Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Dissecamos as larvas segurando as extremidades posterior e anterior e, em seguida, puxando as pinças em direções opostas. O tecido em excesso é removido usando tesouras ultrafinas. Isso revelará os dois hemisférios dos discos imaginais cerebrais larvais.

O cordão nervoso ventral e os ganchos bucais. O complexo cérebro-ocular larval é transferido para uma câmara de cultura. Nós separamos o lobo cerebral do estipe óptico para visualizar a migração de células gliais dentro de um disco imaginal de olho do tipo selvagem.

Para observar células gliais estacionadas no pedúnculo óptico de um mutante, mantemos o lobo cerebral ligado ao pedúnculo óptico. Oi, sou Patrick Cafferty do Laboratório de Vanessa Als, do Departamento de Zoologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Oi, eu sou Rin.

Ela também, hoje mostraremos um procedimento para visualizar células gliais migratórias no olho em desenvolvimento de drosophila. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o desenvolvimento de células gliais. Então, vamos começar.

Uma semana antes do início do experimento, moscas são cruzadas para gerar larvas que expressam GFP sob o controle de um promotor específico de glia. Este experimento envolve a visualização de GFP marcado com uma sequência de localização nuclear expressa em células gliais. Usando o promotor de polaridade invertida, prepare lâminas redondas de 18 milímetros com antecedência de pelo menos um dia, imergindo-as por 10 minutos em solução de poli-L-lisina a 1% e, em seguida, secando ao ar durante a noite no dia anterior ao experimento.

Limpe uma câmara de cultura magnética em cadeia mergulhando suas partes em etanol 70% durante a noite, no dia do experimento. Utilize técnicas assépticas para preparar o meio de cultura. Adicione soro bovino fetal, solução de penicilina, estreptomicina e insulina a 10 mililitros do meio para insetos de Schneider.

Deixe a câmara de cultura magnética limpa secar ao ar em uma capela de cultura celular antes de remover o etanol residual com enxágue usando meio de cultura preparado. Após esses preparativos, podemos iniciar a dissecação do complexo olho-cérebro de drosófila. Para começar este procedimento, selecione uma larva de terceiro estágio vagante da lateral de um frasco de moscas e coloque-a em uma gota de meio de cultura gelado em uma placa de Petri sobre gelo por vários minutos, para resfriamento.

Recomenda-se que a larva tenha as contrações peristálticas do corpo diminuídas para facilitar a dissecação. Em seguida, coloque a larva resfriada em uma gota de meio de cultura sobre uma placa revestida com sard, sob um microscópio estereoscópico; usando um par de pinças finas Dumont, segure firmemente a larva. Aproximadamente a um terço do caminho a partir da extremidade posterior, espere até que a larva protruda seus ganchos bucais a partir da extremidade anterior e, quando os ganchos bucais estiverem totalmente estendidos, segure-os com um segundo par de pinças.

Para dissecar as larvas, puxe lentamente os dois pares de pinças em direções opostas. O complexo olho-cérebro, juntamente com as glândulas salivares, corpos gordurosos e tecidos imaginais, se destacará do corpo larval. Não puxe os ganchos bucais muito rapidamente, pois eles se romperão do complexo cérebro-larval.

Remova as glândulas salivares, os corpos gordurosos e os discos imaginais. Usando tesoura cirúrgica ultrafina, os dois hemisférios do cérebro e os discos oculares permanecerão ligados ao cordão nervoso ventral e aos ganchos bucais. Em seguida, coloque uma lamínula de 18 milímetros sobre uma lâmina de vidro, deixando uma borda da lamínula projetada além da borda da lâmina. Para poder pegar a lamínula posteriormente, adicione uma gota de meio de cultura sobre a lamínula.

Segure os ganchos bucais com pinças e transfira o complexo iCérebro para o meio de cultura sobre a lamínula. Uma vez que o complexo olho-cérebro tenha sido transferido para a lamínula, utilize uma dissecação fina. Tesouras para remover os ganchos bucais do complexo olho-cérebro.

A remoção dos ganchos bucais é importante para o exame microscópico em tempo real, pois os ganchos bucais continuarão a contrair-se no meio de cultura, causando movimento do tecido durante a microscopia. Para visualizar o GL dentro do pedúnculo óptico, mantenha o pedúnculo óptico do cérebro e o disco imaginal do olho intactos. Para visualizar a migração glial dentro do disco imaginal do olho, corte cuidadosamente o pedúnculo óptico, o tecido fino que conecta o cérebro e o disco do olho, e afaste ou descarte o cérebro.

Por fim, pegue a lamínula com uma pinça e desenhe um círculo abaixo ao redor do tecido de interesse com uma caneta permanente. Esse círculo auxiliará na localização do tecido para microscopia posteriormente. Agora, o disco imaginal do olho está pronto para ser montado em uma câmara de cultura magnética.

Para montar o disco imaginal do olho em uma câmara magnética de cultura, use pinças para segurar a borda saliente da lamínula e transfira a lamínula para a placa inferior da câmara magnética de linha de elos sem perturbar o tecido em cultura. Em seguida, coloque o anel de silicone em O no corpo principal da câmara de linha de elos. Instale o corpo principal sobre a placa inferior lentamente.

Adicione o meio de cultura à câmara. Não adicione o meio de cultura muito rapidamente, pois o tecido será perturbado, permitindo a troca gasosa sob a tampa. Não preencha completamente a câmara; coloque suavemente a tampa invisível sobre a câmara com linha de contorno.

Para visualizar células gliais migratórias, coloque a câmara de cultura sobre a platina de um microscópio confocal ou de fluorescência. Localize a amostra utilizando o círculo no lamínula como referência em baixa ampliação. Foque a amostra utilizando uma lente de 40 vezes.

Deixe o tecido sedimentar e capture imagens do disco ocular ou do pedúnculo óptico a cada 10 a 15 minutos durante três a quatro horas, se realizado corretamente. Este protocolo resultará em uma série de imagens de células gliais marcadas com GFP migrando do pedúnculo óptico para o disco imaginal do olho. Embora a imagem em tempo real por um período de 60 minutos tenha sido suficiente para observar alterações nas posições dos núcleos gliais com um disco imaginal do olho do tipo selvagem, os núcleos gliais em um mutante para um gene necessário para a migração das células gliais falharam completamente em sair do pedúnculo óptico.

Cultivamos complexos olho-cérebro por períodos de até 240 minutos antes de observar a deterioração do tecido cultivado. Após o ponto temporal de 240 minutos, começamos a observar células positivas para GFP no meio de cultura ao redor dos complexos olho-cérebro cultivados. Além disso, o GFP se acumulará em pontos difusos por todo o tecido, sugerindo uma ruptura na integridade tecidual.

Acabamos de mostrar como cultivar discos imaginais para estudar a migração de células gliais. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.