Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

Este procedimento começa removendo qualquer detrito do vírus da influenza por centrifugação. Em seguida, a membrana viral é rompida com o detergente e os VRNPs liberados são separados em um gradiente de glicerol.

As frações de centrifugação provenientes do gradiente são coletadas e uma alíquota de cada fração é analisada. Em uma eletroforese SDS-PAGE, os geis são corados com azul de Comassie para determinar as frações de pico contendo V NPS. As frações contendo as V NPS são então concentradas por centrifugação e os VRPs purificados são aplicados em uma grade de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de cobre, a qual é posteriormente negativamente contrastada para visualização dos VRPs por microscopia eletrônica de transmissão. Olá, sou WinCo Wu no laboratório da Dra. Nellie Pane no Departamento de Zoologia da Universidade da Colúmbia Britânica.

Sou Lindsay Weaver, anteriormente do Laboratório Pane. Hoje mostraremos a vocês um procedimento para a purificação de complexos de proteína nucleocapsidial ribonucleica de influenza. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a importação nuclear do vírus da influenza A em células de cultura tecidual.

Então vamos começar. Para iniciar o experimento, adicione 750 microlitros de tampão MNT a um tubo de centrífuga Beckman de policarbonato de 11 milímetros por 34 milímetros. Em seguida, adicione 500 microlitros de uma solução de vírus influenza A a dois miligramas por mililitro ao tubo e pipete para cima e para baixo várias vezes para misturar o vírus com o tampão MNT.

Após a mistura, coloque o tubo no rotor A TLA one 20.2 e centrifugue em uma centrífuga Beckman Optima max E por 10 minutos a 109.000 ×g a quatro graus Celsius. Quando a centrifugação terminar, remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de disruptura, utilizando um vórtex. Resuspenda vigorosamente o pellet e, então, agite a 31 graus Celsius por 20 minutos em um misturador térmico einor.

Quando a agitação terminar, prossiga com a centrifugação de velocidade de sedimentação em gradiente de glicerol. Para preparar o gradiente de glicerol, coloque os seguintes volumes de glicerol em um tubo de centrífuga Beckman UltraClear de 13 milímetros por 51 milímetros: um mililitro de glicerol a 70% volume por volume, 0,75 mililitro de glicerol a 50%, 0,375 mililitro de glicerol a 40% e 1,8 mililitros de glicerol a 33%. Essas soluções de glicerol são preparadas misturando glicerol puro com tampão NM.

Prepare também um tubo de equilíbrio contendo glicerol e tampão. Em seguida, vortexe novamente a amostra viral disruptada e carregue-a no gradiente de glicerol. Coloque o tubo em um rotor oscilante Beckman MLS 50 e centrifugue o gradiente por três horas e 45 minutos a 217.000 vezes G a quatro graus Celsius.

Após a conclusão da centrifugação, colete manualmente alíquotas de 250 microlitros do gradiente, começando a partir do topo do tubo. Mantenha as frações em gelo ou a quatro graus Celsius. Uma vez coletadas as frações, estamos prontos para analisá-las por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS.

Para iniciar a análise em gel de SDS-PAGE, retire 20 microlitros de cada fração para um tubo novo. Em seguida, adicione cinco microlitros de tampão amostral de SDS-PAGE cinco vezes concentrado e aqueça a amostra a 95 graus Celsius por cinco minutos. Após o aquecimento, centrifugue brevemente as amostras e carregue-as em um gel de poliacrilamida 10%, incluindo marcadores de peso molecular em um dos poços. A seguir, faça a eletroforese até que o corante de carga azul de bromofenol alcance a parte inferior do gel.

Retire o gel do aparelho de eletroforese SDS-PAGE e cora o gel com azul de kumasi. Com base nos resultados da coloração, identifique as frações que contêm principalmente a nucleoproteína da influenza.

A NP da gripe A possui aproximadamente 56 quilodaltons de tamanho e é a principal proteína encontrada nos complexos de ribonucleoproteína viral. Assim, a faixa da NP geralmente é a mais intensa nas frações que contêm os VRNPs. Na próxima etapa, concentraremos essas frações de VRNP.

Combine as frações de glicerol contendo principalmente NP e distribua-as em dois tubos de centrífuga de policarbonato Beckman de 11 milímetros por 34 milímetros; encha cada tubo com água ultrapura tratada com pirocarbonato de etila ou DEPC. Em seguida, pipete para cima e para baixo várias vezes para homogeneizar. Coloque os tubos em um rotor Beckman TLA 120.2 e centrifugue por quatro horas e meia a 157.000 × g a quatro graus Celsius.

Quando a centrifugação estiver concluída, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet. Em uma alíquota de 50 microlitros de água tratada com DEPC, separe um aliquota do V NPS purificado e armazene as demais a menos 80 graus Celsius. Agora estamos prontos para prosseguir com a coloração negativa dos VRPs.

Dilua um microlitro de VRNP purificado em nove microlitros de tampão PBS recém-preparado e filtrado duas vezes. Submeta uma grade de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de cobre à descarga luminiscente por 30 segundos. Esta grade foi previamente revestida com uma película de Parlow Dion e carbono. Usando pinças para segurar a grade recém-submetida à descarga luminiscente, aplique uma gota de cinco microlitros de VRNP diluído sobre a grade de amostra.

Deixe a gota absorver na grade por oito minutos enquanto aguarda. Coloque uma pequena tira de perfume em uma bandeja, depois dispense sobre o perfume duas gotas contendo 10 microlitros cada de tampão PBS, bem como uma gota de 80 microlitros da solução de coloração recém-preparada, composta por 1% de melidato de amônio. Agora lave a grade do espécime abaixando-a cuidadosamente nas duas gotas de PBS por um tempo total de um minuto.

Em seguida, utilize um pedaço de papel-filtro para remover por capilaridade parte da solução da amostra da grade do espécime, sem deixar a grade secar. Imediatamente após remover a última gota do tampão da grade do espécime, submerja completamente a grade do espécime na gota de corante. E aguarde um minuto.

Após um minuto, utilize um novo pedaço de papel de filtro para remover completamente a solução de corante da grade do espécime. Deixe a grade do espécime secar ao ar por vários minutos antes da observação. Em um microscópio eletrônico de transmissão, seguem imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão de V nps coradas negativamente.

Como é possível observar aqui, as V NPS se assemelham a partículas com formato de bastão e comprimento variável, com aproximadamente 30 nanômetros a 120 nanômetros de comprimento. A NP oligomérica é organizada como uma cadeia de moléculas de NP que é posteriormente dobrada em uma estrutura repetida de dupla hélice. Assim, loops em ambas as extremidades dessas partículas em forma de bastão podem, às vezes, ser observados.

Acabamos de mostrar como purificar e visualizar o influenza. Complexos de ribonucleoproteína viral. Ao realizar este procedimento, é importante não usar PBS ao diluir os VR mps se você estiver usando acetato de uranila para coloração negativa.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.