Name: A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Aprenda a avaliar neurotoxicidade em co-culturas de neurônios e astrócitos usando análise de alto conteúdo. Este protocolo sensível permite quantificar efeitos tóxicos em modelos in vitro.

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Os autores gostariam de agradecer as Dras. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matthew Hsu, Jehangir Mistry e Michele Hatler de apoio durante o desenvolvimento desses projetos e protocolos.

Preparação de células: <ol><li> Antes da semeadura de células para o ensaio, a cultura de neurônios / astrócitos em meios de crescimento até confluentes ~ 70-80% (a menos de células semeadura diretamente do degelo ou isolamento). </li><li> Separar as células dos frascos de cultura / placas através do método apropriado para o tipo de células de interesse. Se necessário, os poços casaco ensaio de placa com poli-D-lisina ou proteína de matriz extracelular para melhorar a adesão celular. Co-culturas de astrócitos e neurônios pode ser semeado simultaneamente ou seqüencialmente. Para seedings seqüencial, chapeamento de astrócitos primeiro como uma camada de &quot;basal&quot; é recomendado, seguido por plaqueamento neuronal e diferenciação, se necessário. Ajustar a densidade de células, conforme apropriado para o tipo de célula, o tempo da cultura subseqüente, os parâmetros de interesse, etc Dependendo da idade da cultura, fonte de células e densidade de semeadura, culturas primárias podem variar muito em taxa de proliferação, GFAP expressão ou crescimento de neuritos - é importante caracterizar e otimizar seu sistema de célula para fornecer a relevância biológica mais para o seu modelo experimental, bem como para fornecer para geração de imagens eficaz, segmentação e análise usando HCS (ver Figura 1). Depois de adicionar células a placa (células podem ser semeadas em 90 mL de mídia, para facilitar o tratamento com toxina, como descrito no Passo 3 abaixo), permitir que a placa se sentar sobre uma superfície plana em temperatura ambiente por 15-30 min, permitindo distribuição uniforme de células. Após este período, as células se desenvolvem em meios de crescimento (37 ° C / 5% CO 2) por pelo menos 24 horas, em seguida, mudar as condições de cultura de diferenciação (por exemplo, soro baixo / NGF de PC12 células), conforme o caso. Continue cultura até atingir o nível desejado células de confluência ou diferenciação, mudando media em intervalos apropriados para o tipo de célula. </li><li> Tratamentos com células (compostos de controle, compostos de teste, etc) pode ser introduzido em qualquer momento durante este período da cultura, conforme apropriado para o tempo-curso de tratamento de interesse. Acrilamida, peróxido de hidrogênio e K-252 são fornecidas como compostos neurotóxicos controle. Reagentes suficientes são fornecidos para duplicar de 12 pontos curvas dose-resposta (incluindo uma dH 2 O DMSO ou de controle situado no dose-resposta) para todas as cinco placas de 96 poços. Os compostos são fornecidos em concentração 250X (para K-252a, assumindo um tratamento máximo de 1 mM) ou 10X (para acrilamida e peróxido de hidrogênio, supondo que tratamentos máximo de 100 mm e 10 mm, respectivamente). Preparação tratamento recomendado envolve meia-log (1: √ 10) diluição em série do composto 250X em DMSO, seguido de diluição em tampão de diluição Composto de 10X (compostos controle 10X originários de dH 2 O pode ser serialmente diluída diretamente em dH 2 O estéril ou tampão de diluição Compound). 10 L de cada tratamento podem então ser adicionados ao mL 90 de meios de cultura já está presente em cada poço, para uma concentração final de 1X (0,4% DMSO ou 10% dH 2 O). De dados de exemplo é fornecido por 24 ou 96 horas de tratamento composto de 37 ° C antes da fixação. </li></ol> Fixação de células e coloração de imunofluorescência: Nota: O tempo de coloração é de aproximadamente 2,5 horas pós-fixação. Não permitir que os poços a secar entre as etapas de coloração. Aspiração e dispensação de reagentes devem ser realizadas a taxas de fluxo baixo para diminuir a perda de células devido ao cisalhamento de fluidos. Todos os recomendados &quot;por bem&quot; volumes referem-se a um único poço de uma microplaca de 96 poços. Todos os recomendados &#39;por 96 poços da placa&#39; volumes incluem excesso de 25% as perdas de líquido manipulação de volume. Todas as etapas são realizadas coloração à temperatura ambiente (RT). Todos os tampões e soluções de anticorpos são estáveis ​​por pelo menos 24 horas à temperatura ambiente. <ol start="4"><li> No final do período de cultivo, pré-aquecido solução de fixação HCS (2X) a temperatura ambiente (RT) ou 37 º C, se desejar (12 placa mL/96-well). Em uma Cobertura de vapores químicos, adicionar 100 mL / poço diretamente para meios de cultura e permitir que a correção para 30 min em temperatura ambiente. Remover fixador / toxina contendo mídia e eliminar de acordo com os regulamentos para resíduos perigosos (ver MSDS). Se proceder imediatamente à coloração, lavar cada poço duas vezes com 200 mL de tampão de imunofluorescência HCS. Alternativamente, se as placas devem ser manchado em um momento posterior, lavar duas vezes com 200 mL de tampão de lavagem, enxágüe em seguida, deixar o volume segundo em poços e as placas loja hermeticamente fechado a 4 º C até coloração. </li><li> Se as amostras fixas foram armazenadas a 4 º C antes da coloração, lavar duas vezes com 200 mL de buffer HCS Imunofluorescência antes de prosseguir com protocolo de coloração. </li><li> Prepare solução de trabalho de Coelho Anti-βIII tubulina / Mouse Anticorpos Anti-GFAP HCS primária (6 placa mL/96-well) como segue: Adicionar 60 mL de cada anticorpo primário para 5,88 descongelado mL de tampão de imunofluorescência HCS. Misture bem. Remover o tampão de imunofluorescência anterior enxaguar. Adicionar 50 mL de solução de anticorpo primário a cada poço e incubar por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Remover o anticorpo primáriosolução. Enxaguar três vezes com 200 mL de buffer de imunofluorescência HCS. </li><li> Preparar a solução de trabalho de HCS Anticorpo secundário / HCS Hoechst Nuclear Stain (6 placa mL/96-well) como segue: Adicionar 30 mL de cada anticorpo secundário descongelados e 30 mL de descongelado Hoechst HCS Nuclear Stain para 5,91 mL de tampão de imunofluorescência HCS. Misture bem, protegendo solução da luz. Remover anterior HCS buffer de imunofluorescência enxaguar. Adicionar 50 mL de HCS Anticorpo secundário / HCS Hoechst solução Nuclear Stain e incubar por 1 hora a RT, protegido da luz. </li><li> Remover HCS Secundária Antibody / Hoechst HCS solução Nuclear Stain. Enxágüe duas vezes com 200 mL de buffer de imunofluorescência HCS. </li><li> Remover anterior HCS buffer de imunofluorescência enxaguar. Enxágüe duas vezes com 200 mL de tampão de lavagem HCS, deixando o volume enxágüe segundo poços. </li><li> Placa de vedação e de imagem de imediato, armazenar ou placa a 4 º C protegido da luz até que esteja pronto para geração de imagens. </li></ol> Aquisição e Análise de Imagem: <ol start="12"><li> De imagem e análise de lâminas coradas pode ser realizada de uma variedade de plataformas disponíveis HCS, incluindo a IN Analyzer Cell (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Científica) ou o Opera (Perkin Elmer). Algumas diretrizes para a imagem e análise são apresentadas na Tabela 1: </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 Aquisição Diretrizes Imagem </td></tr><tr><td> Reagente de detecção </td><td> Lente objetiva </td><td> Faixa de excitação Filtro [pico / largura de banda (nm)] </td><td> Emissão Faixa de filtro [pico / largura de banda (nm)] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS Nuclear Stain </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (ou 535/50, se necessário) </td></tr><tr><td> HCS Anticorpo secundário, FITC-Donkey anti-IgG de coelho </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS Anticorpo secundário, Cy3-Donkey anti-rato IgG </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 Análise Diretrizes Imagem </td></tr><tr><td> Parâmetro celular </td><td> Detecção </td><td> Segmentação / Medição </td><td> Fundamentação </td></tr><tr><td> Número de células, características nucleares </td><td> Hoechst HCS Nuclear Stain </td><td> Região nuclear (460 canais de emissão nm). Contar o número de núcleos. Conteúdo de DNA (intensidade nuclear) ou análises área nuclear também são possíveis. </td><td> Use o número de células, características nucleares para determinar a perda de células, fenótipos toxicidade, etc Can &quot;filtro&quot; para aqueles núcleos associados βIII-tubulina ou expressão GFAP para obter em separado contagem de células neuronais e astrocitária / caracterizações (fortemente recomendado). </td></tr><tr><td> βIII-tubulina Expressão, crescimento de neuritos </td><td> HCS Anticorpo secundário, FITC-conjugado </td><td> Região citoplasmática (535 nm de emissão do canal). FITC sinal pode ser usado para distinguir os corpos celulares neuronais de neurites (por exemplo, através de áreas de célula mínima / média do corpo, comprimentos neurite mínimo / máximo e largura). Determinar parâmetros como o comprimento neurite total, contagem de neurite / celular, etc </td><td> Medições de crescimento de neuritos pode ser modulada durante a diferenciação neuronal ou como resultado de uma lesão química, estados de doença, etc, podem &quot;filtrar&quot; os corpos celulares para aqueles associados com βIII-tubulina expressão para obter a caracterização neuronal distintos (fortemente recomendado). </td></tr><tr><td> GFAP Expressão, Área astrocitária </td><td> HCS Anticorpo secundário, Cy3-conjugados </td><td> Região citoplasmática (600 canais de emissão nm). Cy3 sinal pode ser usado para definir a segmentação do citoplasma de astrócitos. Determinar parâmetros como a intensidade de sinal média citoplasmática, área da célula, etc </td><td> GFAP expressão e área de células astrócitos pode ser modulada durante o desenvolvimento de astrócitos ou como resultado de uma lesão química, estados de doença, etc, podem &quot;filtrar&quot; os corpos celulares para aqueles associados com a expressão GFAP astrocitária para obter a caracterização distintos (fortemente recomendado). </td></tr></tbody></table> . Tabela 1 Imagem Diretrizes de Aquisição e Análise - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP Assay (Co-Cultura) Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="Figura 3" /> Figura 1. βIII-tubulina e GFAP immunofluorescence de rato misturado culturas de células neurais. Co-culturas de astrócitos do hipocampo de ratos primária com neurônios de rato, quer primária ou hipocampo de ratos células PC12 foram gerados por placas pré-astrócitos durante vários dias em cultura, seguido de semeadura neuronal. Neurônios primários foram cultivadas por mais 11 dias, enquanto PC12s foram cultivadas por mais dois dias sob condições de diferenciação (soro baixo / NGF). Manipulação de células fixação e imunomarcação foram realizadas de acordo com protocolos HCS222 ensaio. As células foram fotografadas no GE IN celular Analyzer 1000 (3.3) a 20X (neurônios primários) ou de ampliação objetiva de 10X (PC12) e analisados ​​com o GE IN celular Workstation 1000 Analyzer (3.4) crescimento de neuritos e algoritmos de análise multi-alvo Painel superior.: imagens fundidas de Hoechst HCS Nuclear Stain (azul), βIII-tubulina (verde) e GFAP fluorescência (vermelho). Análise em separado do canal de fluorescência βIII-tubulina permite a segmentação crescimento de neuritos (painel do meio: corpos celulares descritos no azul (neurônios primários) ou amarelo (PC12), neurites em verde (neurônios primários) ou azul claro (PC12)). Análise do canal de GFAP permite a segmentação de astrócitos (painel inferior: núcleos delineados em azul, o citoplasma em verde). GFAP segmentação para o primário do hipocampo de ratos neurônio / astrócitos co-cultura demonstra a capacidade de distinguir entre os núcleos / célula corpos que são GFAP (+) (verde contornos) e aqueles que são GFAP (-) (vermelho), permitindo a contagem de células separadas para neurônios e astrócitos em uma configuração de cultura mista. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="Figura 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="Figura 4 part2" /> Figura 2. Respostas dose de rato principal do hipocampo neurônio / astrócitos co-culturas a estresses tóxicos. Astrócitos do hipocampo de ratos primária (P6) foram semeadas em placas de 96 poços em meio de crescimento e cultivadas por 6 dias. Neurônios de rato principal do hipocampo (direto de descongelar) foram semeadas em cima do pré-plated astrócitos e cultivadas em meio de crescimento por 11 dias. As células foram tratadas com diluições seriadas de acrilamida ou peróxido de hidrogénio (máx. = concentração 100mM e 10mM, respectivamente) para as últimas 24 horas de cultura. Manipulação de células fixação e imunomarcação foram realizadas de acordo com protocolos HCS222 ensaio. As células foram fotografadas no GE IN celular Analyzer 1000 (3.3) a 20X (10 campos / poço) e analisadas (nuclear / cytoplasmic / neurite segmentação) usando o GE IN celular Workstation 1000 Analyzer (3.4) crescimento de neuritos e algoritmos de análise multi-alvo. Os dados apresentados são média ± EPM, n = 3. Vários parâmetros (crescimento de neuritos, intensidade GFAP, área de astrócitos e contagem de células neuronais ou astrocitária) foram investigados por dose-dependente tendências.

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</ol>

Os autores são todos os funcionários da Millipore Corporation.

Até o momento, experimentos in vitro concebido para estudo de avaliação do risco de neurotoxicidade utilizando culturas mistas de neurônios e astrócitos têm sido limitados. É bem aceito que as células gliais são essenciais na prestação de apoio espacial e metabólico para os neurônios, e desempenham um papel crítico na modulação neuronal várias funções, incluindo a migração neuronal, diferenciação e atividade sináptica. Astrócitos gliais também liberam citocinas e outros fatores solúveis que são capazes de induzir ambos os tolerância respostas adversas no tecido circundante neuronal, bem como promover neuronal de muitas toxinas. Demonstrando a profundidade da neuronal-glial interações, em co-cultura estudos, os astrócitos foram mostrados para proteger os neurônios contra a toxicidade do estresse oxidativo, enquanto comprometimento das funções astrocíticos, tais como manutenção de defesa antioxidante e os níveis de energia celular, tem se mostrado influenciam criticamente a sobrevivência neuronal. Estudos recentes têm sugerido que o uso de astrócitos em um sistema de teste in vitro-neurotoxicidade pode ser mais relevantes para a estrutura do sistema nervoso central humano e função de células neuronais sozinho. Apesar da crescente conscientização da importância fisiológica do neuronal-astrocíticos interações, tem sido difícil de executar análises quantitativas dessas interações em células intactas. O advento de Triagem de conteúdo de alta possibilita o desenvolvimento de novos testes poderosa para lidar com isso. Neste estudo, nós demonstramos que as análises quantitativas de vários fenótipos neuronais e astrocitária dentro de um único ensaio são possíveis por HCA. Em neurônios primários temos realizado medições quantitativas dos marcadores neurotoxicidade, como o número de neurônios, a contagem de neurite e comprimento neurite. Em astrócitos, gliose reativa é um biomarcador conhecido da neurotoxicidade, caracterizada por alterações na expressão de GFAP, o número de astrócitos e morfologia de astrócitos. Nós demonstramos que cada um destes parâmetros podem ser facilmente avaliada através de HCA. Estes estudos suportam o conceito de que HCA de neural específico biomarcadores poderiam ser usados ​​como parte de uma bateria de ensaios in vitro para tela rapidamente um grande número de produtos químicos para endpoints neurotóxicos. HCS222 Millipore do kit de análise de conteúdo de alta para o co-cultura de neurônios e astrócitos é composto de reagentes de alta qualidade e protocolos para a detecção simultânea de perfis βIII-tubulina e proteína fibrilar glial ácida (GFAP) em uma ampla variedade de modelos celulares de neurotoxicidade. Os reagentes altamente validado, desde que com este kit permite que o usuário para padronizar os ensaios, minimize-ensaio para ensaio-variabilidade, e reproduzível gerar imagens com uma relação sinal-background-alta.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo Primário HCS Anti-Coelho-&amp;#946;III-Tubulina, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201672</td><td>1 frasco contendo 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Componente do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário HCS (IgG de jumento anti-coelho, conjugado com FITC), 200X</td><td></td><td>Part No. CS201649</td><td>1 frasco contendo 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Componente do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>Anticorpo Primário HCS Anti-Murino-GFAP, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201671</td><td>1 frasco contendo 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Componente do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário HCS (IgG de jumento anti-murino, conjugado com Cy3), 200X</td><td></td><td>Part No. CS200437</td><td>1 frasco contendo 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Componente do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>Corante Nuclear H&amp;#8211;chst HCS, 200X</td><td></td><td>Part No. CS200438</td><td>1 frasco contendo 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Componente do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>Solução de Fixação HCS com Fenol Vermelho, 2X</td><td></td><td>Part No. CS200434</td><td>1 frasco contendo 100 mL&lt;br/&gt;Componente do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>Tampão de Imunofluorescência HCS, 1X</td><td></td><td>Part No. CS200435</td><td>1 frasco contendo 1000 mL&lt;br/&gt;Componente do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>Tampão de Lavagem HCS, 1X</td><td></td><td>Part No. 2007643</td><td>1 frasco contendo 500 mL&lt;br/&gt;Componentes do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>Acrilamida (Composto Controle), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201679</td><td>1 frasco contendo 500 &amp;#x03BC;L de acrilamida 1M em dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Componente do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrogênio (Composto Controle), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201730</td><td>1 frasco contendo 500 &amp;#x03BC;L de peróxido de hidrogênio 100 mM em dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Componentes do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>K-252a (Composto Controle), 250X</td><td></td><td>Part No. CS201741</td><td>1 frasco contendo 100 &amp;#x03BC;L de K-252a 250 &amp;#x03BC;M em DMSO&lt;br/&gt;Componente do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>DMSO para Diluição Serial de Compostos</td><td></td><td>Part No. CS200441</td><td>1 frasco contendo 10 mL&lt;br/&gt;Componente do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>Tampão de Diluição de Compostos</td><td></td><td>Part No. CS200442</td><td>1 frasco contendo 25 mL&lt;br/&gt;Componente do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>Selantes para Placas</td><td></td><td>Part No. CS200443</td><td>10 unidades&lt;br/&gt;Componentes do Kit Millipore HCS222</td></tr><tr><td>Microplacas com fundo preto/transparente tratadas para cultura de tecidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem/analise HCS</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a neuronal e astrocitária ensaio co-cultura de análise de conteúdo de alta de neurotoxicidade

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Alta Content Analysis (HCA) ensaios de combinar células e reagentes de detecção com imagem automatizada e poderosos algoritmos de análise de imagem, permitindo a medição de múltiplos fenótipos celulares dentro de um único ensaio. Neste estudo, utilizamos HCA para desenvolver um teste de novela para neurotoxicidade. Neurotoxicidade avaliação representa uma parte importante da avaliação de segurança de medicamentos, bem como sendo um foco significativo dos esforços de protecção ambiental. Além disso, neurotoxicidade é também um bem aceita<em&gt; In vitro</em&gt; Marcador do desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e Parkinson. Recentemente, a aplicação de HCA para triagem neuronal tem sido relatada. Por rotulagem com células neuronais βIII-tubulina, ensaios de HCA pode proporcionar alto rendimento, não-subjetivo, medidas quantitativas de parâmetros como o número de neurônios, a contagem de neurite e comprimento dos neuritos, que podem indicar efeitos neurotóxicos. No entanto, o papel dos astrócitos permanece inexplorada nesses modelos. Astrócitos têm um papel fundamental na manutenção do sistema nervoso central (SNC) homeostase, e estão associados com as duas neuroproteção e neurodegradation quando elas são ativadas em resposta a substâncias tóxicas ou de estados de doença. GFAP é uma proteína de filamento intermediário expressa predominantemente nos astrócitos do SNC. Ativação astrocitária (gliose) leva à regulação alta de GFAP, comumente acompanhada de proliferação de astrócitos e hipertrofia. Este processo de gliose reativa tem sido proposta como um marcador precoce de danos ao sistema nervoso. O método tradicional para quantificação GFAP é por imunoensaio. Esta abordagem é limitada pela incapacidade de fornecer informações sobre a localização celular, morfologia e número de celular. Nós determinamos que o HCA pode ser usado para superar essas limitações e, simultaneamente, medir características múltiplos associados com gliose - mudanças na expressão GFAP, a hipertrofia de astrócitos, e proliferação de astrócitos - dentro de um único ensaio. Em co-cultura estudos, os astrócitos foram mostrados para proteger os neurônios contra vários tipos de insultos tóxicos e influenciam criticamente a sobrevivência neuronal. Estudos recentes têm sugerido que o uso de astrócitos em um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de teste de neurotoxicidade pode ser mais relevantes para a estrutura e função do SNC humano do que as células neuronais sozinho. Assim, desenvolvemos um ensaio HCA para co-cultura de neurônios e astrócitos, composto por protocolos e validados, dirigidas a públicos específicos reagentes de detecção para perfil βIII-tubulina e glial fibrilar proteína ácida (GFAP). Este ensaio permite a análise simultânea de neurotoxicidade, crescimento de neuritos, gliose, morfologia neuronal e astrocitária e desenvolvimento neuronal e astrocitária em uma grande variedade de modelos de celulares, o que representa um romance, não-subjetiva, teste de alto rendimento para a avaliação de neurotoxicidade. O ensaio tem um grande potencial para a detecção aprimorada de neurotoxicidade e maior produtividade em pesquisa em neurociência e descoberta de drogas.

Este artigo descreve um protocolo de romance e de reagente conjunto projetado para a medição sensível de efeitos neurotóxicos de compostos e tratamentos em co-culturas de neurônios e astrócitos usando análise de conteúdo de alta. Resultados demonstram que a análise de conteúdo de alta tecnologia representa um romance empolgante para a avaliação de neurotoxicidade.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

Ensaios de Análise de Alto Conteúdo (HCA) combinam células e reagentes de detecção com imageamento automatizado e algoritmos poderosos de análise de imagem, permitindo ...

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Japonês
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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós desenvolvemos um romance de vários compartimentos neurônio plataforma microssistema co-cultura para a investigação in vitro a interação do SNC axônio glia. A plataforma é capaz de realizar até seis experimentos independentes em paralelo e foi fabricado usando um recém-desenvolvido macro / micro método de fabricação híbrida.

Um compartimento Multi-glia do SNC Neuron-Co-cultura plataforma microfluídica

Este estudo descreve os procedimentos de criação de um axônio neuronal e romance (astro) glia plataforma de co-cultura. Neste sistema de co-cultura, a manipulação da interacção directa entre um único axónio (e única célula glial) torna-se possível, permitindo a análise mecanicista do neurónio mútuo de sinalização gliais.

Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

Este vídeo ilustra um método para estabelecer uma co-cultura indireta de neurônio-astrócitos usando uma abordagem compartimentada. Nessa configuração, neurônios e astrócitos são espacialmente separados, mas compartilham um meio condicionado. Fatores neurotróficos liberados pelos astrócitos promovem a diferenciação de neurônios e a formação de conexões sinápticas, sugerindo interações neurônio-glia.

Uma técnica indireta de co-cultura neurônio-astrócitos para estudar as interações neurônio-glia

Este vídeo demonstra o estabelecimento de uma co-cultura neurônio-astrócitos para registrar a atividade da rede neuronal. Ao estabelecer a co-cultura de neurônios motores e astrócitos em uma placa multi-electrode array (MEA), a atividade elétrica rítmica síncrona da rede neuronal foi registrada extracelularmente usando o MEA.

Registro da Atividade Eletrofisiológica da Rede Neuronal em uma Co-cultura Neurônio-Astrócito

Este vídeo demonstra a avaliação da atividade elétrica neuronal em uma co-cultura de neurônios glutamatérgicos corticais derivados de hiPSC e células de glioma usando um dispositivo microfluídico com matrizes de multieletrodos.

Avaliação das interações entre neurônios glutamatérgicos e células de glioma em co-cultura

Este protocolo descreve a co-cultura neurônio-astrócito indireta para análise compartimentada das interações neurônio-glia.

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) são consideradas uma ferramenta poderosa para a triagem de drogas e substâncias químicas e para o desenvolvimento de novos modelos in vitro para testes de toxicidade, incluindo neurotoxicidade. Aqui, um protocolo detalhado para a diferenciação de hiPSCs em neurônios e glia é descrito.

Protocolo para a Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Culturas Mistas de Neurônios e Glia para Teste de Neurotoxicidade

Excitabilidade neuronal pode ser modulada através de um processo dinâmico de endo e exocitose de geleificação excitatório glutamato receptores. Aqui descrito é um ensaio acessível, alto teor para quantificação de receptores de superfície e interno população piscinas.

Um ensaio de alto teor para monitoramento Leandro tráfico de Receptor

O protocolo apresentado descreve um método para um ensaio de crescimento de neurite e avaliação neurotoxicidade de compostos de moléculas pequenas.

Um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas

Aqui, apresentamos uma abordagem simples usando meios de cultura específicos que permitem o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios e astrócitos, ou culturas neuron-glia do córtex embrionário, com alto rendimento e reprodutibilidade.

Um modelo de cultura celular para estudar o papel das interações neurônio-glia na isquemia

Aprenda a avaliar neurotoxicidade em co-culturas de neurônios e astrócitos usando análise de alto conteúdo. Este protocolo sensível permite quantificar efeitos tóxicos em modelos in vitro.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

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