Name: Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprenda a medir dinâmica de cálcio global e próximo à membrana plasmática em astrócitos usando microscopia de epifluorescência e reflexão interna total. Este método permite observação simultânea dos sinais de cálcio.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Memorial Uehara do Japão (a ES), bem como a Fundação Whitehall, do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame e um Stein-Oppenheimer Award Endowment (a BSK).

Procedimentos experimentais O procedimento experimental consiste de duas partes principais que são descritas em uma maneira passo sábio abaixo. Parte 1: PREPARAÇÃO cultura de astrócitos hipocampais Brevemente, misturado astrócitos do hipocampo neurônio-culturas foram preparadas usando um protocolo bem estabelecido 1,2,3. Nós otimizamos o procedimento para produzir saudável astrócitos em cultura. Todos os procedimentos listados abaixo devem ser realizadas em um ambiente estéril, como uma capela de fluxo laminar. Lamínulas preparar <ul><li> 22 lamínulas mm (VWR, 48380-068) </li><li> Poli-D-lisina (PDL, Sigma P0899), alíquotas (1 mg / ml) </li><li> Laminina alíquotas (20 mcg / ml): adicione 49 ml de água estéril a 1 mg / ml solução laminina (Sigma L2020), fazer 1,2 ml alíquotas e armazenar a -20 ° C </li></ul><ol><li> PDL dissolver em água estéril (50 mcg / ml) </li><li> Autoclave as lamelas, enxágüe com água estéril e colocar em PDL (20 ml para 100 lamínulas). Deixar à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Substituir PDL com água estéril (3 lavagens extensa). Em seguida, seque as lamelas e armazenar a 4 ° C. </li><li> O dia antes do plaqueamento os astrócitos lamínulas, lugar individual em um poço estéril em uma placa de 6 poços (com vários poços de fundo plano Placas com tampas, estéril de BD Bioscience). Coloque 400 mL de laminina em cada lamela e incubar durante a noite, na incubadora para evitar a evaporação. </li></ol> Dissecação Media dissecção: <ul><li> 500 ml de Earle solução salina balanceada (EBSS) (1X), líquido (Invitrogen, 14155-063) </li><li> 5 ml solução HEPES (Sigma, H0887) </li></ul> Media do hipocampo: <ul><li> 412,5 ml Médio Mínimo Essencial (MEM) (1X), líquido Contém sais de Earle, mas nenhum vermelho L-glutamina ou de fenol (Invitrogen, 51200-038) </li><li> 10 ml de glicose (Sigma, D-(+) glicose-ANIDRO SIGMA ULTRA G7528) 1 M em MEM </li><li> 5 ml Penicilina-estreptomicina (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 5 ml de solução de piruvato de sódio (Sigma, S8636) </li><li> 12,5 ml de solução 1 M HEPES (Sigma, H0887) </li><li> 5 ml Suplemento N-2 (100X), líquido (Invitrogen, 17502-048) </li><li> 50 ml de soro do cavalo, inativado pelo calor (Invitrogen, 26050-088) </li></ul> Solução de papaína: <ul><li> Adicionar 5 ml de mídia dissecção em Worthington frasco papaína-022 (LK003178; concentração final, 20 U / ml) e incubar a 37 ° C por 60 min. </li></ul><ol><li> Decapitar filhotes de ratos com idades entre P1 (geralmente 2 filhotes) seguindo as diretrizes analisados ​​e aprovados por normas nacionais e seu Animal Care locais Institucional e Comitê de uso. </li><li> Retire a pele e crânio e do cérebro lugar na placa de Petri cheia de mídia dissecção fria. </li><li> Removido meninges, dissecar ambos os hemisférios e dissecar hipocampo. </li><li> Pique o hipocampo em ~ 1X1 peças mm e digerir papaína em solução a 37 ° C por min 11-13. </li><li> Uma vez que as peças de tecido se instalaram, remova cuidadosamente papaína e adicionar 5 ml de meio do hipocampo para remover todos os vestígios da enzima. Repita este passo e ressuspender em meio hipocampo (2 ml). </li><li> Triturar as células ~ 5 vezes até que não haja aglomerações esquerda, com três chama-polido pipetas de furos progressivamente menores (1000 M, ~ 500 mm e ~ 300 mm). </li><li> Uma vez triturado, passe as células através de um filtro de células (tamanho dos poros, 70 mM, BD Bioscience). Contar as células em 10 ml de suspensão. Ajustar o volume do meio do hipocampo, a fim de ter 400 mil células / ml. </li><li> Aspirar o laminina off as lamelas, e antes do cobre pode secar, placa de 200 mL da suspensão de células por lamínula. </li><li> Deixá-los para anexar por 60 min na incubadora, e depois adicionar 2 ml de meio de hipocampo por poço. </li><li> No dia seguinte, aspire média de idade do hipocampo para remover células mortas e detritos e adicionar 2 ml de pré-aquecido meio fresco do hipocampo. </li></ol> Manutenção Media Neurobasal: <ul><li> 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017) </li><li> 10 ml de soro livre suplemento B27 (Invitrogen, 17504-044) </li><li> 5 ml Penicilina-estreptomicina (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 1,25 ml L-glutamina (Invitrogen, 25030-149) </li></ul> Alimentar a cultura de astrócitos neurônio-duas vezes por semana com o meio neurobasal, começando quatro dias após o plaqueamento. Pré-incubação da media cerca de 30 min na incubadora em um frasco ventilado para equilibrar a temperatura e CO 2. Parte 2: IMAGING CÁLCIO Buffer de gravação do hipocampo: 110 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl 2, 10 mM D-glicose, 10 mM HEPES (Todos os produtos químicos da Sigma) pH 7,4 (ajustado com NaOH). Corante indicador de carga de cálcio em astrócitos <ol><li> Lugar a cultura em um poço em uma placa de seis bem-cheia com 2 ml de buffer de gravação contendo 2,5 mM hipocampo Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) e 0,05% PLURONIC solução ® F-127 20% em DMSO (Invitrogen, P-3000MP) e incubar à temperatura ambiente por 10-30 min. </li><li> Remover Fluo-4 solução e lavar 3 vezes com lamínulas buffer de gravação do hipocampo e incubar em temperatura ambiente por 30 min. </li><li> Coloque a lamínula na câmara, e limpar o outro lado da lamela com o líquido de limpeza da lente. </li><li> Coloque uma pequena gota de óleo de imersão (imersão DF TIPO Óleo de Cargille) sobre o objectivo e colocar câmara (câmara aberta por 25 mm de lamela rodada Warner Instruments) no palco do microscópio (Olympus IX71). </li><li> Olhe para as células usando a luz de transmissão para ver como as pilhas olham, e levá-los em foco. Em seguida, iluminar as células com 488 nm de um monocromador (Polychrome V da TILL Vision) e determinar se o sinal de fluorescência de Fluo-4 é uniforme e detectável em astrócitos. </li><li> Use EPI e TIRF iluminação para medir o cálcio nos astrócitos. </li></ol> Microscopia TIRF Resumidamente, nós usamos um microscópio Olympus IX71 equipado com uma câmera DV887DCS ixon Andor EMCCD. O controle de excitação e de aquisição de imagem é conseguido usando software TILLVision. As vigas de 454/488/515 nm Argônio (100 mW) e 442 nm de estado sólido (45 mW) lasers são combinados e controlados com um ATÉ Polyline combinador de laser, TIRF condensador porta dupla e filtro sintonizável acoustoptical e controlador (AOTF; tudo a partir de ATÉ Photonics) e alimentado em uma fibra banda larga Kineflex para a entrada no condensador TIRF. Usamos uma lente Olympus 60X 1,45 NA alcançar TIRF. O ganho da câmera é ajustada para cada astrócitos para fornecer o melhor sinal em imagens de ruído. O fundo e os princípios da microscopia TIRF foram avaliados recentemente 4, 5. A maioria dos componentes ópticos que usamos foram comprados da TILL Photonics, que agora faz parte da Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). A profundidade de penetração TIR pode ser calculada a partir das equações abaixo. <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="Equação" /> d = profundidade de penetração n1 = índice de refração do vidro n2 = índice de refração do celular a = ângulo de incidência NAi abertura = numérica de incidência A fim de garantir o laser é alinhado de maneira ideal para TIRF achamos útil observar 100 nm fluorescentes talão (Invitrogen, F8803). Apresentamos ainda os quadros e vídeos de contas com EPI e microscopia TIRF. Quando em TIRF, observa-se um aumento dramático no sinal-ruído e os cordões de mostrar difusão browniano. Encontramo-lo útil para observar o comportamento de 100 nm com contas TIRF microscopia em uma base regular (~ uma vez por semana) para ter certeza de que TIRF ideal ocorre, ao invés de a iluminação comprometida oblíqua que ocorreria se o ângulo crítico não foram iguais a α (ver Fig. 1). Aplicação da proteína G-agonistas do receptor acoplado Astrócitos expressam uma variedade de Gq-coupled receptors 6, 7, incluindo receptores de glutamato metabotrópicos e receptores P2Y (agonista, ATP, ADP). Ativação desses receptores leva a aumentos significativos nos níveis de cálcio intracelular dentro de astrócitos. Por exemplo, se pode observar elevações de cálcio intracelular durante a aplicação da ATP (30 mM) para 10/08 astrócitos. Usamos uma solução rápida switcher da Warner Instruments chamado de VC-77SP sistema de perfusão Fast-Step (http://www.warneronline.com/index.cfm). Com este soluções método pode ser aplicado em menos de ~ 10 ms. <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="Figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> FIGURA 1. Dos desenhos animados e fotografias da imagem criada. A. mostra uma fotografia do microscópio montado em um airtable, enquanto que (B) mostra uma fotografia do conjunto do laser, os controladores e as caixas de feixe. C. Mostra uma foto do estágio do microscópio com a câmara montada para a imagem latente. Do lado esquerdo do dispositivo de perfusão rápida pode ser visto (junto com o motor de passo e tubos theta). À direita o headstage de um amplificador 200A Axopatch é visto. O cartoon esquematiza o caminho da luz no configurar e como TIRF é alcançado. O laser é focalizada sobre o plano focal posterior da lente objetiva 60X 1,45 NA e sua posição é ajustada para fora do centro, para que ela emerge para o óleo de imersão na α ângulo crítico. Neste ponto, o feixe sofre reflexão interna total e decai com uma distância λ (ver equação no texto principal) no meio de menor índice de refração. Neste caso, este é o buffer de gravação em torno do astrócitos e os astrócitos si. O resultado é excitação óptica (e, portanto, de imagem) de moléculas dentro de ~ 100 nm da membrana plasmática. No desenho da célula isso é mostrado como verde &quot;animado&quot; receptores de membrana, enquanto que aqueles dentro da célula ou na superfície superior da célula não está animado. Um relato completo da microscopia TIRF foi fornecido por Steyer e Almers 4. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="Figura 2" /> FIGURA 2. Imagens de 100 nm grânulos fluorescentes adquiridos com EPI e microscopia TIRF. A. Mostra imagens EPI de um campo de visão com várias dezenas de contas de 100 nm fluorescente. O ponto de setas vermelhas para contas que se instalaram sobre a lamínula de vidro, enquanto que as setas azuis apontam para contas que estão difundindo na água. B. Mostra uma imagem TIRF do mesmo campo de visão, como mostrado na A. Neste visualizar apenas as contas aderente mostrado por setas vermelhas são visíveis. Isto porque estas se tinham estabelecido para a coverlsip de vidro e foram, portanto, dentro do campo nm ~ 100 evanescente. As contas mostrado em A por setas azuis não estão dentro desta região e são, portanto, invisível nas imagens TIRF. As parcelas inferiores mostram renderização em 3D das imagens. É claro que um grande aumento no sinal-ruído ocorre para contas dentro do campo evanescente quando observado por microscopia TIRF. De fato, para estas imagens o sinal-ruído para o PAV foi de 7,1 ± 0,6, enquanto que para TIRF foi 20 ± 0,7. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="Figura 3" /> FIGURA 3. Imagens de astrócitos carregado com Fluo-4 corante indicador de cálcio adquiridos com EPI e microscopia TIRF. A. EPI imagens de um campo de visão com cinco astrócitos. B. Uma imagem TIRF do mesmo campo de visão mostrada na B. Note-se que as imagens em A e B são significativamente diferentes. Isto porque com TIRF iluminação apenas as regiões da membrana plasmática em aposição perto da lamela de vidro são gravadas. Os painéis inferiores mostram ATP evocadas transientes de cálcio intracelular fotografada com EPI e microscopia TIRF.

<ol><li>Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+image+activation+of+transmitter-gated+P2X+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 5, 87-93 (2008).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+hippocampal+neurons+from+P0+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats.</a> J Vis Exp. 19, (2008).</li>
<li>Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+view+of+life+within+100+nm+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+vesicle+fusion+from+lysis+to+monitor+calcium-triggered+lysosomal+exocytosis+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).</li>
<li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signalling+between+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic signalling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li>
<li>Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLIA%3A+listening+and+talking+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GLIA: listening and talking to the synapse.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+excites+interneurons+and+astrocytes+to+increase+synaptic+inhibition+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks.</a> J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+single+vesicle+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+ATP+is+the+predominant+cause+of+intercellular+calcium+waves+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes.</a> J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).</li>
<li>Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li>
<li>Lee, S. Y., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+targets+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate targets NMDA receptors.</a> J Physiol. 581, 887-888 (2007).</li>
<li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li>
<li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
</ol>

É bem estabelecido que os astrócitos mostrar elevações de cálcio intracelular. Estas ocorrem de forma espontânea, pode ser desencadeada pela atividade neuronal ou por aplicação de agonistas para ativar receptores na superfície de astrócitos 11. Uma questão importante e controversa é se astrócitos elevações de cálcio intracelular pode desencadear a liberação de moléculas de sinalização que ativam os receptores nos neurônios 11, 12. Este é controverso, porque tem havido evidências a favor e contra esta visão, como destac...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; Lâminas de Microscopia, Redondas, Número 1</td><td>Ferramenta</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobrometo de poli-D-lisina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Laminina da membrana basal de sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Equilibrada de Earle&amp;rsquo;s (EBSS) (1X), líquida</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>Meio Essencial Mínimo (MEM) (1X), líquido, contém sais de Earle&amp;rsquo;s, mas sem L-glutamina nem vermelho de fenol</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Solução líquida de penicilina-estreptomicina</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solução de piruvato de sódio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Solução de HEPES 1 M</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N-2 (100X), líquido</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo, inativado pelo calor</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>Reagente</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Meio Neurobasal&amp;#8482; (1X), líquido sem vermelho de fenol</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento livre de soro B-27 (50X), líquido</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina-200 mM (100X), líquida</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Filtros para células</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placas Falcon BD de múltiplos poços, fundo plano, com tampa, estéreis</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexaidratado</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexaidratado</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Ácido HEPES livre</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, solução 1 mM em DMSO</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&amp;#174; F-127, solução 20% em DMSO</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de imersão TIPO DF</td><td>Microscópio</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>Câmara aberta para lâminas redondas de 25 mm, volume de 100 &amp;mu;l</td><td>Ferramenta</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma P-2 para câmaras Série 20, sem aquecimento</td><td>Ferramenta</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas carboxiladas modificadas FluoSpheres, 0,1 &amp;mu;m, fluorescentes amarelo-esverdeadas (505/515), 2% de sólidos</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

medição perto membrana plasmática e global dynamics cálcio intracelular em astrócitos

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

O cérebro contém células da glia. Astrócitos, um tipo de célula glial, tem sido conhecido por fornecer um papel passivo de apoio aos neurônios. No entanto, evidências crescentes sugerem que os astrócitos também podem participar ativamente na função cerebral por meio de interações funcionais com os neurônios. No entanto, muitos aspectos fundamentais da biologia astrócitos permanecem controversas, pouco clara e / ou experimentalmente inexplorado. Uma questão importante é a dinâmica dos transientes de cálcio intracelular em astrócitos. Isso é relevante porque o cálcio é bem estabelecido como um importante mensageiro segundo e porque tem sido proposto que a elevação de cálcio astrócitos pode desencadear a liberação de transmissores de astrócitos. No entanto, não houve qualquer descrição detalhada ou satisfatória de cálcio perto da membrana plasmática de sinalização em astrócitos. Reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF) é uma ferramenta poderosa para analisar fisiologicamente relevantes eventos de sinalização dentro de cerca de 100 nm da membrana plasmática de células vivas. Aqui, usamos a microscopia TIRF e descrever como monitor perto de membrana plasmática e global a dinâmica do cálcio intracelular quase simultaneamente. O aperfeiçoamento e aplicação sistemática desta abordagem tem o potencial de informar sobre os detalhes precisos de sinalização de cálcio astrócitos. Um entendimento detalhado da dinâmica de cálcio astrócitos pode fornecer uma base para entender se, como, quando e por que astrócitos e neurônios sofrem de cálcio dependentes de interações funcionais.

Descrevemos como medir perto da membrana e global a dinâmica do cálcio intracelular em astrócitos cultivados utilizando reflexão interna total e microscopia de epifluorescência.

Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos

O cérebro contém células gliais. Os astrócitos, um tipo de célula glial, são conhecidos há muito tempo por desempenhar um papel de suporte passivo aos neurônios. No entanto, ...

Na primeira parte deste vídeo, demonstraremos como preparar o cultivo celular misto de astrócitos e neurônios. Para isso, vários hipocampos de ratos P1 são coletados em um tubo, digeridos com protease, dissociados por agitação e, em seguida, semeados sobre lamínulas. A segunda seção mostrará como medir a dinâmica intracelular de cálcio em astrócitos, o que envolve a incorporação do corante indicador de cálcio fluo-4 nos astrócitos e a medição da dinâmica global de cálcio por microscopia de epifluorescência e da dinâmica de cálcio próxima à membrana por microscopia TIRF.Ao alterar automaticamente e rapidamente a iluminação, é possível observar quase simultaneamente o cálcio global e o cálcio próximo à membrana. Olá, sou Aji omi, pesquisadora pós-doutora do laboratório Budget COS do Departamento de Fisiologia da Universidade da Califórnia em Los Angeles. Hoje mostraremos um procedimento para imagem de cálcio em astócitos.Utilizamos este procedimento em nosso estudo laboratorial sobre a dinâmica global do cálcio e próxima à membrana em um osteócito. Ao alterar rapidamente e automaticamente a eliminação, podemos distinguir o cálcio global do cálcio próximo à membrana. Quase simultaneam

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A preparação de fatias cerebrais agudas de isolado hipocampo, assim como as gravações simultâneas electrofisiológicas de astrócitos e neurónios...

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Fonte: Bannai, H., et. al., Dissecção de sinais locais de Ca2+ em células cultivadas por indicadores de Ca2+ direcionados à membrana. J. Vis. Exp. (2019)O vídeo demonstra imagens de fluorescência para observar a dinâmica espontânea do cálcio específica do compartimento em astrócitos, monitorando sequencialmente proteínas sensíveis ao cálcio localizadas na membrana plasmática e no retículo endoplasmático.

Imagem espontânea de cálcio para dinâmica específica do compartimento em astrócitos

Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melhor apreciação da sensibilidade dos receptores...

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

As propriedades e funções dos sinais intracelulares de Ca2+ dos astrócitos no estriado permanecem incompletamente exploradas. Descrevemos métodos para expressar indicadores de cálcio geneticamente codificados em astrócitos estriados usando vírus adeno-associados do sorotipo 2/5 (AAV2/5), bem como procedimentos para obter imagens confiáveis de sinais de Ca2+ em astrócitos estriados in situ.

Imagens intracelular Ca 2+ Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados

O protocolo AWESAM descrito aqui é ideal para o cultivo de astrócitos murino em isolamento de outras células do cérebro de forma rápida, simples e barato. Astrócitos AWESAM exposição espontânea Ca2 + sinalização, morfologia e gene expressão perfis semelhantes de astrócitos na vivo.

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

Demonstrado aqui são protocolos para isolar (1) recém endoteliais cerebrais intactos "tubos" e medições (2) simultâneas de cálcio endotelial e potencial durante o endotélio-derivado hiperpolarização de membrana. Além disso, esses métodos permitem a otimização farmacológica de cálcio da célula endotelial e sinalização eléctrica como variáveis experimentais individuais ou interativas.

Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Aqui nós apresentamos um protocolo para Ca2 + imagem em neurônios e células gliais, que permite que a dissecação de Ca2 + sinais em resolução subcellular. Este processo é aplicável a todos os tipos de células que permitem a expressão de geneticamente codificado Ca2 + indicadores.

Dissecação de locais de Ca2 + sinais em pilhas cultivadas pelos indicadores de membrana-alvo Ca2 +

Aqui nós descrevemos um método vivo-imagem latente in vitro para visualizar o transporte intracelular das organelas e o tráfico de proteínas da membrana de plasma em astrocytes murino. Este protocolo também apresenta uma metodologia de análise de imagem para determinar itinerários de transporte de carga e cinética.

Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos

Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios.

Imagem Mitocondrial Ca2+ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca2+ Codificados Geneticamente (GECIs)

Apresentamos aqui um protocolo sobre como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglias de córtices de ratos para imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca2+ intracelular para pesquisa sobre fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica no modelo de rato hSOD1G93A .

Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

Esse protocolo fornece uma descrição abrangente de um método para o registro simultâneo de sinais de cálcio de neurônios e astrócitos em múltiplas regiões cerebrais relacionadas à memória e demonstra sua aplicação durante um paradigma de aprendizagem e comportamento da memória.

Um método de fotometria de fibra bicolorida para registrar a atividade dos neurônios dos astrócitos em múltiplas regiões cerebrais durante comportamentos de aprendizagem e memória

Aprenda a medir dinâmica de cálcio global e próximo à membrana plasmática em astrócitos usando microscopia de epifluorescência e reflexão interna total. Este método permite observação simultânea dos sinais de cálcio.

Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos

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