalizado, moldado para acomodar uma única mosca-das-frutas fêmea do tipo selvagem.

Agora, use o microscópio para garantir que a mosca esteja corretamente posicionada com o lado dorsal para cima. A extremidade anterior da mosca deve estar voltada para você e a posterior, afastada de você. Em seguida, posicione um alfinete minuchin com uma haste magnética montada em um micromanipulador.

O pino deve ser alinhado com a extremidade romba voltada para o tórax dorsal da mosca. Isso fica logo atrás da cabeça, entre as duas asas. A mosca deve ser posicionada corretamente sobre o pino ao longo de três eixos.

O ângulo de guinada, o rolamento e o ângulo de guinada do pino devem estar perfeitamente verticais quando observados de frente, em direção aos olhos; mesmo uma pequena quantidade de rolamento entre a mosca e o pino não pode ser tolerada. O ângulo de visão lateral entre o pino e o eixo longo do corpo, ou ângulo de arfagem, deve formar um ângulo ascendente de 30 graus em relação ao horizonte. Tenha em mente que o pino pode precisar ser aparado para um funcionamento ideal do suporte.

Isso dependerá da distância entre os ímãs de suspensão. Uma vez alinhado o pino mnuchin, use um fio fino de aço para aplicar uma pequena gota de cola ativada por UV na extremidade romba do pino mnuchin. Em seguida, manipule o pino de modo que a gota de cola toque o tórax da mosca logo acima da cabeça.

Tenha cuidado para não usar cola em excesso. Com o tamanho adequado da gota, a cola deve formar uma pequena protuberância e fluir do pino para o tórax. Em seguida, polimerize a cola com duas rajadas de luz UV de 22°.

Após a conclusão da fixação, entregue manualmente um pequeno quadrado de lenço Kim a cada mosca usando pinças, devido ao reflexo instintivo de pouso. As moscas agarrarão os lenços Kim. Após uma hora de recuperação, as moscas fixadas estarão prontas para os experimentos.

Para obter um movimento suave em um alcance de 360 graus, é fundamental alinhar corretamente os ímãs. Para isso, segure os ímãs do anel inferior na posição horizontal com uma luva de plástico e coloque-os diretamente sobre uma câmara de vácuo transparente. O ímã cilíndrico superior é fixado verticalmente a aproximadamente três quartos de polegada acima dos ímãs inferiores, e um rolamento duplo em V é preso com epóxi à superfície inferior do ímã superior.

Isso padronizará a posição da mosca e minimizará o atrito rotacional. Tenha em mente que esses ímãs podem ser perigosos e seu uso incorreto pode resultar em danos ao equipamento ou lesões corporais leves. Em seguida, alinhe aproximadamente os ímãs superior e inferior visualmente.

Ao posicionar o ímã cilíndrico superior diretamente acima do ponto central dos ímãs anelares inferiores, será útil fixar o ímã superior a um micromanipulador para ajustes em escala fina. Agora, coloque uma mosca na arena e ajuste a posição horizontal e vertical do ímã superior até que a mosca consiga girar suave e continuamente 360 graus. No início de cada experimento, cada mosca deve ser verificada quanto à rotação suave, para garantir que os ímãs estejam corretamente alinhados e que os pinos mnuchin não estejam danificados. Se a montagem estiver incorreta, a mosca pode não girar em absoluto.

Pode ter amplitude de movimento restrita ou pode girar em velocidades inconsistentes. Isso pode ser um problema com a cola, o que pode ser testado girando uma grade listrada na frente da mosca para provocar uma resposta omo. Se a mosca não girar ou girar de forma inconsistente, substitua-a por outra mosca.

Se esta mosca não girar corretamente e esses problemas ocorrerem em todas as moscas, então o problema provavelmente se deve ao alinhamento dos ímãs, sendo necessários ajustes adicionais para obter um odor estável. O rastreamento da configuração inicial do sistema de odor exigirá a instalação de tubos de teflon de diâmetro estreito, conectando o multiplexador de gás aos frascos personalizados de odor aquoso. A saída desses frascos deve ser conectada diretamente aos tubos de porta hipodérmica utilizando o mesmo tubo de teflon.

Em seguida, uma câmara de vácuo de acrílico transparente é posicionada sob a arena para sustentar os ímãs. Utilize um tubo de vidro de quatro milímetros montado abaixo da mosca e conectado à câmara de vácuo para aproximar a abertura do vácuo da mosca e reduzir o diâmetro da abertura. Agora, coloque uma mosca presa na arena usando pinças.

Uma vez que a mosca esteja posicionada, ligue um odor atrativo. Você pode verificar visualmente se a mosca se dirige à posição da porta de odor quando o odor é ativado. Se a mosca parecer não ter preferência pelo odor, use tentativa e erro para otimizar o OMT.

Para fazer isso primeiramente, ajuste a posição do orifício de odor até que a mosca pareça rastrear o odor. Aqui, os orifícios de odor são montados em micromanipuladores e posicionados quatro milímetros dorsalmente e três milímetros anteriormente à cabeça da mosca. Se alterar a posição do orifício de odor não melhorar o rastreamento do odor, ajuste a taxa de fluxo mássico até que a mosca pareça rastrear o odor.

Utilizamos configurações de sete mililitros por minuto. Se ajustar a taxa de fluxo mássico não melhorar o rastreamento do odor, ajuste a taxa de fluxo do vácuo até que a mosca pareça rastrear o odor. Configuramos a taxa de fluxo do vácuo em 13 litros por minuto usando um regulador de fluxo.

Uma vez definida a posição da porta e as taxas de fluxo, alterne periodicamente entre a entrega de vapor de água e vapor de odor utilizando um multiplexador de gás comutável. Se você montou seu equipamento corretamente, deve observar duas coisas. Primeiro, sob estímulos visuais rotativos constantes, uma mosca presa colocada no TMO deve girar suavemente 360 graus no eixo vertical ou eixo ya; movimentos bruscos chamados kos são característicos do comportamento de virada espontânea na ausência de estímulos visuais constantes.

Se as moscas não conseguirem girar suavemente, a colagem inadequada e ímãs desalinhados podem ser os responsáveis. Em segundo lugar, você também deve observar que, quando o odor é ligado, a mosca deve se dirigir na direção da porta de odor. Quando o odor é desligado, a mosca deve girar espontaneamente sem preferência por qualquer posição na arena.

Se as moscas não rastrearem ativamente o filete de odor, isso pode indicar a necessidade de ajustar a posição do orifício de odor, a taxa de fluxo de ar e/ou a taxa de fluxo de vácuo. Acabamos de mostrar como imobilizar uma mosca para uso em um aparato de fixação magnética olfativa. Também mostramos como alinhar corretamente os ímãs e os orifícios de odor, além de como definir as taxas de fluxo mássico para o sistema de entrega de odor.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.