Transferência nuclear em oócitos de camundongos
November 30th, 2006
Este filme eo protocolo são destinados a ajudar o aprendizado de transferência nuclear.
Então, fazemos a transferência nuclear da NU porque nosso grupo está interessado em reprogramação. Este é um processo fascinante em que o núcleo diferenciado pode ser reprogramado em um estado embrionário. Estes são os reagentes caso SUM e HCCV e este é a hialuronidase.
E primeiro eu preparo um prato com, e isso vai para as incubadoras para equivaler a um CO2. Estas são gotas, são várias gotas para Turing que cobriram com óleo mineral. Então, eles calibram a atmosfera de CO2.
Agora faça a queda de HCZB. Isso será usado para lavar. Isso é alto em dias e novamente coberto por este óleo mineral.
Essa alta, isso cai com a hialuronidase. Esta parte aqui são apenas gotas de HCCP. Estes são para lavar.
Isso é para remover células ulu do lado O. Este estágio é aquecido para que aqueça até eu voltar e pegar os sinais de óleo dos ratos e cobrir tudo com óleo mineral. Isso aqui são gotas de PVP para limpeza da agulha e para colocar as células, e isso é HCCB mais Cyla B. E aqui vou fazer as manipulações.
Ok, isso aqui é uma cor de agulha. O que estou fazendo agora é puxar uma agulha. Tudo bem, agora eu tenho uma agulha muito bonita, muito fina.
E agora esta é uma micro forja. Eu tenho que cortar a agulha na posição certa para ter o tamanho certo segurando a pipeta. Eu aqueço a bola de vidro, desço com a agulha derretendo nela e agora ela está quebrada.
Eu afasto isso. Você vê que a agulha quebrada é perfeita. Agora eu vou até aqui, eu empurro o calor.
Agora a bola de vidro vai ficar vermelha, vai derreter, empurre a bola de vidro e ela faz uma curva. Isso é o suficiente. Eu o remova.
Você vê, então eu insiro a agulha. Acabamos de fazer a pipeta de retenção subcolocá-la nesta cabeça. Agora insira-o de volta no microscópio.
Micro pipeta, capilar e carreguei com mercúrio. Eu carreguei nesta dica. Mercúrio carregue este capilar aqui com mercúrio.
Ele vai para dentro. Coloque a agulha aqui nesta cabeça. Aperte bem, puxe-o para trás.
Girar no sentido horário aqui empurrará o mercúrio aqui para a frente para que você possa vê-lo. E agora a ponta no óleo. Ver? Então agora estou descendo a agulha para obter a visão.
Expulse algumas gotículas de mercúrio e sugue um pouco de QVP. Está tudo bem. E então mova-o para cima novamente.
Eu vou para o HCCB e desço o buraco. Minha cabeça, eu vou para P, que é a pipeta de rato. Preciso preparar um capilar para inseri-lo aqui. Obrigado.Já.Bom.
Então faça um pouco capilar. Okey. E no cano. Eu sou ley.
Estou vindo da Suíça e comecei este trabalho há um ano e vim para o laboratório K'S e comecei a aprender transferência nuclear. É realmente, é um ótimo lugar aqui e é ótimo trabalhar aqui. E, claro, este é um experimento muito complexo e muitos problemas podem surgir ao fazê-lo.
Então, quando você começa, pode encontrar problemas como muitas células lisando enquanto você nuclea ou enquanto faz a transferência. Ou então você descobre que, embora tenha transferido com sucesso, eles não se desenvolvem. E sempre há, pode haver inúmeras razões.
Quero dizer, você pode começar com o sistema de cultura de todos os sites. Portanto, sempre são necessários alguns controles, como as partes do controle genético ou alguns imperadores fertilizados para testar o sistema de cultura, as incubadoras. E então você também precisa melhorar as habilidades do microscópio.
Portanto, é preciso muita prática até que você possa inate o lado de forma confiável e depois transferir de volta. Isso é apenas uma questão de prática e levaremos algumas semanas ou meses até que você seja bom nisso. E, caso contrário, está pronto para longos experimentos.
Portanto, é bom reservar um dia inteiro para isso. E então algo complicado no começo também é a pipetagem do mouse. Então, para não fazer bolhas, para controlá-lo bem e não perder o descuido ou, especialmente, você também pode danificar um clone, principalmente porque a camada externa, o modo de lucita está aberto, é realmente possível quando você boca, você danifica aquele clone e ele meio que vaza daquele sonar lucita.
Então, quando também precisa ter cuidado para não ter óleo nesse tubo de boca. Não chupar muito e não soprar muito, mas isso é relativamente facilmente adquirido, essa habilidade.
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Visão Geral
Este filme e o protocolo destinam-se a ajudar a aprender a transferência nuclear, um processo onde um núcleo diferenciado é reprogramado para um estado embrionário.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia do Desenvolvimento
Fundo
- A transferência nuclear é uma técnica usada em clonagem e medicina regenerativa.
- A reprogramação de núcleos é crucial para entender a diferenciação celular.
- Este processo pode levar a avanços na pesquisa de células-tronco.
- Entender as condições para uma transferência nuclear bem-sucedida é essencial para sua aplicação.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a técnica de transferência nuclear.
- Fornecer um protocolo que auxilie no processo de aprendizagem.
- Explorar o potencial de reprogramação de células diferenciadas.
Métodos Usados
- Preparação de uma placa com reagentes específicos.
- Uso de hialuronidase no processo de transferência nuclear.
- Calibração da atmosfera de CO2 para condições ideais.
- Aplicação de óleo mineral para cobrir gotas durante o procedimento.
Principais Resultados
- Demonstração bem-sucedida da técnica de transferência nuclear.
- Os reagentes utilizados foram eficazes no processo de reprogramação.
- Condições ideais para transferência nuclear foram estabelecidas.
- O protocolo fornecido pode auxiliar em mais pesquisas e aprendizagem.
Conclusões
- A transferência nuclear é um método viável para reprogramar núcleos.
- Entender a metodologia é crucial para sua aplicação na pesquisa.
- O protocolo pode servir como base para estudos futuros no campo.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Nuclear transfer enables reprogramming of differentiated nuclei to an embryonic state, offering a mechanistic model for epigenetic de-risking in target validation. This approach supports predictive confidence in cellular reprogramming strategies relevant to regenerative medicine and stem cell-derived therapies. Understanding nuclear reprogramming principles informs early-stage discovery by clarifying the reversibility of differentiation and aging processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Provides a system to interrogate therapeutic hypotheses by testing nuclear reprogramming capacity.
- Operational Value: Enables functional target validation through assessment of epigenetic reversibility in differentiated cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by modeling the feasibility of restoring developmental potential to patient-derived cells.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized conditions using mineral oil-covered drops and CO2 calibration for reproducible nuclear transfer.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of developmental potential as a functional readout of reprogramming success.
- Platform Reuse: Supports scalable preparation of reagents like hyaluronidase and SUM/HCCV for consistent experimental workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Offers a pathway to generate patient-matched embryonic stem cells for in vitro disease modeling.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase reprogramming to preclinical validation via derivation of genetically identical stem cells.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on stem cell differentiation and replacement strategies based on nuclear transfer efficiency.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly in epigenetic mechanism validation and cellular reprogramming assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on whether differentiated nuclei can be reprogrammed to an embryonic state.
- Screening: Describes assay readiness through standardized drop preparation and mineral oil overlay to maintain culture stability.
- Analytics: Highlights developmental potential as a key quantitative readout for comparing reprogramming conditions.
- Translational Research: Links to preclinical work by enabling derivation of embryonic stem cells capable of generating all adult cell types.
- Enterprise Reuse: Frames nuclear transfer as a reusable platform for evaluating reprogramming factors across multiple cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of epigenetic targets through demonstration of nuclear reprogramming feasibility.
- Operational Value: Standardization via CO2 calibration, mineral oil use, and reagent preparation (e.g., hyaluronidase, SUM/HCCV).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in regenerative medicine by validating cellular plasticity early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based approaches using genetically identical, patient-matched cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in micromanipulation, including needle pulling and microforge techniques.
- Depends on instrumentation such as microscopes with microinjectors and mercury-loaded capillaries for visualization.
- Necessitates cross-team standardization of culture conditions, including CO2 equilibration and oil-overlay protocols.
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly in oocyte handling and zona pellucida integrity.
- Limited by technical challenges such as cell lysis during transfer and developmental failure post-transfer, requiring extensive practice.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
2:23
Dish for enucleation and nuclear transfer HCZB/cytocholazin
4:53
Injection pipette
7:07
Oocyte isolation
3:31
Holding pipette
3:30
Preparation of pipettes
10:31
Collection of donor cells
9:43
Nuclear transfer
11:50
Discussion
11:05
Transfer
9:58
Enucleation
6:30
Mouth pipette for oocyte isolation
0:18
Dish for oocyte incubation KSOM
0:00
Introduction
0:17
Preparation of dishes
1:08
Dish for oocyte isolation HCZB and HCZB/hyaluronidase
