Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Dissecamos as larvas agarrando as extremidades posterior e anterior e, em seguida, puxando a pinça em direções opostas. O excesso de tecido é aparado com uma tesoura ultrafina. Isso revelará os dois hemisférios dos discos imaginários do olho do cérebro larval.

O cordão nervoso ventral e os ganchos da boca. O complexo cerebral do olho larval é transferido para uma câmara de cultura. Separamos o lobo cerebral do pedúnculo óptico para visualizar a migração de células gliais dentro de um disco imaginário de olho selvagem.

Para observar células gliais paralisadas no pedúnculo óptico de um mutante, deixamos o lobo cerebral ligado ao pedúnculo óptico. Olá, sou Patrick Cafferty, do Laboratório Vanessa Als do Departamento de Zoologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Olá, sou Rin.

Ela também de Hoje, mostraremos um procedimento para visualizar células gliais migratórias no olho da drosófila em desenvolvimento. Usamos esse procedimento em nosso labato para estudar o desenvolvimento de células glio. Então vamos começar.

Uma semana antes do início do experimento, as moscas são acasaladas para gerar larvas que expressaram GFP sob o controle de um promotor glial específico. Este experimento envolve a visualização de GFP marcada com uma sequência de localização nuclear expressa em células gliais. Usando o promotor de polaridade invertida, prepare lamínulas redondas de 18 milímetros com pelo menos um dia de antecedência, mergulhando-as por 10 minutos em solução de lisina a 1% de poli L e, em seguida, secando-as ao ar durante a noite no dia anterior ao experimento.

Limpe uma câmara de cultura magnética de cadeia embebendo seus componentes durante a noite em etanol a 70% no dia do experimento. Use técnicas assépticas para preparar o meio de cultura. Adicione penicilina de soro bovino fetal, solução de estreptomicina e insulina a 10 mililitros de meio de inseto de Schneider.

Deixe a câmara de cultura magnética de cadeia limpa secar ao ar em uma capa de cultura de células antes de lavar o etanol residual enxaguando com meio de cultura preparado. Uma vez que esses preparativos tenham sido feitos, podemos começar a dissecação do complexo cerebral ocular da drosófila. Para iniciar este procedimento, selecione uma larva errante de terceiro ínstar da lateral de um frasco para moscas e coloque-a em uma gota de meio de cultura resfriado em uma placa de Petri no gelo por vários minutos resfriando.

As larvas são recomendadas para retardar as contrações peristálticas do corpo para facilitar a dissecação. Em seguida, coloque as larvas resfriadas em uma gota de meio de cultura em um prato revestido de sard sob um microscópio de dissecação sob o microscópio de dissecação, use um par de pinças finas dumont para agarrar firmemente as larvas. Aproximadamente um terço do caminho a partir da extremidade posterior, espere até que as larvas expulsem seus ganchos bucais da extremidade anterior e, quando os ganchos bucais estiverem totalmente estendidos, segure-os com um segundo par de pinças.

Para dissecar as larvas, puxe lentamente os dois pares de pinças em direções opostas. O complexo olho-cérebro, juntamente com as glândulas salivares, corpos gordurosos e tecido imaginário, se afastará do corpo larval. Não puxe os ganchos bucais muito rapidamente ou eles se soltarão do complexo iBrain.

Apare as glândulas salivares, corpos gordurosos e discos imaginários Usando uma tesoura ultrafina, os dois hemisférios do cérebro e os discos oculares serão presos ao cordão nervoso ventral e aos ganchos da boca. Em seguida, coloque uma lamínula de 18 milímetros em uma lâmina de vidro, deixando uma borda da lamínula pendurada na borda da lâmina. Para pegar a lamínula mais tarde, adicione uma gota de meio de cultura na lamínula.

Segure os ganchos bucais com uma pinça e transfira o complexo iBrain para o meio de cultura na lamínula. Uma vez que o complexo cérebro-olho tenha sido transferido para a lamínula, use dissecção fina. Tesoura para aparar os ganchos da boca do complexo ocular do cérebro.

A remoção dos ganchos bucais é importante para imagens ao vivo, pois os ganchos bucais continuarão a se contrair no meio de cultura, fazendo com que o tecido se mova durante a microscopia. Para visualizar o GL dentro do pedúnculo óptico, deixe o pedúnculo óptico do cérebro e o disco imaginário do olho intactos. Para visualizar a migração glial dentro do disco imaginário do olho, corte cuidadosamente o estoque óptico, o tecido fino que conecta o cérebro e o disco ocular e afaste ou descarte o cérebro.

Por fim, pegue a lamínula usando uma pinça e desenhe um círculo embaixo do tecido de interesse com um marcador permanente. Este círculo ajudará a localizar o tecido para microscopia posteriormente. Agora o disco imaginal do olho está pronto para ser montado em uma câmara de cultura magnética.

Para montar o disco imaginário do olho em uma câmara de cultura magnética, use uma pinça para segurar a borda suspensa da lamínula e transfira a lamínula para a placa inferior da câmara magnética da linha da corrente sem perturbar o tecido na cultura. Em seguida, coloque o anel de vedação de silicone no corpo principal da câmara da linha da corrente. Instale o corpo principal na parte superior da placa inferior lentamente.

Adicione o meio de cultura à câmara. Não adicione o meio de cultura muito rapidamente ou o tecido será perturbado para permitir a troca gasosa sob a tampa. Não encha a câmara completamente, coloque suavemente a tampa invisível em cima da câmara da linha de corrente.

Para visualizar as células gliais migratórias, coloque a câmara de cultura no palco de um microscópio confocal ou de fluorescência. Localize a amostra usando o círculo na lamínula como referência em baixa ampliação. Foque na amostra usando uma lente de 40 vezes.

Permita que o tecido se assente e capture imagens do disco ocular ou do pedúnculo óptico a cada 10 a 15 minutos durante três a quatro horas, se executado corretamente. Este protocolo resultará em uma série de imagens de células gliais marcadas com GFP migrando do pedúnculo óptico para o disco imaginário do olho. Enquanto a imagem ao vivo por um período de 60 minutos foi suficiente para observar mudanças nas posições dos núcleos gliais com um olho selvagem, os núcleos gliais do disco imaginário em um mutante para um gene necessário para a migração das células gliais falharam completamente em sair do pedúnculo óptico.

Temos complexos cérebro-oculares cultivados por períodos de até 240 minutos antes de observar a deterioração do tecido cultivado. Após o ponto de tempo de 240 minutos, começamos a observar células positivas para GFP no meio de cultura ao redor dos complexos cerebrais oculares cultivados. Além disso, a GFP se acumulará em pontos difusos por todos os tecidos, sugerindo uma quebra na integridade do tecido.

Acabamos de mostrar como fazer cultura. Imagino discos para estudar a migração de células gliais. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.