Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos

Descrevemos como medir perto da membrana e global a dinâmica do cálcio intracelular em astrócitos cultivados utilizando reflexão interna total e microscopia de epifluorescência.

Na primeira parte deste vídeo, demonstraremos como preparar a co-cultura de neurônios de astrócitos. Para fazer isso, vários campi de hipopótamos de ratos P one são coletados em um tubo digerido com propano, dissociado por ação e, em seguida, colocado em lamínulas. A segunda seção mostrará como medir a dinâmica do cálcio intracelular em astrócitos, o que envolve o carregamento do corante indicador de cálcio da gripe oh quatro em astrócitos e a medição da dinâmica global do cálcio por epimicroscopia e a medição da dinâmica do cálcio próximo à membrana por microscopia de grama.

Ao alterar a iluminação automática e rapidamente, tanto o cálcio global quanto o cálcio próximo à membrana podem ser observados quase simultaneamente. Olá, sou Aji omi, pesquisador de pós-doutorado do laboratório Budget COS no Departamento de Fisiologia da Universidade da Califórnia em Los Angeles. Hoje mostraremos um procedimento para imagens de cálcio de locais asto.

Usamos este procedimento em nosso estudo de laboratório próximo à membrana e dinâmica global do cálcio em como osteócito. Ao alterar a eliminação de forma automática e rápida, podemos resolver o cálcio global e o cálcio próximo à membrana. Quase simultaneamente, mostrarei como aplicamos um TP para causar elevação de cálcio em astrócitos.

Terminarei resumindo e discutindo a barreira com o método para estudar os astrócitos. Então, vamos estudar. Para iniciar a cultura dos astrócitos, remova a pele e o crânio da cabeça de um filhote de rato decapitado.

Coloque o cérebro em uma placa de Petri cheia de meios de dissecação a frio, disseque os dois hemisférios e remova as meninges. Em seguida, disseque os campos de hipopótamos. Pique os campos de hipopótamos em pedaços de aproximadamente um por um milímetro.

Digerir em solução de Pappa a 37 graus Celsius durante 11 a 13 minutos. Remova o tecido dissecado da incubadora. Então, uma vez que os pedaços de tecido tenham assentado, remova-os da digestão do propano com cuidado e adicione cinco mililitros de meio hipocampo para lavar os pedaços picados de hipopótamo Campi.

Repita esta etapa e, finalmente, ressussuse suspender no meio hipocampal. Itere as células cerca de cinco vezes com três pipetas progressivamente menores polidas por chama. Uma vez passadas, as células passaram por um filtro de células com um tamanho total de 70 micrômetros e adicionaram quatro mililitros de meio ao filtro.

Conte as células em 10 microlitros de suspensão. Ajuste o volume do meio hipocampal para ter 400.000 células por mililitro. Agora prepare lamínulas para semear a suspensão celular aspirando o laminado das lamínulas, que foram expostas a uma solução laminada durante a noite.

Antes que as tampas possam secar 200 microlitros da suspensão da célula por lamínula. Deixe-os presos por 60 minutos na incubadora. Após a incubação, adicione dois mililitros de meio hipocampal por poço.

No dia seguinte, aspire o meio hipocampal antigo para remover células mortas e detritos e adicione dois mililitros de hipocampo fresco pré-avisado. A manutenção do meio das culturas de Co neurônios de astrócitos deve começar quatro dias após o plaqueamento e a adição de um mililitro de meio neurobasal fresco duas vezes por semana. Certifique-se de pré-incubar o meio por cerca de 30 minutos na incubadora em um frasco ventilado para equilibrar a temperatura e o dióxido de carbono.

Antes de estudar os astrócitos, é útil observar as esferas nanofluorescentes para otimizar o ângulo do laser para o gramado. Para fazer isso, coloque 200 microlitros de água na placa de Petri e adicione um microlitro de esferas fluorescentes de 100 nanômetros e misture as contas por microscopia de epifluorescência. Em seguida, observe as contas por microscopia de grama.

Para imagens de cálcio, coloque a cultura em um poço em uma placa de seis poços preenchida com dois mililitros de tampão de registro de hipocampo contendo 2,5 micromolares de gripe oh 4:00 AM e 0,05% de F1 27 onic, solução de 20% em DMSO e incube em temperatura ambiente por 10 a 30 minutos, lembre-se de cobrir a placa para evitar o branqueamento do flúor. Quatro, remova a solução de gripe oh quatro e lave a tampa Slips três vezes com tampão de gravação hipocampal. Incube as lamínulas lavadas em temperatura ambiente por 30 minutos.

Coloque a lamínula na câmara, limpe o outro lado da lamínula com líquido de limpeza de lentes e adicione 200 microlitros de tampão tampão hipocampal. Coloque uma pequena gota de óleo de imersão na objetiva e coloque a câmara no palco do microscópio. Olhe para as células usando luz de transmissão para focar e veja como as células se parecem.

Em seguida, ilumine as células com 488 nanômetros de um monocromático e determine se o sinal fluorescente da gripe oh quatro é uniforme e detectável. Nos astrócitos, use epi e iluminação de relva para medir o cálcio nos astrócitos. Aqui, contas fluorescentes são observadas por iluminação epi.

Além de produzir fluorescência de fundo, eles também exibem um movimento browniano significativo como o ângulo de iluminação. Com o laser se aproximando do ângulo crítico, o feixe de laser é totalmente refletido da interface de água de vidro. Essa reflexão interna total gera um campo eletromagnético chamado campo evanescente.

Isso tem uma profundidade na célula de menor índice de refração de cerca de 100 nanômetros. Você pode excitar quatros florais nesta camada fina na superfície da amostra. Aqui estão os grânulos fluorescentes observados pela iluminação do relvado quando comparados com epi.

A relação sinal-ruído de iluminação aumenta significativamente quando você diminui o ângulo. O feixe do laser não reflete na superfície e passa pela lamínula para atingir diretamente as esferas fluorescentes. Você pode ver muita fluorescência de fundo.

Agora aumentamos o ângulo. Novamente, o ruído de fundo diminui significativamente e você pode ver contas fluorescentes perto da superfície da lamínula. Essas imagens mostram gripe oh quatro astrócitos e neurônios carregados.

Os astrócitos são células planas com processos finos, enquanto os neurônios têm corpos celulares redondos e dendritos grossos e longos. Tanto os astrócitos quanto os neurônios parecem saudáveis e carregados de gripe. Oh, quatro corretamente.

Observar os astrócitos por epi ou microscopia confocal é útil para saber se os astrócitos são saudáveis e se os indicadores de cálcio são carregados nos astrócitos adequadamente. Nas regiões do astrócito mais próximas das regiões de vidro de cobertura chamadas de pegada, observa-se que um TP causa um aumento de cálcio perto da membrana plasmática. Os astrócitos do hipocampo são conhecidos por expressar receptores anérgicos puros e um TP quando aplicado ao banho pode causar uma liberação global de cálcio.

Acabamos de mostrar como preparar a cultura de osteócitos do hipocampo e como medir o nível de cálcio de um osteócito globalmente e próximo à membrana plasmática. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de otimizar o ângulo do laser para que a melhor maneira de garantir isso no microscópio seja observar o comportamento das velocidades de fluxo de 100 milímetros. O registro simultâneo do cálcio global e do nível de cálcio próximo à membrana nos fornecerá não apenas uma descrição detalhada do sinal de cálcio, mas também uma nova visão do mecanismo de regulação do cálcio nos astrócitos.

Também nos ocorreu que a abordagem descrita aqui é útil para medir o nível de cálcio intracelular próximo à membrana e global em outro campo excitável desconhecido. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.