Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos

Na primeira parte deste vídeo, demonstraremos como preparar o cultivo celular co-cultivo de astrócitos e neurônios. Para isso, vários hipocampos de ratos P1 são coletados em um tubo, digeridos com protease, dissociados por agitação e, em seguida, semeados sobre lamínulas. A segunda seção mostrará como medir a dinâmica intracelular de cálcio em astrócitos, o que envolve a carga do corante indicador de cálcio fluo-4 nos astrócitos e a medição da dinâmica global de cálcio por microscopia de epifluorescência e da dinâmica de cálcio próxima à membrana por microscopia TIRF.

Ao alterar automaticamente e rapidamente a iluminação, é possível observar quase simultaneamente o cálcio global e o cálcio próximo à membrana. Olá, sou Aji omi, pesquisador pós-doutorando do laboratório Budget COS do Departamento de Fisiologia da Universidade da Califórnia em Los Angeles. Hoje mostraremos um procedimento para imagem de cálcio em astócitos.

Utilizamos este procedimento em nosso estudo laboratorial sobre a dinâmica do cálcio próximo à membrana e global em um osteócito. Ao alterar a eliminação automaticamente e rapidamente, podemos distinguir o cálcio global do cálcio próximo à membrana. Quase simultaneamente, mostrarei como aplicamos um TP para provocar o aumento de cálcio em astrócitos.

Em seguida, concluirei com um resumo e discussão sobre a barreira com o método para o estudo de astrócitos. Vamos então começar. Para iniciar o cultivo de astrócitos, remova a pele e o crânio da cabeça de uma ratazinha decapitada.

Coloque o cérebro em uma placa de Petri contendo meio de dissecção frio, dissecione ambos os hemisférios e remova as meninges. Em seguida, dissecione os hipocampos. Corte os hipocampos em pedaços de aproximadamente um por um milímetro.

Digira na solução Pappa a 37 graus Celsius por 11 a 13 minutos. Retire o tecido dissecado do incubador. Em seguida, assim que os pedaços de tecido se assentarem, remova-os cuidadosamente da digestão com propano e adicione cinco mililitros de meio hipocampal para lavar os pedaços picados de hipocampo.

Repita este passo e, finalmente, re-suspenda no meio hipocampal. Passe as células aproximadamente cinco vezes por três pipetas com pontas progressivamente menores e polidas ao fogo. Após isso, passe as células através de um filtro celular com abertura de 70 micrômetros e adicione quatro mililitros de meio ao filtro.

Conte as células em 10 microlitros de suspensão. Ajuste o volume do meio hipocampal para obter 400.000 células por mililitro. Agora, prepare lâminas para semear a suspensão celular aspirando o laminina das lâminas, que foram expostas a uma solução de laminina durante a noite.

Antes de deixar as lamínulas secarem, plaque 200 microlitros da suspensão celular por lamínula. Deixe-as aderirem por 60 minutos no incubador. Após a incubação, adicione dois mililitros de meio hippocampal por poço.

No dia seguinte, aspire o meio antigo do hipocampo para remover células mortas e debris e adicione dois mililitros de meio fresco do hipocampo previamente aquecido. A manutenção do meio de culturas co-cultivadas de astrócitos e neurônios deve começar quatro dias após o plaqueamento, adicionando um mililitro de meio neurobasal fresco duas vezes por semana. Certifique-se de pré-incubar os meios por cerca de 30 minutos no incubador, em um frasco ventilado, para equilibrar a temperatura e o dióxido de carbono.

Antes de estudar os astrócitos, é útil observar microesferas fluorescentes nano para otimizar o ângulo do laser para a microscopia TURF. Para isso, coloque 200 microlitros de água no recipiente de Petri e adicione um microlitro de microesferas fluorescentes de 100 nanômetros, misture e observe as microesferas por microscopia de fluorescência epiluminiscente. Em seguida, observe as microesferas por microscopia TURF.

Para a imagem de cálcio, coloque o cultivo em um poço de uma placa de seis poços contendo dois mililitros de tampão de gravação hipocampal com 2,5 micromolar de fluo-4 AM e 0,05% de Pluronic F127, 20% em solução de DMSO, e incube à temperatura ambiente por 10 a 30 minutos; lembre-se de cobrir a placa para evitar o desbotamento do fluoróforo. Em seguida, remova a solução de fluo-4 e lave as lamínulas três vezes com tampão de gravação hipocampal. Incube as lamínulas lavadas à temperatura ambiente por 30 minutos.

Coloque a lamínula na câmara, limpe o outro lado da lamínula com líquido de limpeza para lentes e adicione 200 microlitros de tampão hipocampal. Coloque uma pequena gota de óleo de imersão na objetiva e posicione a câmara sobre a platina do microscópio. Observe as células utilizando luz de transmissão para focalizar e verificar a aparência das células.

Em seguida, ilumine as células com 488 nanômetros de um monocromador e determine se o sinal fluorescente do flu oh four é uniforme e detectável. Em astrócitos, utilize iluminação epi e turf para medir o cálcio nos astrócitos. Aqui, microesferas fluorescentes são observadas por iluminação epi.

Além de produzir fluorescência de fundo, eles também exibem movimento browniano significativo conforme o ângulo de iluminação. Quando o laser se aproxima do ângulo crítico, o feixe de laser é totalmente refletido na interface entre vidro e água. Essa reflexão total interna gera um campo eletromagnético denominado campo evanescente.

Isso apresenta uma profundidade na célula de menor índice de refração de cerca de 100 nanômetros. É possível excitar fluoróforos nesta camada fina na superfície do espécime. Abaixo, há microesferas fluorescentes observadas por iluminação de campo escuro em comparação com a iluminação epifluorescente.

A relação sinal-ruído da iluminação aumenta significativamente quando você reduz o ângulo. O feixe do laser não reflete na superfície e atravessa a lamínula para atingir diretamente as microesferas fluorescentes. Você pode observar muita fluorescência de fundo.

Agora aumentamos o ângulo. Novamente, o ruído de fundo diminui significativamente e é possível observar microesferas fluorescentes próximas à superfície da lamínula. Essas imagens mostram astrócitos e neurônios carregados com flu oh quatro.

Os astrócitos são células achatadas com prolongamentos finos, enquanto os neurônios possuem corpos celulares arredondados e dendritos grossos e longos. Tanto os astrócitos quanto os neurônios parecem saudáveis e carregam flu. Oh quatro corretamente.

Analisar astrócitos por microscopia epifluorescente ou confocal é útil para verificar se os astrócitos estão saudáveis e se os indicadores de cálcio foram adequadamente carregados nos astrócitos. Nas regiões dos astrócitos mais próximas ao vidro de cobertura, denominadas região da pegada, observa-se que um TP provoca um aumento de cálcio próximo à membrana plasmática. Sabe-se que astrócitos do hipocampo expressam receptores anérgicos puros e que a aplicação de um TP no banho pode causar uma liberação global de cálcio.

Acabamos de mostrar como preparar culturas de osteócitos do hipocampo e como medir o nível de cálcio em um osteócito tanto globalmente quanto próximo à membrana plasmática. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de otimizar o ângulo do laser; a melhor maneira de garantir isso no microscópio é observar o comportamento em velocidades de fluxo de 100 milímetros. O registro simultâneo dos níveis de cálcio global e próximo à membrana nos fornecerá não apenas uma descrição detalhada do sinal de cálcio, mas também novas perspectivas sobre o mecanismo de regulação de cálcio em astrócitos.

Também nos ocorreu que a abordagem descrita aqui é útil para medir os níveis de cálcio intracelular próximos à membrana e globais em outros campos excitáveis desconhecidos. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.