Micro-drive Array para Crônica In vivo: Assembléia Tetrodo

Neste protocolo, descrevemos a fabricação e instalação de feixes Tetros de quatro eletrodos para gravação crônica in vivo no roedor acordado para iniciar a fabricação do tetro. Um fio de fios de microeletrodo dobrado duas vezes sobre si mesmo para formar um feixe de quatro fios paralelos. Esses fios são então torcidos juntos, infundidos com uma pistola de ar quente.

Cada tero acabado é colocado em uma caixa de armazenamento. Enquanto mais teros são feitos, cada tero é inserido por um caminho dedicado, entrando por uma abertura em um atuador linear e saindo pela base da matriz de micro drives. Cada um dos quatro fios do tero é conectado a pinos separados em uma placa de conector de saída afixada na parte superior da matriz de micro drives.

A impedância de cada canal do tero é reduzida usando um processo de galvanoplastia de ouro. Uma vez que todos os teros tenham sido instalados e galvanizados, dois fios terra são conectados aos respectivos pinos na placa do conector e um cone de proteção é afixado à estrutura da matriz de micro drives para proteção após o cone ter sido aterrado, um Foley funcionando Tero micro drives arrays prontos para implantação. Olá, sou Dave Nian do laboratório de Nat Wilson no Pickout Institute for Learning and Memory.

No MIT hoje, mostraremos um procedimento para fabricar teros, carregar teros e concluir os estágios finais da reconstrução do micro drive. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a atividade neural coordenada entre grandes populações e neurônios em uma preparação animal acordada e comportada. Então vamos começar.

Para construir o tero para nossa matriz de micro drives padrão, começamos com um comprimento de 50 centímetros de fio micrométrico isolado de 12 mícrons. Dobre o fio ao meio, passe os dedos ao longo do par para que fiquem juntos. Certifique-se de que o par de fios tenha um bom contato em todo o seu comprimento.

Dobre o par novamente segurando as duas pontas juntas. Certifique-se de que o laço formado em uma extremidade não esteja dobrado. Corte os quatro fios na extremidade sem laço para que as quatro pontas fiquem alinhadas.

Para a próxima etapa, você precisará de um clipe jacaré modificado, um dispositivo de giro motorizado e uma barra horizontal acima do dispositivo de giro. O clipe jacaré é modificado colando uma barra de plástico na base do clipe. Quando as pontas estiverem expostas, prenda os quatro fios juntos com o clipe jacaré modificado.

Pendure o laço de arame sobre a barra horizontal. Coloque o clipe jacaré no estágio motorizado. Aplique 80 voltas no sentido horário seguidas de 40 voltas no sentido anti-horário no feixe de fios ao longo de aproximadamente três minutos.

Esses parâmetros podem ser variados de acordo com suas necessidades. Depois que a torção tero estiver concluída, funda os fios aquecendo de três ângulos diferentes com uma pistola de calor usando fluxo médio a baixo para cada ângulo, comece um a dois centímetros abaixo de onde o feixe de fios se divide. Em seguida, passe a pistola de ar quente para baixo e para cima a uma distância de dois centímetros dos fios por cerca de cinco segundos.

Tenha cuidado, pois altas temperaturas derretem completamente o isolamento e levam a curtos-circuitos. Agora que os fios se fundiram, remova o tero do aparelho de torção levantando suavemente o clipe jacaré para aliviar a tensão no tero e corte o tero perto do clipe jacaré Na outra extremidade, corte o laço de forma que haja quatro fios de fio sem marca de igual comprimento. Em seguida, separe os fios individuais na parte superior dobrando suavemente os fios com uma pinça de ponta macia.

O tero agora está pronto para ser carregado na matriz de micro drives. Faça mais 21 a 25 estradas Tet e guarde-as em uma caixa livre de poeira até a hora do tero Você precisará de uma matriz de micro unidade completa, caso ainda não tenha construído uma.

Consulte a matriz de acionamento de microeletrodo de vídeo para gravação crônica in vivo de fabricação de matriz de micro acionamento em nosso plano de design. O tero será conectado em uma extremidade ao hardware do conector e passará pelo tubo transportador intermediário poli no micro drive, de modo que as pontas dos eletrodos se estendam abaixo da base do conjunto de micro drives. Vamos agora demonstrar esse processo de carregamento para um tero.

Antes de começar, construa o suporte da unidade que pode ser conectado à placa do conector em uma extremidade e na outra extremidade pode ser preso por uma panela de gelo. Neste exemplo, o suporte da unidade é um conector milax colado a uma extremidade de uma alça de faca X exacto segurando o tero com uma pinça de ponta macia e, usando um estereoscópio, empurre a ponta do tero no tubo transportador intermediário poli de uma das micro unidades. Empurre a estrada Tet para dentro do tubo até que os fios individuais do eletrodo estejam próximos à placa do conector na parte superior da matriz de acionamento antes, tome cuidado para não dobrar, dobrar os fios, pois isso fará com que o tetro entre no cérebro em um ângulo em vez de perpendicular e enfraquecerá a integridade do tero.

Agora alimente suavemente a outra extremidade dos quatro fios em seus respectivos orifícios na placa de interface do eletrodo usando uma pinça de ponta macia. Novamente, evite dobrar ou dobrar os fios. Com todos os quatro fios no lugar, empurre os pinos de ouro em seus orifícios com um alicate que tenha uma mandíbula inferior encurtada.

Quando os pinos são empurrados para dentro do orifício, eles removem o isolamento do fio e criam uma conexão elétrica para referência posterior. Acompanhe o mapeamento entre os micro drives e a posição do pino na placa de interface do eletrodo. Continue carregando um total de 18 tetros.

As três micro unidades restantes na matriz serão usadas para abrigar os eletrodos de referência. Cada eletrodo de referência é feito de um tero que usa apenas um dos quatro yns não ligados. Para conectar os eletrodos de referência, siga o procedimento de carregamento, mas conecte apenas um dos quatro eletrodos ao respectivo pino do eletrodo de referência na placa do conector.

Se você estiver planejando gravações em vários locais, pode valer a pena planejar as conexões dos teros com a placa do conector com antecedência. Por exemplo, agrupe tetros que são direcionados para uma região anatômica juntos na placa de interface do eletrodo. Isso deve minimizar a possibilidade de ajustar o tetro errado durante os experimentos.

Quando o carregamento do tero estiver concluído, faça dois fios terra, um para o animal e outro para o cone de proteção. Corte um fio de aço isolado de seis polegadas de comprimento e remova três milímetros de isolamento usando uma pinça de metal de cada extremidade do fio. Em seguida, corte um fio de aço isolado de dez centímetros de comprimento.

Remova três milímetros de isolamento em uma extremidade e um centímetro na outra extremidade. Passe o fio terra de seis polegadas pelo orifício na lateral da matriz de micro drive e suba em direção à placa de interface. Conecte o fio exposto à placa de interface do eletrodo com um pino dourado no orifício de aterramento designado.

Este fio se conectará ao crânio do animal. Passe o fio terra de quatro polegadas paralelo ao fio terra instalado anteriormente. Conecte a extremidade descascada de três milímetros à placa de interface do eletrodo usando um pino dourado em outro orifício de aterramento designado.

Este fio será posteriormente conectado a um cone de proteção, que atuará como uma pequena gaiola de Faraday para reduzir a captação de ruído. Agora terminamos de conectar os fios e podemos prosseguir com o refinamento de nossos teros. Nosso objetivo neste processo é cortar todos os teros para que sejam um pouco mais longos do que a profundidade da estrutura do cérebro alvo e nosso exemplo.

Os micro drives são projetados para um curso máximo de cinco a seis milímetros, suficiente para alcançar muitas áreas neocorticais e o hipocampo dorsal de um rato adulto. Primeiro, abaixe todas as micro unidades para que os tetros fiquem expostos ao máximo simultaneamente. Corte todos os tetros em comprimentos aproximadamente cinco milímetros mais longos do que o comprimento final desejado, usando uma tesoura fina e afiada para o corte final.

Prepare uma tesoura serrilhada em uma panela de gelo prenda uma alça com um leve ângulo para baixo e com as serrilhas voltadas para cima, deixando a outra alça. Pendurado agora retire completamente todas as estradas do Tet em sua cânula guia, aumentando os micro drives. Usando um estereoscópio, estenda totalmente um tero para fora de sua cânula.

Usando uma régua, posicione a tesoura serrilhada na distância desejada da guia para a cânula. Corte lenta e suavemente o tero com um movimento suave. Depois que este tero for cortado, retire o micro drive em três a quatro milímetros.

Repita esse processo para cada tero até que todos tenham sido cortados. Neste ponto, você está pronto para o revestimento de ouro. Revestimento de ouro.

O ro teros é fundamental para gravações estáveis de longo prazo. Previne a corrosão e melhora a biocompatibilidade. Configure o medidor de impedância no modo externo no gerador de corrente e no modo de verificação CC com saída de áudio.

Toque os dois fios do gerador de corrente nos seis pares possíveis de canais dentro de cada tero e use o feedback de áudio para determinar se existem curtos entre os pares. Um curto entre pares de canais soa assim. Se houver um curto, corte novamente o tero com uma tesoura serrilhada e teste novamente.

Se o problema persistir, descarte a estrada do Tet e substitua-a. Mova todas as micro unidades para baixo, estendendo todas as estradas do Tet o mais longe possível. Modifique a configuração do equipamento para verificar a impedância do eletrodo.

Agora mergulhe as pontas de todos os teros em um banho de solução de revestimento de ouro padrão. O banho de ouro é conectado eletricamente ao fio negativo do medidor de impedância. Verifique a impedância do eletrodo tocando o fio positivo do medidor de impedância no pino correspondente na placa do conector.

Meça e registre a impedância de cada fio na matriz de micro drives. Os valores normais variam de um a três mega ohms no gerador de corrente. Defina a corrente entre um a três microamperes.

Em seguida, com segurança. Conecte o fio positivo do medidor de impedância ao pino na placa do conector. No medidor de impedância.

Alterne rapidamente do modo normal para o modo bypass e vice-versa enquanto estiver no modo bypass. A corrente passará pela estrada do Tet e pela solução de ouro, e o ouro será banhado na ponta do eletrodo. A impedância após cada rodada de revestimento deve ser menor do que antes.

Repita o pulso atual. Se a impedância não cair abaixo de um mega ohm. Uma faixa conservadora de impedâncias aceitáveis é de 250 kilo ohms a 350 kilo ohms.

Se a impedância cair abaixo de 200 quilo ohms, isso pode indicar um curto-circuito. Se, após pulsos repetidos, a impedância não cair o suficiente, a ponta do eletrodo pode ser obstruída. Recorte o cheque tero para shorts e repita o processo de revestimento de ouro.

Se o recorte não ajudar, substitua o tero e comece de novo. Depois de banhar todos os teros, mergulhe-os em etanol e deixe-os dirigir por três a cinco minutos. Teste de curtos-circuitos dentro de teros usando o gerador de corrente com as pontas do tero expostas ao ar.

Se houver uma conexão CC entre dois ou mais eletrodos de um tero, corte novamente o tero e a placa com ouro. Depois que o revestimento de ouro de todos os teros estiver concluído, mova todos os teros para a unidade. Como etapa final na parte superior de cada micro unidade, adicione uma gota de cola de cianoacrilato de espessura média à interface entre cada tero e seu tubo de polietileno.

Isso protegerá o tero em sua micro unidade. O objetivo do golpe de proteção é proteger os micro drives e o fio tero exposto do ambiente. Ele também fornece suporte para manuseio durante um experimento e reduz o ruído elétrico.

Usamos um cone de plástico impresso em 3D. No entanto, é possível fazer o cone de outros materiais, como um pedaço de refrigerante dobrado. Pode pegar o cone de plástico e fixar um pouco de fita de folha de alumínio na superfície interna ou externa.

Primeiro insira e gire parcialmente 3 parafusos de tamanho 1 72, três dezesseis avos de polegada de comprimento nas laterais do cone com a matriz de acionamento suspensa. Insira o cone sobre a unidade. Certifique-se de que ambos os fios terra se estendam da parte inferior da matriz de unidade.

Enrole a parte exposta do fio terra de quatro polegadas em torno de um dos parafusos 1 72 várias vezes e aperte o parafuso Prenda firmemente o cone à base da unidade apertando os dois parafusos cônicos restantes. A produção de matrizes de micro unidades está concluída. Sua matriz de micro unidade é carregada com 18 teros em três referências.

É envolto em um cone e tampa de proteção para maior durabilidade. A unidade acabada geralmente pesa de 20 a 25 gramas. Em média.

A matriz de unidade acabada é implantada usando procedimento cirúrgico padrão. Como você pode ver, a unidade é conectada a um chip pré-amplificador e a um feixe de fios que transportam o sinal para o hardware e software de aquisição de dados. Acabamos de mostrar como fazer teros e concluir o procedimento de construção da matriz de micro drives.

Neste vídeo, mostramos como fabricar teros, carregar e condicionar os teros para gravação in vivo. Além disso, mostramos como adicionar um cone à matriz de micro driver para torná-la robusta ao longo do tempo. Existem muitas etapas na construção da matriz de micro drivers, portanto, seja paciente, seja gentil com os eletrodos e certifique-se de que todas as etapas intermediárias sejam concluídas corretamente.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.