Name: Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprenda a isolar protoplastos intactos de plântulas de Arabidopsis thaliana com 14 dias. Este método utiliza digestão enzimática e gradiente de densidade de sacarose para obter células viáveis por pelo menos 96 horas.

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Este trabalho foi financiado pela Estação Experimental Agrícola da Universidade de Cornell (CUAES) NYC-125433 escotilha Grant e Cornell Start-Up Grant concedido a OKV

Parte 1. Preparação de meio sólido para o crescimento das plantas. Normalmente, as plantas de cultura concentrada Murasige e Skoog (MS) suplementado com 1% de sacarose e ágar 0,7%. Ele contém todos os ingredientes necessários para manter as plantas saudáveis. Para preparar 1L de MS, pH 5,7 mídia <ol><li> Adicionar 2,15 g de MS pó em 800 ml de água em 1,5 2.0L garrafa autoclavável. </li><li> Colocar uma barra de agitação dentro da garrafa e dissolver o pó MS por meio de agitação médio em uma placa de agitação. </li><li> Agitando, adicione, gota a gota, KOH 1N para ajustar o pH do meio MS para 5,7. </li><li> Adicionar 10 g de sacarose, continue a mexer. </li><li> Adicionar 7 g de ágar *. </li><li> Ajustar o volume final do meio preparado para 1000 ml e esterilizar em autoclave .* </li><li> Lugar autoclavado médio em uma placa de agitação e esfriá-la, agitando, de modo que agar não irá precipitar no fundo da garrafa. Arrefecer médio a ~ 60 ° C. * </li><li> Colocar 100 milímetros placas de Petri. Manter placas a 4 ° C. </li></ol> * Dica 1: Não tente dissolver agar. Ele irá solubilizar durante autoclavagem. * Dica 2: Manter a barra de agitação em uma garrafa durante a autoclavagem, você vai precisar dele mais tarde. * Dica 3: Se você pode manter suas mãos no frasco autoclavado por 10 s, isso significa que o meio esfriou o suficiente e você pode começar a verter placas. Parte 2. Material vegetal e as condições de crescimento. <ol><li> Esterilizar sementes de Arabidopsis thaliana <ol><li> Coloque 100 mg de sementes em tubos de microcentrífuga eppendorf e adicionar 1 ml de etanol 70%. Misturar bem e incubar por 2 min. Spin-baixo sementes, aspirar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de água sanitária 1,8% * contendo 0,1% Tween-20. Misture por 10 min. Spin down sementes e solução de água sanitária aspirar. </li><li> Este passo tem que ser feito em uma capela de fluxo laminar. Adicionar 1 ml de água estéril para sementes, misture bem. Spin down sementes, aspirar água. Repita este passo 5 vezes. </li></ol></li><li> Espalhar sementes para o preparado na etapa 1 placas (100 sementes / placa). </li><li> Manter placas semeadas por 24-48 horas a 4 ° C no escuro por estratificação. </li><li> Crescer as plantas por 14 dias na câmara de crescimento com 8 h light/16 h escuro fotoperíodo (a uma densidade de fluxo de fótons fotossinteticamente ativos de 250 mmol m -2 s -1) em 23 / ​​19 ° C de temperatura regime de claro / escuro e relativa de 75% umidade. </li></ol> * Dica 1: solução de água sanitária é feita por diluição-up uma casa Clorox, contendo hipoclorito de sódio 6% e adição de Tween-20 a uma concentração final de 0,1%. Parte 3. Isolamento de protoplastos a partir de mudas de Arabidopsis. <ol><li> Slice 2 g de 14 dias de idade, mudas com uma lâmina de barbear fresco em 15 ml de solução esterilizada por filtração, TVL. Nós dividimos o material vegetal em pratos descartáveis ​​estéreis Petri. </li><li> Transferência de tecidos cortados em 200 ml copo, adicione 20 ml de solução enzimática, esterilizada por filtração, redemoinho o copo para que os tecidos se misturam com solução enzimática, cubra com parafilme e papel alumínio. </li><li> Agite tecidos da planta em 35 rpm, no escuro em temperatura ambiente por 16-18 h. </li><li> Recolher os protoplastos liberados em 50 tubos Falcon ml por peneiramento a 8 camadas de pano de queijo, pré-molhada em solução W5. </li><li> Protoplastos peneira do queijo de pano mais uma vez, lavando o pano com 15 ml de solução W5. </li><li> Cuidadosamente protoplastos overlay com 10 ml de solução W5, não perturbem o gradiente de açúcar; centrífuga por 7 min a 100 g. </li><li> Coletar 10 ml de protoplastos na interface da solução enzimática e solução W5 (Figura 1B) e transferir para um novo tubo de 50 ml Falcon. </li><li> Adicionar 15 ml da solução W5, centrifugar por 5 min a 60 g. Remover o sobrenadante. </li><li> Lavar protoplastos livre de solução enzimática pela ressuspensão de protoplastos em 15ml de solução W5 centrífuga, por 5min a 60 g </li><li> Remover o sobrenadante, ressuspender protoplastos peletizada em 1-3ml solução W5. </li><li> Avaliar o rendimento de protoplastos por célula contando com um hemocitômetro. </li></ol> Parte 4. Reagentes: TVL: 0,3 M sorbitol; 50 mM CaCl 2 Filter-esterilizar e armazenar a -20 ° C. Solução da enzima: 0,5 M de sacarose, 10 mM MES-KOH [pH 5,7], 20 mM CaCl 2, 40 mM KCl, celulase 1% (Onozuka R-10), Macerozyme 1% (R10). Filtro de esterilizar e recém-uso. W5 Solução: 0,1% (w / v) de glicose, 0,08% (w / v) KCl, 0,9% (w / v) de NaCl, 1,84% (w / v) CaCl 2, 2 mM MES-KOH pH 5.7. Filtro de esterilizar e armazenar à temperatura ambiente. Parte 5: Resultados Representante: Usando condições de cultura Arabidopsis descrito nas partes 1 e 2 torna mudas sadias, servem para isolar protoplastos (Fig. 1A). Protoplastos são purificados pelo sacarose densidade Gradicentrifugação ent e recolhidos na interface da W5 e soluções de enzimas (Figura 1B). Usando o procedimento de protoplastos de isolamento descritas na Parte 3, tipicamente colheita outubro 05-10 6 de protoplastos intactos (Fig. 1C) de um grama de mudas frescas. <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Isolamento de protoplastos a partir de mudas de Arabidopsis. A, tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis foram coletados e convertidos em protoplastos através de um procedimento modificado de (Chen e Halkier, 2000). B, Protoplastos foram purificadas por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose e recolhidos na interface da solução de enzima e W5 uffer (setas brancas). C, Bright microscopia de campo de protoplastos. Microfotografias foram coletados por meio de uma câmera CCD refrigerado interface com o Axioscope Zeiss 2 mais microscópio.

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

A patente provisória que descreve este procedimento para a sua utilização em análises funcionais de genes de plantas foram arquivados com Cornell Centro para a Empresa de Tecnologia e Comercialização (CCTEC), junho de 2008. Docket 50341/015001: Vatamaniuk, OK, e Zhai, Z. Método para rápida análise funcional de genes da planta.

Para garantir o alto rendimento de protoplastos intactos é muito importante para start-up com as plantas saudáveis. Use filtro esterilizar soluções para isolar protoplastos. Lembre-se que protoplastos são frágeis. Portanto, quando você está lidando com protoplastos, não se misturam, pipeta ou vortex-os vigorosamente, uma vez que vai de freio-los. Em vez disso, misture protoplastos girando lentamente ou com fita do tubo de centrifugação. O procedimento descrito rendimento de protoplastos intactos que são viáveis ​​para p...

<table><tbody><tr><td>Mistura de Sais Basais de Murashige e Skoog (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (100x15 mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase (Onozuka R&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme (R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>Pano de pano de algodão cru</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>LabRotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra X&amp;#8208;15R</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Axioskop 2 Plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de arabidopsis thaliana</em

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplastos são células vegetais que tiveram suas paredes celulares enzimaticamente removido. Isolamento de protoplastos a partir de tecidos diferentes de plantas foi relatada pela primeira vez mais de 40 anos atrás<sup&gt; 1</sup&gt; E desde então tem sido adaptado para estudar uma variedade de processos celulares, tais como localização subcelular de proteínas, o isolamento de organelas intactas e orientada inativação de genes por interferência de RNA dupla fita (RNAi)<sup&gt; 05/02</sup&gt;. A maioria dos protocolos de isolamento de protoplastos use tecidos de folhas de Arabidopsis maduros (por exemplo, 35 dias de idade das plantas)<sup&gt; 04/02</sup&gt;. Nós modificamos os protocolos existentes, empregando mudas de 14 dias de idade Arabidopsis. Neste procedimento, um grama de 14 dias de idade mudas rendeu 5 10<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt; Protoplastos que permanecem intactos, pelo menos, 96 horas. O rendimento de protoplastos a partir de mudas é comparável com os preparativos das folhas de Arabidopsis maduro, mas ao invés de 35-36 dias, o isolamento de protoplastos é concluído em 15 dias. Isto permite diminuir o tempo eo espaço câmara de crescimento que são necessários para isolar protoplastos quando as plantas maduras são usadas, e acelera os estudos a jusante que exigem protoplastos intactos.

Este vídeo mostra um procedimento para isolar protoplastos intactos a partir de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis. Dado que o protoplastos isolados permanecem intactos por pelo menos 96h e são isoladas de mudas, em vez de um mês de idade plantas maduras, esse procedimento agiliza ensaios exigindo protoplastos intactos.

Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana</em

Protoplastos são células vegetais que tiveram suas paredes celulares removidas enzimaticamente. O isolamento de protoplastos de diferentes tecidos vegetais foi primeiramente...

Este procedimento começa com o plaqueamento de sementes de arabidopsis em ágar MS no dia 14. Após a germinação das sementes, as plântulas são coletadas e fatiadas. O material vegetal é então digerido em uma solução enzimática que degrada a parede celular.A mistura resultante é filtrada através de uma gaze para separar os protoplastos de outros materiais vegetais. Os protoplastos coletados são posteriormente purificados em um gradiente de densidade de sacarose, colocando-os em camadas com a solução W cinco. Os protoplastos se concentram na interface entre a enzima e a solução W cinco.Eles são coletados e lavados antes dos experimentos. Olá, sou Jang Ja do laboratório de Lina Wauk do Departamento de Ciências de Culturas e Solos da Cornell University. Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento de fotossistemas intactos de TH de 14 dias de aro Ana.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a localização subcelular das proteínas de interesse, para o isolamento de organelas intactas e para a análise funcional de genes usando interferência por RNA de dupla fita. Então, vamos começar. Iniciamos o procedimento preparando placas de MS 0,5 vezes, suplementadas com 1% de sacarose e 0,7% de ágar, para um litro de meio.Pese 2,15 gramas de pó MS. Adicione a 800 mililitros de água em um frasco esterilizável de 1,5 litro contendo um bastão de agitação e agite o meio em uma placa de agitação para dissolver o pó, sob agitação. Adicione gota a gota hidróxido de potássio 1 N para ajustar o pH a 5,7.Continue a agitação e adicione 10 gramas de sacarose. Em seguida, adicione sete gramas de ágar, que não se dissolve, mas será solubilizado posteriormente durante a autoclavação. E, por fim, ajuste o volume para 1000 mililitros.Esterilize o meio MS em autoclave a 121 graus Celsius por 20 minutos. Mantenha o bastão de agitação no frasco após a autoclavação. Agite o meio em uma placa de agitação para resfriá-lo até aproximadamente 60 graus Celsius.Agitar durante o resfriamento evita que o ágar precipite no fundo do frasco. Se for possível manter as mãos no frasco por 10 segundos, o meio já esfriou o suficiente e as placas podem ser preparadas. Transfira-se para a cabine de segurança para verter o meio em placas de Petri de 150 por 15 milímetros.90 mililitros por placa. Armazene as placas a quatro graus Celsius. Agora que as placas estavam crescendo, as plantas estão prontas.Vamos preparar as sementes de Arabidopsis. Comece o cultivo das plantas esterilizando as sementes de Arabidopsis para plaqueamento em uma placa de Petri. Coloque as sementes em um tubo microcentrífugo einor em uma quantidade equivalente a 50 microlitros de volume.Primeiro, esterilize com etanol adicionando um mililitro de etanol 70% e misturando. Incube bem com o etanol por dois minutos, durante os quais as sementes irão sedimentar. Remova o máximo possível do etanol utilizando uma pipeta. Em seguida, esterilize com hipoclorito adicionando um mililitro de uma solução de hipoclorito com tween e misture por 10 minutos, agitando em vórtex a cada dois ou três minutos.Para facilitar a remoção da solução de hipoclorito, gire rapidamente os tubos para sedimentar os sementes e retire com pipeta o máximo possível da solução. O passo final de esterilização é realizado em uma cabine de fluxo laminar. Adicione um mililitro de água estéril aos sementes e misture bem.Dê uma breve centrifugação às sementes e aspire a água. Repita essa lavagem com água mais quatro vezes. Agora que as sementes estão esterilizadas, espalhe-as no meio de cultura MS.Após espalhar as sementes, mantenha as placas semeadas por 24 horas a quatro graus Celsius no escuro para estratificação. Após as 24 horas de incubação, transfira as plantas para um ambiente de crescimento e cultive-as por 14 dias. Em um ciclo de oito horas de luz e 16 horas de escuro, as plântulas com 14 dias estarão prontas para colheita.Agora que as plântulas cresceram por duas semanas, é hora de preparar os protoplastos na câmara de fluxo laminar. Use uma lâmina de barbear nova para fatiar dois gramas de plântulas em 15 mililitros de solução TVL esterilizada por filtração em uma placa de Petri. Em seguida, transfira os tecidos picados para um béquer de 200 mililitros envolto em papel alumínio.Adicione 20 mililitros de solução enzimática recém-preparada e esterilizada por filtração para degradar a parede celular da planta. Agite o béquer para misturar e cubra com filme biológico e papel alumínio para manter o tecido no escuro. Prossiga com a agitação dos tecidos vegetais na solução enzimática por 16 horas à temperatura ambiente.No final da incubação com a solução enzimática, colete os protoplastos liberados em um tubo cônico de 50 mililitros passando a mistura por oito camadas de gaze previamente umedecidas com solução W cinco. Passe os protoplastos remanescentes lavando lentamente a gaze com 10 mililitros de solução W cinco. Os protoplastos agora estão coletados no tubo cônico. Cubra cuidadosamente os protoplastos com cinco mililitros de solução WW cinco.Tenha cuidado para não perturbar o gradiente de açúcar formado pela adição da solução W cinco. Em seguida, centrifugue os protoplastos por sete minutos a 100 Gs. Os protoplastos acumulam-se na interface entre a solução enzimática e a solução W cinco. Colete 10 mililitros de líquido na interface.Transfira os protoplastos coletados para um novo tubo cônico de 50 mililitros e adicione 15 mililitros da solução W cinco. Em seguida, centrifugue por cinco minutos a 60 ×g. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda os protoplastos em 15 mililitros da solução W cinco.Novamente, centrifugue os protoplastos por cinco minutos a 60 gs. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e o ressuspensão. Suspenda os protoplastos em pelota em um a dois mililitros de solução W5.Por fim, avalie o rendimento de protoplastos por meio da contagem celular com um hemocitômetro sob o microscópio. O procedimento de cultivo descrito aqui produz plântulas saudáveis de Arabidopsis, adequadas para o isolamento de protoplastos após digestão e separação em gradiente de densidade. A colheita de um grama de plântulas frescas normalmente produz de cinco a dez vezes dez à sexta potência de protoplastos intactos.Mostramos como isolar protoplastos do teto de aosis com 14 dias de idade. Ao realizar este procedimento, é muito importante lembrar que o sucesso depende de plantas saudáveis. Portanto, é essencial manter uma proporção adequada entre estaca e placa e especificar neste protocolo para net mills, ms.Médio por placa. Por fim, lembre-se de que os portes plus são muito frágeis. Uma vez que a célula seja removida, manipule o bus com cuidado, misturando por pipetagem para cima e para baixo em vez de vórtex.É isso. Obrigado por assistir. Boa sorte com o seu experimento.

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