Name: Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprenda a visualizar a migração de células gliais no olho em desenvolvimento de Drosophila usando imagens ao vivo com marcação GFP. Este protocolo permite estudar a dinâmica celular em biologia do desenvolvimento neural.

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Patrick Cafferty é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá.

Parte 1: Pré-experimental set-up. <ol><li> Uma semana de antecedência, mate moscas para gerar larva que expressam GFP sob o controle de um promotor glial específico. Para nosso experimento foi visualizada GFP marcado com uma seqüência de localização nuclear expresso em células gliais usando a polaridade invertida (repo) promotor (3, 4). </li><li> Prepare tampa desliza pelo menos um dia de antecedência por imersão 18 milímetros lamínulas redondas de 10 minutos em 1% de poli-L-lisina solução e ar seco durante a noite. </li><li> No dia antes do experimento, limpar uma câmara de cultura Chamlide magnética por imersão componentes durante a noite em etanol 70%. </li><li> No dia do experimento, preparar meios de cultura pela adição de soro fetal bovino, penicilina-estreptomicina solução, e de insulina para 10 ml de meio de insetos Schneider, utilizando técnica asséptica. As concentrações de trabalho são: 1X de soro fetal bovino; 100U/ml penicilina; estreptomicina 0.1mg/ml; insulina e 0,2 mg / ml em meio de insetos Schneider (modificado de (5)). </li><li> Permitir que a câmara de cultura para ar seco em uma capa de cultura de células. Lavar o etanol residual da câmara de cultura por lavagem com meio de cultura preparado. </li></ol> Parte 2: Dissecção do complexo Drosophila olho-cérebro. <ol><li> Selecione uma larva do terceiro ínstar vagando do lado de um frasco de voar e coloque em uma gota de meio de cultura refrigeradas em uma placa de Petri sobre gelo por alguns minutos. Refrigeração da larva é recomendada para diminuir as contrações peristálticas do corpo para facilitar a dissecção. </li><li> Coloque a larva refrigerados em uma gota de meio de cultura em um prato Sylgard revestido sob um microscópio de dissecação. </li><li> Sob o microscópio de dissecção, use um par de fórceps Dumont multa para agarrar firme a larva aproximadamente um terço do caminho entre a extremidade posterior. Aguarde até que a larva extrudes ganchos sua boca a partir do final anterior. Segure a boca ganchos com um segundo par de fórceps sobre extensão completa. Para dissecar a larva, puxe lentamente os dois pares de fórceps em direções opostas. O complexo olho-cérebro, junto com as glândulas salivares, órgãos, gordura e tecido imaginal, vai puxar para longe do corpo larval. Não puxe a boca ganchos muito rapidamente caso contrário eles vão arrancar do complexo olho-cérebro. </li><li> Apare as glândulas salivares, corpos gordos, e os discos imaginal usando uma tesoura ultra-fino clipper. Os dois hemisférios do cérebro e olho-discos serão anexados ao cordão nervoso ventral e ganchos boca. </li><li> Coloque uma lamínula 18 milímetros em uma lâmina de vidro. Deixe uma borda da lamínula pendurado na borda do slide para depois pegar a lamínula. Adicionar uma gota de meio de cultura para a lamínula 18 mm. Transferência do complexo olho-cérebro no meio de cultura, segurando os ganchos na boca com uma pinça. Não entender o complexo olho-cérebro diretamente com a pinça ou o tecido será danificado. </li><li> Com uma tesoura de dissecção fina, corte na boca ganchos do complexo olho-cérebro e descartar. Remoção dos ganchos boca é importante para geração de imagens ao vivo como os ganchos na boca vai continuar a contrair-se o meio de cultura fazendo com que o tecido se mova durante microscopia. </li><li> Para visualizar a migração glial no disco imaginal olho, corte cuidadosamente a haste óptica, o tecido fino que liga o cérebro eo disco olho e afasta ou descartar o cérebro (ver figura 1A). Para visualizar glia dentro do talo óptico, deixe o cérebro, talo óptico e disco imaginal olho intacto (ver figura 1E). </li><li> Pick up a lamela com a pinça e desenhar um círculo em volta do tecido embaixo de interesse com um marcador permanente. Este círculo vai ajudar na localização do tecido para microscopia na Parte 4. </li></ol> Parte 3: Montagem do disco imaginal olho em uma câmara de cultura magnético. <ol><li> Utilizando uma pinça, segure a ponta pendurada da lamela. Transferir a lamela ao tabuleiro inferior da câmara de Chamlide magnética sem perturbar o tecido em cultura. </li><li> Coloque o silicone O-ring para o corpo principal da câmara Chamlide. Instale o corpo principal no topo da placa inferior. </li><li> Lentamente, adicionar meio de cultura para a câmara. Não adicione o meio de cultura muito rapidamente ou o tecido de interesse será perturbado. Não encher completamente a câmara para permitir a troca gasosa sob a tampa. </li><li> Delicadamente, coloque a tampa invisível no topo da câmara Chamlide. </li></ol> Parte 4: Visualização de migração de células gliais no disco olho. <ol><li> Coloque a câmara de cultura no palco de um microscópio confocal ou fluorescência. Localize a amostra usando o círculo na lamela como uma referência na baixa ampliação. </li><li> Foco na amostra usando uma lente de 40x. Permitir que o tecido para resolver sobre a lamínula. Capturar imagens do disco óptico do olho ou perseguir a cada 10-15min mais de 3-4 horas. O tecido pode contorcer-se e mover-se fora de foco. Manualmente focando o tecido antes da captura de imagem irá aliviar ªé problema. </li></ol> Parte 5: Os resultados representativos: Realizado corretamente, o nosso protocolo permitiu coletar uma série de imagens de GFP-tagged células gliais que migraram do talo no disco óptico do olho imaginal (Figura 1 BD). Enquanto imagens ao vivo por um período de 60 minutos foi suficiente para observar as mudanças nas posições dos núcleos gliais dentro de um disco de tipo selvagem olho imaginal, núcleos gliais em um mutante de um gene necessário para a migração de células gliais falhou completamente para sair o talo óptica (setas Figura 1 FH). Temos cultivadas olho-cérebro complexos para períodos de até 240 minutos antes de observar a deterioração do tecido cultivado. Após os 240 minutos de tempo-ponto, começamos a observar as células GFP positivas no meio de cultura em torno cultivadas olho-cérebro complexos (seta Figura 2 C). Em GFP disso irá acumular em pontos difusa em todos os tecidos, sugerindo uma quebra na integridade do tecido. <img src="/files/ftp_upload/1155/figure1.png" alt="" width="589" height="241" /> Figura 1: imagem ao vivo de GFP-tagged núcleos gliais do tipo selvagem e mutante desenvolvimento sistemas visual. A, E) Imagens tiradas com contraste de interferência diferencial (DIC) de microscopia do tipo selvagem e mutante cultivadas olho-imaginal discos (ED). No tipo selvagem, células gliais nascem e migram da haste óptica (OS) no olho do disco. O cérebro foi removido para facilitar o achatamento e imagem do disco imaginal olho. BD) microscopia de fluorescência do selvagem disco olho tipo cultivado no imaginal (A) em 0, 30 e 60 pontos tempo minucioso revela GFP-tagged núcleos gliais migrar dentro do disco olho. FH) microscopia de fluorescência do complexo olho-cérebro mutante em (E) em 0, 30 e 60 pontos tempo minucioso demonstra uma estagnação da GFP-tagged núcleos gliais dentro do talo óptico (seta). O cérebro (BR) foi deixado ligado à haste óptica para facilitar a criação de imagens de glia dentro do caule. <img src="/files/ftp_upload/1155/Figure_2.png" alt="" width="600" height="156" /> Figura 2: imagens ao vivo de GFP-tagged membranas gliais em um disco de tipo selvagem olho imaginal. Conseguimos cultivadas olho-cérebro complexos para 240 minutos períodos. Tecidos cultivados mais de 240 minutos começa a quebrar. O meio de cultura em torno do disco de olho imaginal (ED), perseguir óptica (OS), e lobo cerebral (BR) a 0 (A) e 150 minutos (B), em comparação com o 300 minutos de tempo-ponto (C), é livre da GFP células positivas, indicado por uma seta.

<ol><li>Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+chain+migration+requires+pioneer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial chain migration requires pioneer cells.</a> J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).</li>
<li>Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+migration+in+the+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cell migration in the eye disc.</a> J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sepp, K. J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+lacZ+enhancer+trap+lines+to+GAL4+lines+using+targeted+transposition+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 151, 1093-1101 (1999).</li>
<li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epitheia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Neste protocolo, descrevemos a observação da migração de células gliais no disco imaginal olho através de microscopia ao vivo. No nosso exemplo de tipo selvagem (Figura 1 AD), foi utilizado um marcador GFP nuclear para observar a movimentação das células gliais no disco do olho ao longo de uma hora. Em um mutante de um gene candidato necessários para a migração de células gliais actualmente em estudo no nosso laboratório, observamos um adiamento de núcleos de células gliais no talo óptico durante um período de ...

<table><tbody><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Meio para Insetos de Schneider&amp;rsquo;s</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Solução de insulina de pâncreas bovino</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Câmara magnética Chamlide</td><td>Ferramenta</td><td>Live cell Instrument</td><td>CM-R-10</td><td>Câmara do tipo placa de 35 mm para lamínula de 18 mm</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica ultrafina</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont nº 5</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Microscópio</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Qualquer sistema de imagem fluorescente que possua os filtros e excitação necessários para GFP pode ser utilizado.</td></tr></tbody></table>

imagens ao vivo da migração das células da glia no disco drosophila eye imaginal

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Células gliais de ambos os vertebrados e organismos invertebrados devem migrar para regiões de destino final para ensheath e apoio neurônios associados. Embora o progresso recente tem sido feito para descrever a migração de células gliais na ala desenvolvimento pupal (1), estudos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Migração de células gliais têm tipicamente envolvidos no exame de tecido fixo. Análise microscópica de células móveis ao vivo oferece a capacidade de examinar o comportamento celular em todo o processo migratório, incluindo a determinação da taxa de e mudanças na direção do crescimento. Emparelhado com o uso de ferramentas genéticas, imagens ao vivo pode ser usado para determinar os papéis mais precisos para genes específicos no processo de desenvolvimento. Os trabalhos anteriores por Silies<em&gt; Et al.</em&gt; (2) descreveu a migração de células gliais provenientes do talo óptico, uma estrutura que liga o olho eo cérebro em desenvolvimento, no disco imaginal olho no tecido fixo. Aqui destacamos um protocolo para a análise da migração de células gliais na<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco olho imaginal. Aproveitamos uma linha de Drosophila que expressa GFP em células gliais em desenvolvimento para acompanhar a progressão de células gliais no tipo selvagem e mutante em animais.

Aqui nós descrevemos um protocolo para analisar a migração de células gliais no olho Drosophila desenvolvimento, utilizando análise microscópica ao vivo emparelhado com GFP tag células gliais.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

As células gliais de organismos vertebrados e invertebrados devem migrar para as regiões-alvo finais a fim de envolver e dar suporte aos neurônios associados. Enquanto ...

Dissecamos as larvas segurando as extremidades posterior e anterior e, em seguida, puxando as pinças em direções opostas. O tecido em excesso é removido usando tesouras ultrafinas. Isso revelará os dois hemisférios dos discos imaginais cerebrais larvais.O cordão nervoso ventral e os ganchos bucais. O complexo cérebro-ocular larval é transferido para uma câmara de cultura. Nós separamos o lobo cerebral do estipe óptico para visualizar a migração de células gliais dentro de um disco imaginal de olho do tipo selvagem.Para observar células gliais estacionadas no pedúnculo óptico de um mutante, mantemos o lobo cerebral ligado ao pedúnculo óptico. Oi, sou Patrick Cafferty do Laboratório de Vanessa Als, do Departamento de Zoologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Oi, eu sou Rin.Ela também, hoje mostraremos um procedimento para visualizar células gliais migratórias no olho em desenvolvimento de drosophila. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o desenvolvimento de células gliais. Então, vamos começar.Uma semana antes do início do experimento, moscas são cruzadas para gerar larvas que expressam GFP sob o controle de um promotor específico de glia. Este experimento envolve a visualização de GFP marcado com uma sequência de localização nuclear expressa em células gliais. Usando o promotor de polaridade invertida, prepare lâminas redondas de 18 milímetros com antecedência de pelo menos um dia, imergindo-as por 10 minutos em solução de poli-L-lisina a 1% e, em seguida, secando ao ar durante a noite no dia anterior ao experimento.Limpe uma câmara de cultura magnética em cadeia mergulhando suas partes em etanol 70% durante a noite, no dia do experimento. Utilize técnicas assépticas para preparar o meio de cultura. Adicione soro bovino fetal, solução de penicilina, estreptomicina e insulina a 10 mililitros do meio para insetos de Schneider.Deixe a câmara de cultura magnética limpa secar ao ar em uma capela de cultura celular antes de remover o etanol residual com enxágue usando meio de cultura preparado. Após esses preparativos, podemos iniciar a dissecação do complexo olho-cérebro de drosófila. Para começar este procedimento, selecione uma larva de terceiro estágio vagante da lateral de um frasco de moscas e coloque-a em uma gota de meio de cultura gelado em uma placa de Petri sobre gelo por vários minutos, para resfriamento.Recomenda-se que a larva tenha as contrações peristálticas do corpo diminuídas para facilitar a dissecação. Em seguida, coloque a larva resfriada em uma gota de meio de cultura sobre uma placa revestida com sard, sob um microscópio estereoscópico; usando um par de pinças finas Dumont, segure firmemente a larva. Aproximadamente a um terço do caminho a partir da extremidade posterior, espere até que a larva protruda seus ganchos bucais a partir da extremidade anterior e, quando os ganchos bucais estiverem totalmente estendidos, segure-os com um segundo par de pinças.Para dissecar as larvas, puxe lentamente os dois pares de pinças em direções opostas. O complexo olho-cérebro, juntamente com as glândulas salivares, corpos gordurosos e tecidos imaginais, se destacará do corpo larval. Não puxe os ganchos bucais muito rapidamente, pois eles se romperão do complexo cérebro-larval.Remova as glândulas salivares, os corpos gordurosos e os discos imaginais. Usando tesoura cirúrgica ultrafina, os dois hemisférios do cérebro e os discos oculares permanecerão ligados ao cordão nervoso ventral e aos ganchos bucais. Em seguida, coloque uma lamínula de 18 milímetros sobre uma lâmina de vidro, deixando uma borda da lamínula projetada além da borda da lâmina. Para poder pegar a lamínula posteriormente, adicione uma gota de meio de cultura sobre a lamínula.Segure os ganchos bucais com pin&ccedil;as e transfira o complexo iC&eacute;rebro para o meio de cultura sobre a lam&iacute;nula. Uma vez que o complexo olho-c&eacute;rebro tenha sido transferido para a lam&iacute;nula, utilize uma disseca&ccedil;&atilde;o fina. Tesouras para remover os ganchos bucais do complexo olho-c&eacute;rebro.A remoção dos ganchos bucais é importante para o exame microscópico em tempo real, pois os ganchos bucais continuarão a contrair-se no meio de cultura, causando movimento do tecido durante a microscopia. Para visualizar o GL dentro do pedúnculo óptico, mantenha o pedúnculo óptico do cérebro e o disco imaginal do olho intactos. Para visualizar a migração glial dentro do disco imaginal do olho, corte cuidadosamente o pedúnculo óptico, o tecido fino que conecta o cérebro e o disco do olho, e afaste ou descarte o cérebro.Por fim, pegue a lamínula com uma pinça e desenhe um círculo abaixo ao redor do tecido de interesse com uma caneta permanente. Esse círculo auxiliará na localização do tecido para microscopia posteriormente. Agora, o disco imaginal do olho está pronto para ser montado em uma câmara de cultura magnética.Para montar o disco imaginal do olho em uma câmara magnética de cultura, use pinças para segurar a borda saliente da lamínula e transfira a lamínula para a placa inferior da câmara magnética de linha de elos sem perturbar o tecido em cultura. Em seguida, coloque o anel de silicone em O no corpo principal da câmara de linha de elos. Instale o corpo principal sobre a placa inferior lentamente.Adicione o meio de cultura à câmara. Não adicione o meio de cultura muito rapidamente, pois o tecido será perturbado, permitindo a troca gasosa sob a tampa. Não preencha completamente a câmara; coloque suavemente a tampa invisível sobre a câmara com linha de contorno.Para visualizar células gliais migratórias, coloque a câmara de cultura sobre a platina de um microscópio confocal ou de fluorescência. Localize a amostra utilizando o círculo no lamínula como referência em baixa ampliação. Foque a amostra utilizando uma lente de 40 vezes.Deixe o tecido sedimentar e capture imagens do disco ocular ou do pedúnculo óptico a cada 10 a 15 minutos durante três a quatro horas, se realizado corretamente. Este protocolo resultará em uma série de imagens de células gliais marcadas com GFP migrando do pedúnculo óptico para o disco imaginal do olho. Embora a imagem em tempo real por um período de 60 minutos tenha sido suficiente para observar alterações nas posições dos núcleos gliais com um disco imaginal do olho do tipo selvagem, os núcleos gliais em um mutante para um gene necessário para a migração das células gliais falharam completamente em sair do pedúnculo óptico.Cultivamos complexos olho-cérebro por períodos de até 240 minutos antes de observar a deterioração do tecido cultivado. Após o ponto temporal de 240 minutos, começamos a observar células positivas para GFP no meio de cultura ao redor dos complexos olho-cérebro cultivados. Além disso, o GFP se acumulará em pontos difusos por todo o tecido, sugerindo uma ruptura na integridade tecidual.Acabamos de mostrar como cultivar discos imaginais para estudar a migração de células gliais. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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