Micro-drive Array para Crônica In vivo: Assembléia Tetrodo

Neste protocolo, descrevemos a fabricação e instalação de feixes Tetro compostos por quatro eletrodos para registros crônicos in vivo em roedores acordados, iniciando a fabricação do tetro. Um filamento de fios microeletrodos é dobrado duas vezes sobre si mesmo para formar um feixe de quatro fios paralelos. Em seguida, esses fios são torcidos juntos e infundidos com uma pistola de ar quente.

Cada tero finalizado é colocado em uma caixa de armazenamento. Enquanto mais teros são fabricados, cada tero é inserido por uma via dedicada que entra por uma abertura em um atuador linear e sai pela base do conjunto de microeletrodos. Cada um dos quatro fios do tero é conectado a pinos separados em uma placa conectora de saída fixada na parte superior do conjunto de microeletrodos.

A impedância de cada canal do tero é reduzida por meio de um processo de galvanoplastia com ouro. Após a instalação e galvanoplastia de todos os teros, dois fios de terra são conectados aos pinos correspondentes na placa do conector, e um cone protetor é fixado à estrutura do conjunto de microacionadores Tero para proteção após o aterramento do cone. Conjuntos de microacionadores Tero funcionais prontos para implante. Olá, sou Dave Nian do laboratório de Nat Wilson no Instituto Pickout para Aprendizado e Memória.

No MIT hoje, vamos mostrar um procedimento para fabricar teros, carregar teros e concluir as etapas finais da reconstrução da microplataforma. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a atividade neural coordenada entre grandes populações de neurônios em preparações de animais acordados e em comportamento. Então, vamos começar.

Para construir o tero para nossa matriz de microdrive padrão, começamos com um comprimento de 50 centímetros de fio microme isolado de 12 mícrons. Dobre o fio ao meio e passe os dedos ao longo do par para fazê-los aderir. Certifique-se de que o par de fios tenha bom contato ao longo de todo o seu comprimento.

Dobre o par novamente segurando as duas extremidades juntas. Certifique-se de que a alça formada em uma das extremidades não apresente dobras. Corte os quatro fios na extremidade sem alça de modo que as quatro pontas fiquem alinhadas.

Para o próximo passo, você precisará de um clipe de jacaré modificado, um dispositivo giratório motorizado e uma barra horizontal acima do dispositivo giratório. O clipe de jacaré é modificado colando-se uma barra de plástico na base do clipe. Quando as pontas estiverem expostas, prenda os quatro fios juntos com o clipe de jacaré modificado.

Coloque o laço de fio sobre a barra horizontal. Insira o clipe de jacaré na platina motorizada. Aplique 80 torções no sentido horário seguidas por 40 torções no sentido anti-horário ao feixe de fios ao longo de aproximadamente três minutos.

Esses parâmetros podem ser variados de acordo com suas necessidades. Após a torção tero ser concluída, una os fios aquecendo-os a partir de três ângulos diferentes com um soprador de ar quente, usando fluxo médio a baixo para cada ângulo, começando um a dois centímetros abaixo do ponto onde o feixe de fios se divide. Em seguida, mova o soprador de ar quente para cima e para baixo a uma distância de dois centímetros dos fios por cerca de cinco segundos.

Use cautela, pois altas temperaturas derreterão completamente o isolamento e poderão causar curtos-circuitos. Agora que os fios foram fundidos, remova o tero do aparelho de torção levantando suavemente o clipe de jacaré para aliviar a tensão sobre o tero e corte o tero próximo ao clipe de jacaré. Na outra extremidade, corte o laço de modo que haja quatro fios não identificados de mesmo comprimento. Em seguida, separe os fios individuais na extremidade superior, dobrando-os suavemente com um par de pinças de ponta macia.

O tero está agora pronto para ser carregado na matriz de microacionamentos. Prepare mais 21 a 25 Tet roads e armazene-os em uma caixa livre de poeira até o momento de prosseguir com o processo de carregamento do tero. Você precisará de uma matriz completa de microacionamentos caso ainda não tenha montado uma.

Consulte o vídeo da matriz de microeletrodos com dispositivos microacionadores para a fabricação da matriz de microacionadores para gravação crônica in vivo em nosso plano de design. O tero será fixado em uma extremidade ao hardware do conector e passará pelo tubo de suporte de polimida no microacionador, de modo que as pontas dos eletrodos se estendam abaixo da base da matriz de microacionadores. Agora demonstraremos esse processo de carregamento para um tero.

Antes de começar, monte o suporte do drive que pode ser preso à placa conectora em uma extremidade e, na outra extremidade, pode ser fixado por uma bandeja de gelo. Neste exemplo, o suporte do drive é um conector milax colado a uma extremidade do cabo de uma faca X-ato, segurando o tetro com pinças de ponta macia e, usando um estereoscópio, empurre a ponta do tetro para dentro do tubo carreador de poli-midia de um dos microdrives. Insira o tetro no tubo até que os fios eletrodos individuais estejam próximos da placa conectora na parte superior do conjunto do drive; tenha cuidado para não cortar nem dobrar os fios, pois isso fará com que o tetro entre no cérebro em um ângulo ao invés de perpendicularmente, comprometendo a integridade do tetro.

Agora, insira suavemente a outra extremidade dos quatro fios em seus respectivos orifícios na placa de interface do eletrodo, utilizando pinças de ponta macia. Novamente, evite dobrar ou entortar os fios. Com os quatro fios posicionados, empurre os pinos dourados para dentro dos orifícios com um alicate que tenha a mandíbula inferior encurtada.

Quando os pinos são inseridos no orifício, eles removerão o isolamento do fio e criarão uma conexão elétrica para referência posterior. Acompanhe o mapeamento entre os microacionadores e a posição dos pinos na placa de interface do eletrodo. Continue carregando um total de 18 tetrodos.

Os três microdrives restantes na matriz serão utilizados para acomodar os eletrodos de referência. Cada eletrodo de referência é feito de um tero que utiliza apenas um dos quatro yns não ligados. Para fixar os eletrodos de referência, siga o procedimento de carregamento, mas conecte apenas um dos quatro eletrodos ao pino do eletrodo de referência respectivo na placa do conector.

Se você estiver planejando gravações em múltiplos sítios, pode ser útil planejar com antecedência as conexões dos tetrodos à placa conectora. Por exemplo, agrupe os tetrodos direcionados a uma mesma região anatômica juntos na placa de interface do eletrodo. Isso deve minimizar a possibilidade de ajustar o tetro errado durante os experimentos.

Uma vez concluída a carga do tero, prepare dois fios terra, um para o animal e outro para o cone protetor. Corte um fio de aço isolado com seis polegadas de comprimento e remova três milímetros de isolamento, utilizando pinças metálicas, de cada extremidade do fio. Em seguida, corte um fio de aço isolado com quatro polegadas de comprimento.

Remova três milímetros de isolamento em uma extremidade e um centímetro na outra extremidade. Passe o fio terra de seis polegadas através do orifício lateral da matriz de microdrive e conduza-o para cima em direção à placa de interface. Conecte o fio exposto à placa de interface do eletrodo com um pino de ouro no orifício de terra designado.

Este fio será conectado ao crânio do animal. Posicione o fio terra de quatro polegadas paralelamente ao fio terra previamente instalado. Conecte a extremidade descascada de três milímetros à placa de interface do eletrodo utilizando um pino dourado em outro orifício terra designado.

Este fio será posteriormente conectado a um cone protetor, que funcionará como uma pequena gaiola de Faraday para reduzir a captação de ruídos. Agora concluímos a conexão dos fios e podemos prosseguir com o aperfeiçoamento dos nossos teros. Nosso objetivo neste processo é cortar todos os teros de modo que fiquem ligeiramente mais longos do que a profundidade da estrutura cerebral-alvo e do nosso exemplo.

Os microacionadores são projetados para um deslocamento máximo de cinco a seis milímetros, suficiente para alcançar diversas áreas neocorticais e o hipocampo dorsal de um rato adulto. Primeiro, abaixe todos os microacionadores para que os tetrodos fiquem totalmente expostos simultaneamente. Corte todos os tetrodos em comprimentos que sejam aproximadamente cinco milímetros mais longos que o comprimento final desejado, utilizando uma tesoura fina e afiada para o corte final.

Prepare um par de tesouras serrilhadas em uma bandeja de gelo, fixando uma das alças com um leve ângulo para baixo e com as serrilhas voltadas para cima, deixando a outra alça solta. Agora, retire completamente todos os eletrodos Tet para dentro de suas cânulas-guia girando os microposicionadores para cima. Usando um estereoscópio, estenda totalmente um tero para fora de sua cânula.

Usando uma régua, posicione a tesoura serrilhada à distância desejada do guia até a cânula. Corte lentamente e com cuidado o tero com um único movimento suave. Após o corte do tero, recolha o microdrive para cima de três a quatro milímetros.

Repita este processo para cada tero até que todos tenham sido cortados. Neste momento, você está pronto para o banho de ouro. Banho de ouro.

O ro teros é essencial para gravações estáveis de longo prazo. Ele evita a corrosão e melhora a biocompatibilidade. Configure o medidor de impedância no modo externo no gerador de corrente e no modo de verificação de corrente contínua com saída de áudio.

Toque as duas pontas do gerador de corrente nos seis pares possíveis de canais dentro de cada tero e use o feedback sonoro para determinar se existem curtos-circuitos entre os pares. Um curto-circuito entre pares de canais soa assim. Se houver um curto-circuito, recorte novamente o tero com tesoura serrilhada e teste novamente.

Se o problema persistir, descarte o Tet road e substitua-o. Mova todas as microplataformas para baixo, estendendo todos os Tet roads o mais para fora possível. Modifique a configuração do equipamento para verificar a impedância do eletrodo.

Agora mergulhe as pontas de todos os teros em um banho de solução padrão de niquelação a ouro. O banho de ouro está conectado eletricamente ao terminal negativo do medidor de impedância. Verifique a impedância do eletrodo tocando o terminal positivo do medidor de impedância no pino correspondente na placa de conexão.

Meça e registre a impedância de cada fio na matriz de microestímulo. Os valores normais variam de um a três megaohms no gerador de corrente atual. Ajuste a corrente entre um e três microamperes.

A seguir, fixe com segurança. Conecte o cabo positivo do medidor de impedância ao pino na placa do conector. No medidor de impedância.

Altere rapidamente do modo normal para o modo de desvio e retorne ao modo normal enquanto estiver no modo de desvio. A corrente passará pelo caminho de tetra e pela solução de ouro, e o ouro será depositado na ponta do eletrodo. A impedância após cada rodada de deposição deve ser menor do que antes.

Repita o pulso de corrente. Se a impedância não cair abaixo de um megaohm. Uma faixa conservadora de impedâncias aceitáveis é de 250 kiloohms a 350 kiloohms.

Se a impedância cair abaixo de 200 kilo ohms, isso pode indicar um curto-circuito. Se, após pulsos repetidos, a impedância não diminuir suficientemente, a ponta do eletrodo pode estar obstruída. Recorte novamente, verifique a presença de curtos-circuitos e repita o processo de douração.

Se recortar novamente não ajudar, substitua o tero e recomece. Após o revestimento de todos os teros, mergulhe-os em etanol e deixe-os secar por três a cinco minutos. Teste a presença de curtos-circuitos dentro dos teros utilizando o gerador de corrente com as pontas dos teros expostas ao ar.

Se existir uma conexão contínua entre dois ou mais eletrodos de um tero, recorte o tero e plaque-o novamente com ouro. Após a conclusão do revestimento com ouro de todos os teros, transfira todos os teros para o drive. Como etapa final na parte superior de cada microdrive, adicione uma gota de cola de cianoacrilato de espessura média na interface entre cada tero e seu tubo de polímero.

Isso fixará o tero ao seu microdrive. A finalidade do con protetor é proteger os microdrives e o fio exposto do tero do ambiente. Ele também fornece suporte para manipulação durante um experimento e reduz o ruído elétrico.

Utilizamos um cone de plástico impresso em 3D. No entanto, é possível fabricar o cone com outros materiais, como um pedaço de lata de refrigerante dobrado. Pode-se pegar o cone de plástico e fixar uma fita de folha de alumínio na superfície interna ou externa.

Primeiro, insira e gire parcialmente 3 parafusos tamanho 72, com três dezesseis avos de polegada de comprimento, nos lados do cone com o conjunto de acionamento suspenso. Insira o cone sobre o acionamento. Certifique-se de que ambos os fios de terra saiam da parte inferior do conjunto de acionamento.

Enrole a parte exposta do fio terra de quatro polegadas em torno de um dos parafusos 1 72 várias vezes e aperte firmemente o parafuso. Prenda com segurança o cone à base do acionador apertando os dois parafusos restantes do cone. A produção do conjunto do microacionador está agora concluída. Seu conjunto de microacionador está carregado com 18 teros em três referências.

É revestido por um cone e uma tampa protetores para maior durabilidade. A unidade pronta geralmente pesa entre 20 e 25 gramas, em média.

O arranjo de eletrodos implantável é implantado utilizando um procedimento cirúrgico padrão. Como você pode ver, o eletrodo está conectado a um chip pré-amplificador e a um feixe de fios que transmitem o sinal ao hardware e software de aquisição de dados. Acabamos de mostrar como fabricar os teros e concluir o procedimento de construção do arranjo de microeletrodos.

Neste vídeo, mostramos como fabricar os teros, carregar e condicionar os teros para gravação in vivo. Além disso, mostramos como adicionar um cone ao conjunto do microdriver para torná-lo mais robusto ao longo do tempo. Há muitas etapas na construção do conjunto de microdrivers, portanto, seja paciente, manuseie os eletrodos com cuidado e certifique-se de que todas as etapas intermediárias sejam adequadamente concluídas.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.