Name: Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprenda a isolar protoplastos intactos de plântulas de Arabidopsis thaliana com 14 dias. Este método utiliza digestão enzimática e gradiente de densidade de sacarose para obter células viáveis por pelo menos 96 horas.

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Este trabalho foi financiado pela Estação Experimental Agrícola da Universidade de Cornell (CUAES) NYC-125433 escotilha Grant e Cornell Start-Up Grant concedido a OKV

Parte 1. Preparação de meio sólido para o crescimento das plantas. Normalmente, as plantas de cultura concentrada Murasige e Skoog (MS) suplementado com 1% de sacarose e ágar 0,7%. Ele contém todos os ingredientes necessários para manter as plantas saudáveis. Para preparar 1L de MS, pH 5,7 mídia <ol><li> Adicionar 2,15 g de MS pó em 800 ml de água em 1,5 2.0L garrafa autoclavável. </li><li> Colocar uma barra de agitação dentro da garrafa e dissolver o pó MS por meio de agitação médio em uma placa de agitação. </li><li> Agitando, adicione, gota a gota, KOH 1N para ajustar o pH do meio MS para 5,7. </li><li> Adicionar 10 g de sacarose, continue a mexer. </li><li> Adicionar 7 g de ágar *. </li><li> Ajustar o volume final do meio preparado para 1000 ml e esterilizar em autoclave .* </li><li> Lugar autoclavado médio em uma placa de agitação e esfriá-la, agitando, de modo que agar não irá precipitar no fundo da garrafa. Arrefecer médio a ~ 60 ° C. * </li><li> Colocar 100 milímetros placas de Petri. Manter placas a 4 ° C. </li></ol> * Dica 1: Não tente dissolver agar. Ele irá solubilizar durante autoclavagem. * Dica 2: Manter a barra de agitação em uma garrafa durante a autoclavagem, você vai precisar dele mais tarde. * Dica 3: Se você pode manter suas mãos no frasco autoclavado por 10 s, isso significa que o meio esfriou o suficiente e você pode começar a verter placas. Parte 2. Material vegetal e as condições de crescimento. <ol><li> Esterilizar sementes de Arabidopsis thaliana <ol><li> Coloque 100 mg de sementes em tubos de microcentrífuga eppendorf e adicionar 1 ml de etanol 70%. Misturar bem e incubar por 2 min. Spin-baixo sementes, aspirar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de água sanitária 1,8% * contendo 0,1% Tween-20. Misture por 10 min. Spin down sementes e solução de água sanitária aspirar. </li><li> Este passo tem que ser feito em uma capela de fluxo laminar. Adicionar 1 ml de água estéril para sementes, misture bem. Spin down sementes, aspirar água. Repita este passo 5 vezes. </li></ol></li><li> Espalhar sementes para o preparado na etapa 1 placas (100 sementes / placa). </li><li> Manter placas semeadas por 24-48 horas a 4 ° C no escuro por estratificação. </li><li> Crescer as plantas por 14 dias na câmara de crescimento com 8 h light/16 h escuro fotoperíodo (a uma densidade de fluxo de fótons fotossinteticamente ativos de 250 mmol m -2 s -1) em 23 / ​​19 ° C de temperatura regime de claro / escuro e relativa de 75% umidade. </li></ol> * Dica 1: solução de água sanitária é feita por diluição-up uma casa Clorox, contendo hipoclorito de sódio 6% e adição de Tween-20 a uma concentração final de 0,1%. Parte 3. Isolamento de protoplastos a partir de mudas de Arabidopsis. <ol><li> Slice 2 g de 14 dias de idade, mudas com uma lâmina de barbear fresco em 15 ml de solução esterilizada por filtração, TVL. Nós dividimos o material vegetal em pratos descartáveis ​​estéreis Petri. </li><li> Transferência de tecidos cortados em 200 ml copo, adicione 20 ml de solução enzimática, esterilizada por filtração, redemoinho o copo para que os tecidos se misturam com solução enzimática, cubra com parafilme e papel alumínio. </li><li> Agite tecidos da planta em 35 rpm, no escuro em temperatura ambiente por 16-18 h. </li><li> Recolher os protoplastos liberados em 50 tubos Falcon ml por peneiramento a 8 camadas de pano de queijo, pré-molhada em solução W5. </li><li> Protoplastos peneira do queijo de pano mais uma vez, lavando o pano com 15 ml de solução W5. </li><li> Cuidadosamente protoplastos overlay com 10 ml de solução W5, não perturbem o gradiente de açúcar; centrífuga por 7 min a 100 g. </li><li> Coletar 10 ml de protoplastos na interface da solução enzimática e solução W5 (Figura 1B) e transferir para um novo tubo de 50 ml Falcon. </li><li> Adicionar 15 ml da solução W5, centrifugar por 5 min a 60 g. Remover o sobrenadante. </li><li> Lavar protoplastos livre de solução enzimática pela ressuspensão de protoplastos em 15ml de solução W5 centrífuga, por 5min a 60 g </li><li> Remover o sobrenadante, ressuspender protoplastos peletizada em 1-3ml solução W5. </li><li> Avaliar o rendimento de protoplastos por célula contando com um hemocitômetro. </li></ol> Parte 4. Reagentes: TVL: 0,3 M sorbitol; 50 mM CaCl 2 Filter-esterilizar e armazenar a -20 ° C. Solução da enzima: 0,5 M de sacarose, 10 mM MES-KOH [pH 5,7], 20 mM CaCl 2, 40 mM KCl, celulase 1% (Onozuka R-10), Macerozyme 1% (R10). Filtro de esterilizar e recém-uso. W5 Solução: 0,1% (w / v) de glicose, 0,08% (w / v) KCl, 0,9% (w / v) de NaCl, 1,84% (w / v) CaCl 2, 2 mM MES-KOH pH 5.7. Filtro de esterilizar e armazenar à temperatura ambiente. Parte 5: Resultados Representante: Usando condições de cultura Arabidopsis descrito nas partes 1 e 2 torna mudas sadias, servem para isolar protoplastos (Fig. 1A). Protoplastos são purificados pelo sacarose densidade Gradicentrifugação ent e recolhidos na interface da W5 e soluções de enzimas (Figura 1B). Usando o procedimento de protoplastos de isolamento descritas na Parte 3, tipicamente colheita outubro 05-10 6 de protoplastos intactos (Fig. 1C) de um grama de mudas frescas. <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Isolamento de protoplastos a partir de mudas de Arabidopsis. A, tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis foram coletados e convertidos em protoplastos através de um procedimento modificado de (Chen e Halkier, 2000). B, Protoplastos foram purificadas por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose e recolhidos na interface da solução de enzima e W5 uffer (setas brancas). C, Bright microscopia de campo de protoplastos. Microfotografias foram coletados por meio de uma câmera CCD refrigerado interface com o Axioscope Zeiss 2 mais microscópio.

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

A patente provisória que descreve este procedimento para a sua utilização em análises funcionais de genes de plantas foram arquivados com Cornell Centro para a Empresa de Tecnologia e Comercialização (CCTEC), junho de 2008. Docket 50341/015001: Vatamaniuk, OK, e Zhai, Z. Método para rápida análise funcional de genes da planta.

Para garantir o alto rendimento de protoplastos intactos é muito importante para start-up com as plantas saudáveis. Use filtro esterilizar soluções para isolar protoplastos. Lembre-se que protoplastos são frágeis. Portanto, quando você está lidando com protoplastos, não se misturam, pipeta ou vortex-os vigorosamente, uma vez que vai de freio-los. Em vez disso, misture protoplastos girando lentamente ou com fita do tubo de centrifugação. O procedimento descrito rendimento de protoplastos intactos que são viáveis ​​para p...

<table><tbody><tr><td>Mistura de Sais Basais de Murashige e Skoog (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (100x15 mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase (Onozuka R&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme (R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>Pano de pano de algodão cru</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>LabRotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra X&amp;#8208;15R</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Axioskop 2 Plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de arabidopsis thaliana</em

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplastos são células vegetais que tiveram suas paredes celulares enzimaticamente removido. Isolamento de protoplastos a partir de tecidos diferentes de plantas foi relatada pela primeira vez mais de 40 anos atrás<sup&gt; 1</sup&gt; E desde então tem sido adaptado para estudar uma variedade de processos celulares, tais como localização subcelular de proteínas, o isolamento de organelas intactas e orientada inativação de genes por interferência de RNA dupla fita (RNAi)<sup&gt; 05/02</sup&gt;. A maioria dos protocolos de isolamento de protoplastos use tecidos de folhas de Arabidopsis maduros (por exemplo, 35 dias de idade das plantas)<sup&gt; 04/02</sup&gt;. Nós modificamos os protocolos existentes, empregando mudas de 14 dias de idade Arabidopsis. Neste procedimento, um grama de 14 dias de idade mudas rendeu 5 10<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt; Protoplastos que permanecem intactos, pelo menos, 96 horas. O rendimento de protoplastos a partir de mudas é comparável com os preparativos das folhas de Arabidopsis maduro, mas ao invés de 35-36 dias, o isolamento de protoplastos é concluído em 15 dias. Isto permite diminuir o tempo eo espaço câmara de crescimento que são necessários para isolar protoplastos quando as plantas maduras são usadas, e acelera os estudos a jusante que exigem protoplastos intactos.

Este vídeo mostra um procedimento para isolar protoplastos intactos a partir de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis. Dado que o protoplastos isolados permanecem intactos por pelo menos 96h e são isoladas de mudas, em vez de um mês de idade plantas maduras, esse procedimento agiliza ensaios exigindo protoplastos intactos.

Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana</em

Protoplastos são células vegetais que tiveram suas paredes celulares removidas enzimaticamente. O isolamento de protoplastos de diferentes tecidos vegetais foi primeiramente...

Este procedimento começa com o plaqueamento de sementes de arabidopsis em ágar MS no dia 14. Após a germinação das sementes, as plântulas são coletadas e fatiadas. O material vegetal é então digerido em uma solução enzimática que degrada a parede celular.A mistura resultante é filtrada através de uma gaze para separar os protoplastos de outros materiais vegetais. Os protoplastos coletados são posteriormente purificados em um gradiente de densidade de sacarose, colocando-os em camadas com a solução W cinco. Os protoplastos se concentram na interface entre a enzima e a solução W cinco.Eles são coletados e lavados antes dos experimentos. Olá, sou Jang Ja do laboratório de Lina Wauk do Departamento de Ciências de Culturas e Solos da Cornell University. Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento de fotossistemas intactos de TH de 14 dias de aro Ana.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a localização subcelular das proteínas de interesse, para o isolamento de organelas intactas e para a análise funcional de genes usando interferência por RNA de dupla fita. Então, vamos começar. Iniciamos o procedimento preparando placas de MS 0,5 vezes, suplementadas co

isolation-protoplasts-from-tissues-14-day-old-seedlings-arabidopsis

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Biology

Biologia

Um método para isolar tipos específicos de células a partir de material vegetal é demonstrada. Esta técnica emprega linhas marcador transgênicos expressando proteínas fluorescentes em tipos de células particular, celular dissociação e classificação de fluorescência celular ativado. Além disso, uma instalação de crescimento é estabelecido aqui que facilita o tratamento...

Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

A base molecular do espaço-respostas específicas fitocromo está sendo investigado o uso de plantas transgênicas que apresentam tecidos e órgãos específicos deficiências fitocromo. O isolamento de células específicas exibindo esgotamento cromóforo fitocromo induzida por fluorescência-Activated Celular classificação seguido por análises de microarray está sendo utilizada para identificar genes envolvidos em respostas espaciais específicos fitocromo.

Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana</em

Nós descrevemos um protocolo com lâminas de câmara e de mídia para imobilizar cotilédones de plantas para imagem confocal da epiderme durante vários dias de desenvolvimento, documentação diferenciação estomática. Proteínas fluoróforo com a tag pode ser monitorado de forma dinâmica por expressão e localização subcelular, aumentando a compreensão de seus possíveis papéis durante a divisão celular e diferenciação do tipo de célula.

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Nós relatamos um método eficiente e simples para isolar os embriões em estágios iniciais de desenvolvimento...

Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sementes

O relógio circadiano regula a cerca de um terço do transcriptoma de Arabidopsis, mas a percentagem de genes que se alimentam de volta para cronometragem permanece desconhecida. Aqui nós visualizamos um método para avaliar rapidamente os fenótipos circadianos em qualquer linha mutante de Arabidopsis utilizando imagens luminescentes de um repórter circadiano transitoriamente expressa em protoplastos.

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A viabilidade e a eficácia de métodos scRNA-seq de alto rendimento anunciam uma era de célula única na pesquisa de plantas. Apresentamos aqui um procedimento robusto e completo para o isolamento de tipos específicos de células de raízes de Arabidopsis thaliana e posterior construção e análise da biblioteca de transcriptomas.

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Este protocolo descreve a preparação de amostras intactas da camada de células do endosperma em sementes de Arabidopsis thaliana . O método requer apenas equipamentos de laboratório comuns, como agulha de injeção e pinça de precisão, e permite imagens fluorescentes de células vivas de alta resolução de células do endosperma em sementes em desenvolvimento e maduras.

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Floral-dip Transformação de Arabidopsis thaliana Examine a PTSO2:: β-glucuronidase Expressão Gênica Reporter

Aprenda a isolar protoplastos intactos de plântulas de Arabidopsis thaliana com 14 dias. Este método utiliza digestão enzimática e gradiente de densidade de sacarose para obter células viáveis por pelo menos 96 horas.

Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana

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