Visualmente Rastreamento Odor Mediated Durante o Voo em Drosophila

Insetos voadores utilizam pistas visuais para estabilizar sua trajetória em uma corrente de vento. Assim, a estabilização visual do rastreamento contra o vento auxilia diretamente no rastreamento de odores. Utilizando um aparato olfativo com trela magnética ou OMT, podemos examinar se as pistas visuais influenciam diretamente o comportamento de rastreamento de odor, independentemente das pistas de vento.

O procedimento começa com a otimização da iluminação da mosca, ajustando a intensidade de um LED infravermelho para obter uma imagem nítida da mosca. Pouca iluminação resultará em uma imagem escura, enquanto excesso de iluminação causará uma imagem superexposta assim que a mosca for adequadamente capturada. Um software de análise mede o ângulo corporal em tempo real; arrastar visualmente uma mosca para dentro de uma nuvem de odor alimentar resulta em uma orientação consistente em direção à localização espacial da nuvem.

Mas somente quando o panorama visual contém fortes pistas visuais. Testar a mesma mosca em uma arena visual de luminância média igual, mas sem bordas visuais, resulta em um rastreamento ruim do filete, pois a mosca perde sua orientação espacial. Olá, sou Brian DeMars do laboratório do Dr. Mark Fry, do Departamento de Ciência Fisiológica da Universidade da Califórnia, Los Angeles.

Hoje vamos mostrar como adquirir e otimizar imagens de vídeo para analisar o ângulo corporal em um aparato magnético com tornozeleira olfativa. Também descreveremos dois experimentos para examinar a influência de pistas visuais no rastreamento de odores. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o controle de voo mediado por estímulos visuais e olfativos em moscas-das-frutas.

Então vamos começar. A otimização da imagem em vídeo é crucial para a qualidade dos dados adquiridos, a fim de obter imagens mais nítidas. Primeiro, posicione uma mosca recém-atada na arena usando um par de pinças.

Em seguida, posicione a câmera com placa firewire sob a câmara de vácuo de acrílico transparente de modo que a câmera aponte diretamente para cima, através da câmara e do tubo de vácuo de vidro, até a face ventral da mosca presa. Certifique-se de que não haja revestimento de filtro infravermelho na lente do sistema de vídeo. Para iluminar a mosca, utilize um arranjo circular de LEDs infravermelhos, posicionados logo abaixo dos painéis de LED.

Foque cada LED individualmente no corpo da mosca para obter uma iluminação uniforme, reduzindo o brilho proveniente do sistema de painel e minimizando as pistas visuais percebidas pela mosca. É útil revestir todas as superfícies reflexivas dentro do campo de visão da câmera com tinta preta fosca; as luzes do ambiente devem ser desligadas para reduzir o brilho e as modulações de luminosidade detectáveis pelo olho da mosca. Em seguida, inspecione visualmente a câmera.

A mosca deve aparecer branca brilhante sobre um fundo preto. Se a imagem estiver desfocada, pode ser necessário ajustar o foco da lente. Se a mosca estiver escura, a matriz de LED pode estar desfocada ou com potência insuficiente para uma iluminação adequada.

Por fim, adquira vídeos com subrotinas personalizadas escritas em MATLAB utilizando a toolbox de aquisição de imagens. Um experimento simples no OMT é observar uma mosca faminta localizando e rastreando ativamente um filete de odor atrativo de alimento. Esses experimentos são tipicamente realizados em um formato de blocos aleatórios para minimizar qualquer viés na ordem experimental.

Manipulando o ambiente visual, é possível influenciar a capacidade da mosca de rastrear um odor. Para realizar este experimento, coloque uma mosca recém-presas na arena usando uma pinça antes de cada experimento; utilizando o visor visual, gire a mosca por várias revoluções para garantir um movimento suave ao longo de todo o eixo YA de 360 graus. Descarte a mosca se ela não girar suavemente.

Se o problema persistir, os ímãs podem estar desalinhados. Em seguida, apresente à mosca as seguintes condições experimentais, em ordem aleatória: um padrão listrado de alto contraste com vapor de água emanando do orifício de odor.

Um padrão listrado de alto contraste com vapor de odor atraente. Uma única faixa vertical deslocada em 90 graus em relação à porta de odor, com vapor de água, e uma única faixa deslocada em 90 graus com vapor de odor em intervalos de 32º funciona bem para experimentos nos quais moscas precisam localizar a fonte de odor por conta própria. Adquira vídeos a 30 hertz durante toda a duração de cada condição experimental e use o MATLAB para analisar as imagens offline. Ao utilizar concentrações elevadas de odor, pode haver liberação residual de odor pela porta após o desligamento do estímulo; minimize quaisquer efeitos decorrentes disso.

Isso pode fazer a mosca girar por alguns segundos com um panorama rotativo para permitir que o sistema elimine qualquer odor residual. Também ajuda a rotacionar visualmente a mosca entre os tratamentos experimentais. Isso mantém as moscas ativamente envolvidas no experimento e evita que permaneçam em um único local.

Um segundo experimento básico no OMT consiste em arrastar visualmente uma mosca para dentro de uma pluma de odor, alterar instantaneamente as condições visuais e, em seguida, medir sua capacidade de permanecer na pluma. Os experimentos são realizados em um formato de blocos aleatórios para minimizar qualquer viés na ordem experimental. Usando pinças, posicione uma mosca recém-imobilizada na arena.

Em seguida, como verificação diagnóstica, gire visualmente a mosca várias vezes ao redor da arena. Isso garante que o animal tenha a capacidade de se orientar em todas as direções. Antes de cada condição, ligue o odor experimental, seja água ou vinagre, e arraste visualmente a mosca para dentro do filete oscilando uma pequena faixa vertical na posição do filete.

Agora que a mosca está orientada em direção à pluma, remova a faixa oscilante. Em seguida, apresente as seguintes condições visuais: faixas panorâmicas de alto contraste com vapor de água, fundo uniforme com vapor de água, faixas panorâmicas de alto contraste com vapor de odor e fundo uniforme com vapor de odor.

Adquira vídeos a 30 hertz durante toda a duração de cada condição experimental. Em seguida, utilize rotinas de software personalizadas escritas em MATLAB para analisar as imagens offline. Ao otimizar a imagem de vídeo do OMT, lembre-se de que ela deve apresentar uma visão nítida da mosca iluminada sobre um fundo preto escuro.

Imagens excessivamente brilhantes podem ser melhoradas reduzindo a interferência de fundo, diminuindo a intensidade dos LEDs de infravermelho ou desligando as luzes do ambiente. Se a mosca estiver adequadamente iluminada, ajustar o foco dos LEDs de infravermelho ou modular sua intensidade pode resolver o problema.

Ao desafiar uma mosca a encontrar uma pluma de odor por conta própria, ela nunca deverá localizar uma pluma de vapor d'água de forma significativa, mas sempre deverá localizar uma pluma de odor na presença de ricas pistas visuais panorâmicas. Um segundo teste consiste em arrastar visualmente uma mosca diretamente para dentro de uma pluma de odor e desafiá-la a manter sua direção dentro da pluma contra uma variedade de fundos visuais estacionários. Se a mosca for arrastada para uma pluma de vapor d'água, ela deverá virar rapidamente para longe.

Se a mosca for arrastada para dentro de uma pluma de odor e houver pistas visuais suficientes para mediar um rastreamento robusto, a mosca permanecerá na pluma. Acabamos de mostrar como otimizar a imagem de vídeo adquirida para um aparato de fixação magnética olfativa. Também descrevemos dois protocolos experimentais para examinar a influência das pistas visuais no rastreamento de odor.

Ao realizar esses experimentos, é importante lembrar que a otimização da imagem em vídeo é crucial para a qualidade dos dados adquiridos. Além disso, independentemente do protocolo experimental, é fundamental manter suas moscas saudáveis e ativamente envolvidas. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.