Name: Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprenda a medir dinâmica de cálcio global e próximo à membrana plasmática em astrócitos usando microscopia de epifluorescência e reflexão interna total. Este método permite observação simultânea dos sinais de cálcio.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Memorial Uehara do Japão (a ES), bem como a Fundação Whitehall, do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame e um Stein-Oppenheimer Award Endowment (a BSK).

Procedimentos experimentais O procedimento experimental consiste de duas partes principais que são descritas em uma maneira passo sábio abaixo. Parte 1: PREPARAÇÃO cultura de astrócitos hipocampais Brevemente, misturado astrócitos do hipocampo neurônio-culturas foram preparadas usando um protocolo bem estabelecido 1,2,3. Nós otimizamos o procedimento para produzir saudável astrócitos em cultura. Todos os procedimentos listados abaixo devem ser realizadas em um ambiente estéril, como uma capela de fluxo laminar. Lamínulas preparar <ul><li> 22 lamínulas mm (VWR, 48380-068) </li><li> Poli-D-lisina (PDL, Sigma P0899), alíquotas (1 mg / ml) </li><li> Laminina alíquotas (20 mcg / ml): adicione 49 ml de água estéril a 1 mg / ml solução laminina (Sigma L2020), fazer 1,2 ml alíquotas e armazenar a -20 ° C </li></ul><ol><li> PDL dissolver em água estéril (50 mcg / ml) </li><li> Autoclave as lamelas, enxágüe com água estéril e colocar em PDL (20 ml para 100 lamínulas). Deixar à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Substituir PDL com água estéril (3 lavagens extensa). Em seguida, seque as lamelas e armazenar a 4 ° C. </li><li> O dia antes do plaqueamento os astrócitos lamínulas, lugar individual em um poço estéril em uma placa de 6 poços (com vários poços de fundo plano Placas com tampas, estéril de BD Bioscience). Coloque 400 mL de laminina em cada lamela e incubar durante a noite, na incubadora para evitar a evaporação. </li></ol> Dissecação Media dissecção: <ul><li> 500 ml de Earle solução salina balanceada (EBSS) (1X), líquido (Invitrogen, 14155-063) </li><li> 5 ml solução HEPES (Sigma, H0887) </li></ul> Media do hipocampo: <ul><li> 412,5 ml Médio Mínimo Essencial (MEM) (1X), líquido Contém sais de Earle, mas nenhum vermelho L-glutamina ou de fenol (Invitrogen, 51200-038) </li><li> 10 ml de glicose (Sigma, D-(+) glicose-ANIDRO SIGMA ULTRA G7528) 1 M em MEM </li><li> 5 ml Penicilina-estreptomicina (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 5 ml de solução de piruvato de sódio (Sigma, S8636) </li><li> 12,5 ml de solução 1 M HEPES (Sigma, H0887) </li><li> 5 ml Suplemento N-2 (100X), líquido (Invitrogen, 17502-048) </li><li> 50 ml de soro do cavalo, inativado pelo calor (Invitrogen, 26050-088) </li></ul> Solução de papaína: <ul><li> Adicionar 5 ml de mídia dissecção em Worthington frasco papaína-022 (LK003178; concentração final, 20 U / ml) e incubar a 37 ° C por 60 min. </li></ul><ol><li> Decapitar filhotes de ratos com idades entre P1 (geralmente 2 filhotes) seguindo as diretrizes analisados ​​e aprovados por normas nacionais e seu Animal Care locais Institucional e Comitê de uso. </li><li> Retire a pele e crânio e do cérebro lugar na placa de Petri cheia de mídia dissecção fria. </li><li> Removido meninges, dissecar ambos os hemisférios e dissecar hipocampo. </li><li> Pique o hipocampo em ~ 1X1 peças mm e digerir papaína em solução a 37 ° C por min 11-13. </li><li> Uma vez que as peças de tecido se instalaram, remova cuidadosamente papaína e adicionar 5 ml de meio do hipocampo para remover todos os vestígios da enzima. Repita este passo e ressuspender em meio hipocampo (2 ml). </li><li> Triturar as células ~ 5 vezes até que não haja aglomerações esquerda, com três chama-polido pipetas de furos progressivamente menores (1000 M, ~ 500 mm e ~ 300 mm). </li><li> Uma vez triturado, passe as células através de um filtro de células (tamanho dos poros, 70 mM, BD Bioscience). Contar as células em 10 ml de suspensão. Ajustar o volume do meio do hipocampo, a fim de ter 400 mil células / ml. </li><li> Aspirar o laminina off as lamelas, e antes do cobre pode secar, placa de 200 mL da suspensão de células por lamínula. </li><li> Deixá-los para anexar por 60 min na incubadora, e depois adicionar 2 ml de meio de hipocampo por poço. </li><li> No dia seguinte, aspire média de idade do hipocampo para remover células mortas e detritos e adicionar 2 ml de pré-aquecido meio fresco do hipocampo. </li></ol> Manutenção Media Neurobasal: <ul><li> 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017) </li><li> 10 ml de soro livre suplemento B27 (Invitrogen, 17504-044) </li><li> 5 ml Penicilina-estreptomicina (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 1,25 ml L-glutamina (Invitrogen, 25030-149) </li></ul> Alimentar a cultura de astrócitos neurônio-duas vezes por semana com o meio neurobasal, começando quatro dias após o plaqueamento. Pré-incubação da media cerca de 30 min na incubadora em um frasco ventilado para equilibrar a temperatura e CO 2. Parte 2: IMAGING CÁLCIO Buffer de gravação do hipocampo: 110 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl 2, 10 mM D-glicose, 10 mM HEPES (Todos os produtos químicos da Sigma) pH 7,4 (ajustado com NaOH). Corante indicador de carga de cálcio em astrócitos <ol><li> Lugar a cultura em um poço em uma placa de seis bem-cheia com 2 ml de buffer de gravação contendo 2,5 mM hipocampo Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) e 0,05% PLURONIC solução ® F-127 20% em DMSO (Invitrogen, P-3000MP) e incubar à temperatura ambiente por 10-30 min. </li><li> Remover Fluo-4 solução e lavar 3 vezes com lamínulas buffer de gravação do hipocampo e incubar em temperatura ambiente por 30 min. </li><li> Coloque a lamínula na câmara, e limpar o outro lado da lamela com o líquido de limpeza da lente. </li><li> Coloque uma pequena gota de óleo de imersão (imersão DF TIPO Óleo de Cargille) sobre o objectivo e colocar câmara (câmara aberta por 25 mm de lamela rodada Warner Instruments) no palco do microscópio (Olympus IX71). </li><li> Olhe para as células usando a luz de transmissão para ver como as pilhas olham, e levá-los em foco. Em seguida, iluminar as células com 488 nm de um monocromador (Polychrome V da TILL Vision) e determinar se o sinal de fluorescência de Fluo-4 é uniforme e detectável em astrócitos. </li><li> Use EPI e TIRF iluminação para medir o cálcio nos astrócitos. </li></ol> Microscopia TIRF Resumidamente, nós usamos um microscópio Olympus IX71 equipado com uma câmera DV887DCS ixon Andor EMCCD. O controle de excitação e de aquisição de imagem é conseguido usando software TILLVision. As vigas de 454/488/515 nm Argônio (100 mW) e 442 nm de estado sólido (45 mW) lasers são combinados e controlados com um ATÉ Polyline combinador de laser, TIRF condensador porta dupla e filtro sintonizável acoustoptical e controlador (AOTF; tudo a partir de ATÉ Photonics) e alimentado em uma fibra banda larga Kineflex para a entrada no condensador TIRF. Usamos uma lente Olympus 60X 1,45 NA alcançar TIRF. O ganho da câmera é ajustada para cada astrócitos para fornecer o melhor sinal em imagens de ruído. O fundo e os princípios da microscopia TIRF foram avaliados recentemente 4, 5. A maioria dos componentes ópticos que usamos foram comprados da TILL Photonics, que agora faz parte da Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). A profundidade de penetração TIR pode ser calculada a partir das equações abaixo. <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="Equação" /> d = profundidade de penetração n1 = índice de refração do vidro n2 = índice de refração do celular a = ângulo de incidência NAi abertura = numérica de incidência A fim de garantir o laser é alinhado de maneira ideal para TIRF achamos útil observar 100 nm fluorescentes talão (Invitrogen, F8803). Apresentamos ainda os quadros e vídeos de contas com EPI e microscopia TIRF. Quando em TIRF, observa-se um aumento dramático no sinal-ruído e os cordões de mostrar difusão browniano. Encontramo-lo útil para observar o comportamento de 100 nm com contas TIRF microscopia em uma base regular (~ uma vez por semana) para ter certeza de que TIRF ideal ocorre, ao invés de a iluminação comprometida oblíqua que ocorreria se o ângulo crítico não foram iguais a α (ver Fig. 1). Aplicação da proteína G-agonistas do receptor acoplado Astrócitos expressam uma variedade de Gq-coupled receptors 6, 7, incluindo receptores de glutamato metabotrópicos e receptores P2Y (agonista, ATP, ADP). Ativação desses receptores leva a aumentos significativos nos níveis de cálcio intracelular dentro de astrócitos. Por exemplo, se pode observar elevações de cálcio intracelular durante a aplicação da ATP (30 mM) para 10/08 astrócitos. Usamos uma solução rápida switcher da Warner Instruments chamado de VC-77SP sistema de perfusão Fast-Step (http://www.warneronline.com/index.cfm). Com este soluções método pode ser aplicado em menos de ~ 10 ms. <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="Figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> FIGURA 1. Dos desenhos animados e fotografias da imagem criada. A. mostra uma fotografia do microscópio montado em um airtable, enquanto que (B) mostra uma fotografia do conjunto do laser, os controladores e as caixas de feixe. C. Mostra uma foto do estágio do microscópio com a câmara montada para a imagem latente. Do lado esquerdo do dispositivo de perfusão rápida pode ser visto (junto com o motor de passo e tubos theta). À direita o headstage de um amplificador 200A Axopatch é visto. O cartoon esquematiza o caminho da luz no configurar e como TIRF é alcançado. O laser é focalizada sobre o plano focal posterior da lente objetiva 60X 1,45 NA e sua posição é ajustada para fora do centro, para que ela emerge para o óleo de imersão na α ângulo crítico. Neste ponto, o feixe sofre reflexão interna total e decai com uma distância λ (ver equação no texto principal) no meio de menor índice de refração. Neste caso, este é o buffer de gravação em torno do astrócitos e os astrócitos si. O resultado é excitação óptica (e, portanto, de imagem) de moléculas dentro de ~ 100 nm da membrana plasmática. No desenho da célula isso é mostrado como verde &quot;animado&quot; receptores de membrana, enquanto que aqueles dentro da célula ou na superfície superior da célula não está animado. Um relato completo da microscopia TIRF foi fornecido por Steyer e Almers 4. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="Figura 2" /> FIGURA 2. Imagens de 100 nm grânulos fluorescentes adquiridos com EPI e microscopia TIRF. A. Mostra imagens EPI de um campo de visão com várias dezenas de contas de 100 nm fluorescente. O ponto de setas vermelhas para contas que se instalaram sobre a lamínula de vidro, enquanto que as setas azuis apontam para contas que estão difundindo na água. B. Mostra uma imagem TIRF do mesmo campo de visão, como mostrado na A. Neste visualizar apenas as contas aderente mostrado por setas vermelhas são visíveis. Isto porque estas se tinham estabelecido para a coverlsip de vidro e foram, portanto, dentro do campo nm ~ 100 evanescente. As contas mostrado em A por setas azuis não estão dentro desta região e são, portanto, invisível nas imagens TIRF. As parcelas inferiores mostram renderização em 3D das imagens. É claro que um grande aumento no sinal-ruído ocorre para contas dentro do campo evanescente quando observado por microscopia TIRF. De fato, para estas imagens o sinal-ruído para o PAV foi de 7,1 ± 0,6, enquanto que para TIRF foi 20 ± 0,7. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="Figura 3" /> FIGURA 3. Imagens de astrócitos carregado com Fluo-4 corante indicador de cálcio adquiridos com EPI e microscopia TIRF. A. EPI imagens de um campo de visão com cinco astrócitos. B. Uma imagem TIRF do mesmo campo de visão mostrada na B. Note-se que as imagens em A e B são significativamente diferentes. Isto porque com TIRF iluminação apenas as regiões da membrana plasmática em aposição perto da lamela de vidro são gravadas. Os painéis inferiores mostram ATP evocadas transientes de cálcio intracelular fotografada com EPI e microscopia TIRF.

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<li>Lee, S. Y., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+targets+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate targets NMDA receptors.</a> J Physiol. 581, 887-888 (2007).</li>
<li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li>
<li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
</ol>

É bem estabelecido que os astrócitos mostrar elevações de cálcio intracelular. Estas ocorrem de forma espontânea, pode ser desencadeada pela atividade neuronal ou por aplicação de agonistas para ativar receptores na superfície de astrócitos 11. Uma questão importante e controversa é se astrócitos elevações de cálcio intracelular pode desencadear a liberação de moléculas de sinalização que ativam os receptores nos neurônios 11, 12. Este é controverso, porque tem havido evidências a favor e contra esta visão, como destac...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; Lâminas de Microscopia, Redondas, Número 1</td><td>Ferramenta</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobrometo de poli-D-lisina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Laminina da membrana basal de sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Equilibrada de Earle&amp;rsquo;s (EBSS) (1X), líquida</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>Meio Essencial Mínimo (MEM) (1X), líquido, contém sais de Earle&amp;rsquo;s, mas sem L-glutamina nem vermelho de fenol</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Solução líquida de penicilina-estreptomicina</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solução de piruvato de sódio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Solução de HEPES 1 M</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N-2 (100X), líquido</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo, inativado pelo calor</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>Reagente</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Meio Neurobasal&amp;#8482; (1X), líquido sem vermelho de fenol</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento livre de soro B-27 (50X), líquido</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina-200 mM (100X), líquida</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Filtros para células</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placas Falcon BD de múltiplos poços, fundo plano, com tampa, estéreis</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexaidratado</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexaidratado</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Ácido HEPES livre</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, solução 1 mM em DMSO</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&amp;#174; F-127, solução 20% em DMSO</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de imersão TIPO DF</td><td>Microscópio</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>Câmara aberta para lâminas redondas de 25 mm, volume de 100 &amp;mu;l</td><td>Ferramenta</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma P-2 para câmaras Série 20, sem aquecimento</td><td>Ferramenta</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas carboxiladas modificadas FluoSpheres, 0,1 &amp;mu;m, fluorescentes amarelo-esverdeadas (505/515), 2% de sólidos</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

medição perto membrana plasmática e global dynamics cálcio intracelular em astrócitos

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

O cérebro contém células da glia. Astrócitos, um tipo de célula glial, tem sido conhecido por fornecer um papel passivo de apoio aos neurônios. No entanto, evidências crescentes sugerem que os astrócitos também podem participar ativamente na função cerebral por meio de interações funcionais com os neurônios. No entanto, muitos aspectos fundamentais da biologia astrócitos permanecem controversas, pouco clara e / ou experimentalmente inexplorado. Uma questão importante é a dinâmica dos transientes de cálcio intracelular em astrócitos. Isso é relevante porque o cálcio é bem estabelecido como um importante mensageiro segundo e porque tem sido proposto que a elevação de cálcio astrócitos pode desencadear a liberação de transmissores de astrócitos. No entanto, não houve qualquer descrição detalhada ou satisfatória de cálcio perto da membrana plasmática de sinalização em astrócitos. Reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF) é uma ferramenta poderosa para analisar fisiologicamente relevantes eventos de sinalização dentro de cerca de 100 nm da membrana plasmática de células vivas. Aqui, usamos a microscopia TIRF e descrever como monitor perto de membrana plasmática e global a dinâmica do cálcio intracelular quase simultaneamente. O aperfeiçoamento e aplicação sistemática desta abordagem tem o potencial de informar sobre os detalhes precisos de sinalização de cálcio astrócitos. Um entendimento detalhado da dinâmica de cálcio astrócitos pode fornecer uma base para entender se, como, quando e por que astrócitos e neurônios sofrem de cálcio dependentes de interações funcionais.

Descrevemos como medir perto da membrana e global a dinâmica do cálcio intracelular em astrócitos cultivados utilizando reflexão interna total e microscopia de epifluorescência.

Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos

O cérebro contém células gliais. Os astrócitos, um tipo de célula glial, são conhecidos há muito tempo por desempenhar um papel de suporte passivo aos neurônios. No entanto, ...

Na primeira parte deste vídeo, demonstraremos como preparar o cultivo celular misto de astrócitos e neurônios. Para isso, vários hipocampos de ratos P1 são coletados em um tubo, digeridos com protease, dissociados por agitação e, em seguida, semeados sobre lamínulas. A segunda seção mostrará como medir a dinâmica intracelular de cálcio em astrócitos, o que envolve a incorporação do corante indicador de cálcio fluo-4 nos astrócitos e a medição da dinâmica global de cálcio por microscopia de epifluorescência e da dinâmica de cálcio próxima à membrana por microscopia TIRF.Ao alterar automaticamente e rapidamente a iluminação, é possível observar quase simultaneamente o cálcio global e o cálcio próximo à membrana. Olá, sou Aji omi, pesquisadora pós-doutora do laboratório Budget COS do Departamento de Fisiologia da Universidade da Califórnia em Los Angeles. Hoje mostraremos um procedimento para imagem de cálcio em astócitos.Utilizamos este procedimento em nosso estudo laboratorial sobre a dinâmica global do cálcio e próxima à membrana em um osteócito. Ao alterar rapidamente e automaticamente a eliminação, podemos distinguir o cálcio global do cálcio próximo à membrana. Quase simultaneamente, mostrarei como aplicamos um TP para induzir o aumento de cálcio em astrócitos.Em seguida, concluirei resumindo e discutindo a barreira com o método para estudar o astrócito. Vamos então começar o estudo. Para iniciar o cultivo de astrócitos, remova a pele e o crânio da cabeça de uma pupa de rato decapitada.Coloque o cérebro em uma placa de Petri contendo meio de dissecção frio, dissecione ambos os hemisférios e remova as meninges. Em seguida, dissecione os hipocampos. Corte os hipocampos em pedaços de aproximadamente um por um milímetro.Digira na solução Pappa a 37 graus Celsius por 11 a 13 minutos. Retire o tecido dissecado do incubador. Em seguida, assim que os pedaços de tecido se assentarem, remova-os cuidadosamente da digestão com propano e adicione cinco mililitros de meio hipocampal para lavar os pedaços picados de hipocampo.Repita este passo e, finalmente, re-suspenda no meio hipocampal. Passe as células cerca de cinco vezes por pipetas flamejadas e progressivamente menores. Após isso, passe as células através de um filtro celular com porosidade de 70 micrômetros e adicione quatro mililitros de meio ao filtro.Conte as células em 10 microlitros de suspensão. Ajuste o volume do meio hipocampal para obter 400.000 células por mililitro. Agora, prepare lâminas para semear a suspensão celular aspirando o laminina das lâminas, que foram expostas à solução de laminina durante a noite.Antes de deixar as lamínulas secarem, plaque 200 microlitros da suspensão celular por lamínula. Deixe-as aderirem por 60 minutos no incubador. Após a incubação, adicione dois mililitros de meio hipocampal por poço.No dia seguinte, aspire o meio antigo do hipocampo para remover células mortas e debris e adicione dois mililitros de meio fresco do hipocampo previamente aquecido. A manutenção do meio de culturas co-cultivadas de astrócitos e neurônios deve começar quatro dias após o plaqueamento, adicionando um mililitro de meio neurobasal fresco duas vezes por semana. Certifique-se de pré-incubar os meios por cerca de 30 minutos no incubador em um frasco ventilado para equilibrar a temperatura e o dióxido de carbono.Antes de estudar os astrócitos, é útil observar microesferas fluorescentes nano para otimizar o ângulo do laser para a microscopia TURF. Para isso, coloque 200 microlitros de água no recipiente de Petri e adicione um microlitro de microesferas fluorescentes de 100 nanômetros, misture e observe as microesferas por microscopia de fluorescência epiluminiscente. Em seguida, observe as microesferas por microscopia TURF.Para a imagem de cálcio, coloque a cultura em um poço de uma placa de seis poços contendo dois mililitros de tampão de gravação hipocampal com 2,5 micromolar de fluo-4 AM e 0,05% de Pluronic F127, 20% em solução de DMSO, e incube à temperatura ambiente por 10 a 30 minutos. Lembre-se de cobrir a placa para evitar o desbotamento do corante. Em seguida, remova a solução de fluo-4 e lave as lamínulas três vezes com tampão de gravação hipocampal. Incube as lamínulas lavadas à temperatura ambiente por 30 minutos.Coloque a lamínula na câmara, limpe o outro lado da lamínula com líquido de limpeza para lentes e adicione 200 microlitros de tampão hipocampal. Coloque uma pequena gota de óleo de imersão na objetiva e posicione a câmara sobre a platina do microscópio. Observe as células utilizando luz de transmissão para focalizar e verificar a aparência das células.Em seguida, ilumine as células com 488 nanômetros de um monocromador e determine se o sinal fluorescente do flu oh four é uniforme e detectável. Em astrócitos, utilize iluminação epi e turf para medir o cálcio nos astrócitos. Aqui, microesferas fluorescentes são observadas por iluminação epi.Além de produzir fluorescência de fundo, eles também exibem movimento browniano significativo conforme o ângulo de iluminação. Quando o laser se aproxima do ângulo crítico, o feixe de laser é totalmente refletido na interface entre vidro e água. Essa reflexão total interna gera um campo eletromagnético denominado campo evanescente.Isso tem uma profundidade na célula de menor índice de refração de cerca de 100 nanômetros. É possível excitar fluoróforos nesta camada fina na superfície do espécime. Abaixo, há microesferas fluorescentes observadas por iluminação de campo total em comparação com a iluminação epifluorescente.A relação sinal-ruído da iluminação aumenta significativamente quando você reduz o ângulo. O feixe do laser não reflete na superfície e atravessa a lamínula para atingir diretamente as microesferas fluorescentes. É possível observar muita fluorescência de fundo.Agora aumentamos o ângulo. Novamente, o ruído de fundo diminui significativamente e é possível observar microesferas fluorescentes próximas à superfície da lamínula. Essas imagens mostram astrócitos e neurônios carregados com flu oh quatro.Os astrócitos são células achatadas com prolongamentos finos, enquanto os neurônios possuem corpos celulares arredondados e dendritos grossos e longos. Tanto os astrócitos quanto os neurônios parecem saudáveis e carregam flu. Oh quatro corretamente.Analisar astrócitos por microscopia epifluorescente ou confocal é útil para verificar se os astrócitos estão saudáveis e se os indicadores de cálcio foram carregados adequadamente nos astrócitos. Nas regiões dos astrócitos mais próximas ao vidro de cobertura, denominadas área de aderência, observa-se que um TP provoca um aumento de cálcio próximo à membrana plasmática. Sabe-se que astrócitos do hipocampo expressam receptores anérgicos puros e que a aplicação de um TP no banho pode causar uma liberação global de cálcio.Acabamos de mostrar como preparar cultura de osteócitos do hipocampo e como medir o nível de cálcio em um osteócito tanto globalmente quanto próximo à membrana plasmática. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de otimizar o ângulo do laser; a melhor maneira de garantir isso no microscópio é observar o comportamento em velocidades de fluxo de 100 milímetros. O registro simultâneo do cálcio global e do nível de cálcio próximo à membrana nos fornecerá não apenas uma descrição detalhada do sinal de cálcio, mas também novas perspectivas sobre o mecanismo de regulação de cálcio em astrócitos.Também nos ocorreu que a abordagem descrita aqui é útil para medir os níveis de cálcio intracelular próximos à membrana e globais em outros campos excitáveis desconhecidos. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A preparação de fatias cerebrais agudas de isolado hipocampo, assim como as gravações simultâneas electrofisiológicas de astrócitos e neurónios...

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Fonte: Bannai, H., et. al., Dissecção de sinais locais de Ca2+ em células cultivadas por indicadores de Ca2+ direcionados à membrana. J. Vis. Exp. (2019)O vídeo demonstra imagens de fluorescência para observar a dinâmica espontânea do cálcio específica do compartimento em astrócitos, monitorando sequencialmente proteínas sensíveis ao cálcio localizadas na membrana plasmática e no retículo endoplasmático.

Imagem espontânea de cálcio para dinâmica específica do compartimento em astrócitos

Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melhor apreciação da sensibilidade dos receptores...

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

As propriedades e funções dos sinais intracelulares de Ca2+ dos astrócitos no estriado permanecem incompletamente exploradas. Descrevemos métodos para expressar indicadores de cálcio geneticamente codificados em astrócitos estriados usando vírus adeno-associados do sorotipo 2/5 (AAV2/5), bem como procedimentos para obter imagens confiáveis de sinais de Ca2+ em astrócitos estriados in situ.

Imagens intracelular Ca 2+ Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados

O protocolo AWESAM descrito aqui é ideal para o cultivo de astrócitos murino em isolamento de outras células do cérebro de forma rápida, simples e barato. Astrócitos AWESAM exposição espontânea Ca2 + sinalização, morfologia e gene expressão perfis semelhantes de astrócitos na vivo.

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

Demonstrado aqui são protocolos para isolar (1) recém endoteliais cerebrais intactos "tubos" e medições (2) simultâneas de cálcio endotelial e potencial durante o endotélio-derivado hiperpolarização de membrana. Além disso, esses métodos permitem a otimização farmacológica de cálcio da célula endotelial e sinalização eléctrica como variáveis experimentais individuais ou interativas.

Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Aqui nós apresentamos um protocolo para Ca2 + imagem em neurônios e células gliais, que permite que a dissecação de Ca2 + sinais em resolução subcellular. Este processo é aplicável a todos os tipos de células que permitem a expressão de geneticamente codificado Ca2 + indicadores.

Dissecação de locais de Ca2 + sinais em pilhas cultivadas pelos indicadores de membrana-alvo Ca2 +

Aqui nós descrevemos um método vivo-imagem latente in vitro para visualizar o transporte intracelular das organelas e o tráfico de proteínas da membrana de plasma em astrocytes murino. Este protocolo também apresenta uma metodologia de análise de imagem para determinar itinerários de transporte de carga e cinética.

Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos

Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios.

Imagem Mitocondrial Ca2+ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca2+ Codificados Geneticamente (GECIs)

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Esse protocolo fornece uma descrição abrangente de um método para o registro simultâneo de sinais de cálcio de neurônios e astrócitos em múltiplas regiões cerebrais relacionadas à memória e demonstra sua aplicação durante um paradigma de aprendizagem e comportamento da memória.

Um método de fotometria de fibra bicolorida para registrar a atividade dos neurônios dos astrócitos em múltiplas regiões cerebrais durante comportamentos de aprendizagem e memória

Aprenda a medir dinâmica de cálcio global e próximo à membrana plasmática em astrócitos usando microscopia de epifluorescência e reflexão interna total. Este método permite observação simultânea dos sinais de cálcio.

Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos

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