Name: Dendra2 Photoswitching através da janela de imagem mamária (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprenda a realizar photoswitching de Dendra2 em células tumorais através da janela de imagem mamária em camundongos. Este método permite rastrear o comportamento metastático das células em seu microambiente tumoral in vivo.

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Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa dos EUA (BC075554 a BG e BC061403 para DK), National Institutes of Health EUA (U54GM064346 para JVR; CA100324 ao JC, JES e JW; CA77522 para JES, U54CA126511 ao JC e BG). Agradecemos a D. Entenberg para ajudar com microscopia, M. Rottenkolber para ajudar na fabricação de caixa de imagem e J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) para o anticorpo F4/80.

1. Geração de tumores fluorescentes usando a injeção de células tumorais mamárias no teclado de gordura: <ol><li> Crescer uma linhagem de células expressando Dendra2 proteínas (como um marcador citoplasmático) para 40-80% confluência. </li><li> Enxaguar pratos, pelo menos, 3 vezes com PBS w / o Ca 2 + ou Mg 2 +. </li><li> Adicionar 3 ml de tripsina por 10 centímetros prato e incubar a 37 ° C até que a maioria das células separar e em seguida, bateu o prato contra uma superfície plana para agitá-lo. </li><li> Lave bem todas as células fora do prato, e use um raspador (policial de borracha) para coletar matriz também. Adicione a 5 ml de PBS. Tomar uma alíquota para contar durante a centrifugação. </li><li> Centrifugar a 800 g por 5 min. </li><li> Aspirar e ressuspender em PBS a uma concentração de 5 - 10 ml 6 / 10x. Loja em gelo até injetada (injetar dentro de 30 min). </li><li> Coloque uma gaiola contendo 4-5 semanas de idade do sexo feminino imunológico camundongos deficientes (por exemplo, SCID) dentro de uma capa estéril. </li><li> Pulverizar a área ao redor do mamilo (abdominal) 4 com etanol 70%. </li><li> Injetar 0,1 ml em almofada de gordura mamária. Se um assistente pode ser encontrado, uma pessoa pode manter o mouse no lugar enquanto o outro insere a agulha dentro do pad mamárias gordura. Se você está injetando por si mesmo, coloque o mouse sob anestesia luz usando isoflurano. </li><li> Uma vez que o tumor cresceu para 5-7 mm, a janela de imagem mamária (MIW) deve ser inserido. Nota: Como alternativa, para algumas aplicações, o MIW pode ser inserido na parte superior do pad mamárias saudáveis ​​de gordura e as células podem ser injetadas em seguida. Essa abordagem permite imagens de células transfectadas transitoriamente em um ambiente fisiológico. </li></ol> 2. Fabricação manual da janela de imagem mamária (MIW): <ol><li> MIWs (Figura 1A) são feitos de plástico de grau de tecidos para garantir biocompatibilidade. Para a construção manual, usamos 5 ou 10 pratos cm. </li><li> Coloque luvas de látex por diante. </li><li> Aquecer um prato de cultura de tecidos e creat uma superfície curva, empurrando um objeto arredondado duro contra o prato aquecido (usamos um de 1 polegada bit dremmel para isso). </li><li> Recorte o centro do prato usando uma lâmina aquecida. </li><li> Use uma pequena, em forma de cone bit dremmel para fazer um buraco no centro da cúpula em forma de base de plástico (6-7mm de diâmetro). </li><li> Faça as bordas da base de plástico completamente lisa lixando com a dremmel e ainda arquivá-lo. </li><li> Arquivo na parte superior da base de plástico fazendo uma superfície plana para a lamela de vidro. O diâmetro do arquivado superfície plana e deve ser 9-10mm. </li><li> Cole a 8 milímetros de vidro circular lamela (número 1) na superfície achatada usando o superglue (cianoacrilato). </li><li> Aguarde a cola secar (15 minutos). </li><li> Use uma agulha aquecida 26G para fazer oito furos sutura punção do lado de fora (onde o vidro é) para o interior da base. Buracos devem ser distribuídas uniformemente ao redor da lamela, 0,5-1mm de distância da borda da lamínula. </li><li> Alargar os furos com uma agulha de sutura 5-0. </li><li> Perfurando buracos na base de plástico fará a superfície interna irregular. O uso de papel de areia, fazer esta superfície completamente lisa. </li><li> Alterar as luvas e escova de pequenas partículas de plástico do MIW usando uma escova pequena. </li><li> Lave o MIW com água deionizada. </li><li> Lave o MIW utilizando etanol 70%. Usar um Q-dica para limpar o vidro de modo que é completamente transparente. Se houver manchas nebuloso presente desde o vapor de cola, cuidadosamente usar acetona com um Q-Tip. </li><li> Esterilizar o MIW pela exposição aos raios UV por 3 h em cada lado. </li></ol> Semi-Manual de fabricação da janela de imagem mamária (MIW): , A fim de fabricar a base de plástico, estamos usando atualmente moldes de silicone de borracha de fundição criado usando hand-made MIWs. O molde é composto de duas partes de borracha de silicone que fazem uma réplica exata de frente e verso do original quando preenchidos com resina de poliéster e logo em seguida se uniram. A resina de poliéster líquido é misturado 09:10 e resulta em uma estrutura dura quando completamente curado em 48h. O plástico é UV protegidas e de arquivo, sem quebrar ou tornar-se amarela ao longo do tempo. Após a base está curada, 2,8-2,16 passos são feitos da mesma forma que para MIWs manualmente-made. 3. Inserção do MIW: <ol><li> A área ao redor do mamilo 4 ª deve ter um pequeno (5-7 mm de diâmetro) tumor vários dias / semanas após a injeção das células tumorais, dependendo do tipo celular (Figura 1B). Quanto tempo se passou após a injeção de células que expressam proteínas Dendra2 photoswitchable ou outras proteínas fluorescentes depende da linha celular utilizada. O tumor não deve ser visivelmente necrotic, e deve ter uma pele intacta com o cabelo em cima do tumor. Camundongos com tumores necróticos devem ser sacrificados. </li><li> Prepare o espaço estéril para a cirurgia de fixar um pedaço de pano estéril dentro de uma capa estéril. Coloque um pedaço de g estérilauze no meio, e estabelecer uma MIWs poucos e instrumentos esterilizados em torno dele: usamos pequena tesoura standard, tesoura primavera, pinças microdissecting, fórceps microdissecting, porta-agulhas. Manter estéreis Q-dicas, uma garrafa de álcool 70% e luvas estéreis no canto da capa. </li><li> O mouse está anestesiado na capa estéreis, utilizando injeção IP de Avertin 2,5% (20 l / g) em HBSS ou, alternativamente 10 ketamina mg / kg + 10 mg / g de xilazina (em contato com o Instituto Animal Care para aprovações e ordenação). Nota: A solução deve ser preparada Avertin bi-semanal, esterilizado por filtração através de um filtro de 0,22 mM e armazenado como 500 mL em alíquotas de 4 ° C (no escuro). </li><li> Depilação, raspar a área acima do tumor usando um barbeador de pequenos animais. </li><li> Remover o resto do cabelo usando Nair creme de depilação (disponível em qualquer farmácia). Limpar a pele utilizando etanol mergulhado Q-dicas. </li><li> Transferência do animal para a gaze esterilizada e aplicar pomada oftálmica nos olhos para mantê-los a partir de secagem e infecção. </li><li> Esterilizar a pele com betadine e limpa com álcool 70%. </li><li> Transferência do animal em um pano cirúrgica estéril dentro do capô estéril. </li><li> Puxe a pele imediatamente medial ao mamilo usando uma pinça e corte incisão ~ 2 milímetros na pele. </li><li> Separar os pad mamárias de gordura subjacente da pele com uma tesoura de dissecção e uma pinça. A pele e esticar buraco durante esta etapa de separação para um tamanho que irá acomodar a inserção do MIW. </li><li> Se acidentalmente um navio é atingido durante sugery, use um estéril Q-dicas para remover qualquer vestígio de sangue que é produzido / para parar o sangramento se torne excessivo. </li><li> Insira o MIW tal que não é a pele em cima da base MIW e sutura no local usando fio não absorvível e reverter o corte da agulha. </li><li> Use tecido adesivo ou cianoacrilato para preencher os buracos e proteger a sutura MIW para a pele. </li><li> Adicionar SMX-TMP mix de antibióticos: (Sulfametoxazol 0,6 mg / ml, Trimetoprima 0,12 mg / ml) para a garrafa de água gaiola por 3 dias antes e depois da cirurgia. </li><li> O animal permanece sob anestesia por 1-4h após a injeção Avertin IP. Desde a cirurgia normalmente leva ~ 45min, é importante para ajudar o animal recuperar mais tarde: </li><li> Coloque uma almofada de aquecimento mão (37 ° C) (disponível em farmácias) na parte inferior da gaiola e cubra-a com gaze. </li><li> Manter o animal em cima da almofada até que fique em seu estômago e começa a andar. </li><li> Se o animal estiver inconsciente por mais de 3h, injetar 0,3 ml de HBSS via intraperitoneal para a reidratação. </li><li> O animal é permitido para se recuperar ao longo dos próximos dias 3-4 antes da sessão primeira imagem ocorre. </li></ol> 4. Construção de imagens Box A caixa de imagem garante que o MIW está sentado plano, logo acima da objetiva do microscópio. Além disso, facilita o controle de temperatura e fluxo de ar através de anestesia constante de isoflurano. A caixa é feita de acrílico e colados usando solda de plástico. Está equipado para a fase microscópio específico e, portanto, a forma de seu fundo varia de acordo com o microscópio utilizado (Figura 2 mostra o esquema da caixa montado Leica estágio do microscópio SP5). Dimensões da caixa em centímetros são l = 11,4 cm, w = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Figura 2A). A parte inferior da caixa consiste de uma placa oca, 12.7x8.4 cm de tamanho, o que se encaixa dentro do estágio do microscópio Leica SP5, e duas de correr &quot;portas&quot;, 5,7 X 5,7 cm_each, que formam uma abertura circular (d = 2,22 centímetros ) quando fechado. O MIW se encaixa nessa abertura. A parte frontal contém o orifício de entrada para a entrega da anestesia, enquanto uma das partes laterais contém um orifício de saída que leva ao vácuo. Note-se que o condensador eo suporte de slides precisam ser removidas antes da colocação caixa de imagem. 5. Box imagem Use <ol><li> Colocar o animal sob anestesia com isoflurano e aplicar pomada oftálmica nos olhos. </li><li> Anexar o isoflurano escape do aparelho de anestesia para a frente da caixa de imagem, do lado de fora do orifício de entrada (Figura 2B). </li><li> Anexar um segundo tubo para o orifício de saída da caixa de imagem. Este tubo deve ser conectado ao filtro de gás e depois para o vácuo. </li><li> Abra a tampa da caixa e abrir as portas caixa e colocar o animal, MIW lado voltado para o fundo, e as portas deslizantes na caixa. </li><li> Segure a caixa e ajuste as portas inferior de modo que a base é mantida MIW e imobilizado entre eles. A base MIW deve estar no mesmo nível que as portas caixa de imagem, enquanto a lamela MIW deve ser apenas alguns milímetros abaixo deste nível. Certifique-se que o posicionamento do MIW entre o fundo portas de correr garante que as lamelas (parte de vidro da MIW) está flat, em paralelo com as portas de fundo da caixa. Isto irá assegurar foco adequado. </li><li> Inferior a objetiva do microscópio, para permitir espaço para a colocação da caixa nosuperior do palco microscópio. </li><li> Coloque a caixa sobre o estágio do microscópio, e ajustar o estágio para que a lamela MIW está acima do objetivo. </li><li> Foco o objetivo e começar de imagem. </li><li> Durante o uso de isoflurano, o animal deve ser monitorado por inspeção visual da freqüência respiratória. Isto pode ser feito visualmente, ou através do monitoramento da freqüência de artefatos de respiração que aparecem durante o exame de coleta (estes podem interferir com a aquisição de dados). O MouseOx sistema de oximetria de pulso (Starr vida Sciences Corp) tem sido utilizado com sucesso. Dessa forma, os dados podem ser coletados continuamente, sem acender as luzes na sala para verificar o animal. Nota: Depois de cada sessão de imagens, recuperação de animais deve ser facilitada envolvendo uma almofada de aquecimento pequena mão em gaze ou kimwipes e colocá-lo sob o animal na jaula. Nota: Se uma objetiva de imersão é usado para a imagem através do MIW, o meio de imersão (glicerol, óleo, água) deve ser removido da janela de imagem. O MIW devem ser inspecionados por qualquer rachaduras ou outros danos que possam ter ocorrido durante o exame. Isto é crítico para a coleta de dados durante as sessões de imagens múltiplas. </li></ol> 6. Photoswitching e imagem de Dendra2 marcado com células O procedimento é descrito para o microscópio confocal SP5 Leica; a potência do laser no plano focal, os objectivos e opções disponíveis variam de software ao utilizar outros microscópios confocal ou imagem multifotônica configurar e, portanto, o protocolo descrito a seguir deve ser usado como um guia para otimizar a experiência no seu microscópio. <ol><li> Ao observar o tumor através da ocular (10x) com o filtro de fluorescência verde, localizar os vasos sanguíneos principais que são visivelmente fluindo e deitado no mesmo plano focal. </li><li> Posição de uma das embarcações no centro do campo e mudar para a detecção PMT. </li><li> Estabelecer a recolha de imagens seqüenciais para dois canais. Um dos canais utiliza linha de laser 488nm (10% de energia), e coleta de dispersão da matriz extracelular (480-495nm) e de emissão a partir do formulário verde do Dendra2 (505-540 nm). O segundo canal usa a linha de laser 543nm (90% de energia) e coleta de emissão a partir do formulário de Dendra2 vermelho (555-600nm). Coletar imagens em 3D pré-photoswitching. </li><li> Use o ROI opção de digitalização para photoswitch uma população escolhida de células usando a linha de laser de 405nm (30% de potência, scans 20-40). Colete de emissão do formulário de vermelho da proteína para monitorar a mudança. </li><li> Usando a mesma rotina seqüencial como no 6.3, coletar pós-mudança das imagens 3D. </li><li> Se photoswitching mais de uma região do tumor, recomenda-se para tirar fotos através do oculares usando uma câmera digital, em ambos os canais verde e vermelho (Figura 3A, B). Isso vai ajudar na orientação durante as sessões de imagem subseqüentes. Nota: Além disso, os vasos sanguíneos podem ser temporariamente rotulados com cauda veia-injeção de dextran fluorescentes (Cascade azul ou Alexa Fluor 647, ambos 10kDa). Poucas horas após a injeção, dextranos vai deixar os vasos sanguíneos e permanentemente rótulo dos macrófagos. </li></ol> Resultados representativos: Figura 3C mostra uma região retangular photoswitched (vermelho) orientada ortogonalmente em relação ao vaso sanguíneo (ausência de fluorescência). Não photoswitched células são verdes, enquanto a dispersão da matriz extracelular é roxo. Imagem é uma projeção de intensidade máxima de quatro imagens ao longo do eixo Z (20-50 profundidade mm).

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</ol>

<table><tbody><tr><td>PBS sem Ca, Mg</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Meio DMEM (células MDA-MB-231)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td># NDC 10019-773-40</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo SCID</td><td>Instituto Nacional do Câncer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Pedido personalizado</td></tr><tr><td>Lâmina circular de 8 mm</td><td>Scientific, Inc.</td><td>8CIR-1-FIS</td><td></td></tr></tbody></table>

dendra2 photoswitching através da janela de imagem mamária

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Na última década, microscopia, intravital de tumores de mama em camundongos e ratos com uma única célula de resolução<sup&gt; 04/01</sup&gt; Resultou em importantes insights sobre os mecanismos de comportamento metastático, como invasão, migração e intravasation de células tumorais<sup&gt; 5, 6</sup&gt;, A angiogênese<sup&gt; 3</sup&gt; E resposta imune de células<sup&gt; 09/07</sup&gt;. Recentemente, reportaram a técnica de imagem ortotópico carcinomas mamários através de múltiplas sessões de imagem intravital em ratos vivos<sup&gt; 10</sup&gt;. Para isso, temos desenvolvido uma janela de imagem mamária (MIW) e parâmetros de imagem otimizado para Dendra2<sup&gt; 11</sup&gt; Photoswitching e imagem<em&gt; In vivo</em&gt;. Aqui, descrevemos o protocolo para a fabricação de MIW, inserção do MIW em cima de um tumor e imagem das células Dendra2 marcado tumor utilizando uma caixa de imagem personalizado construído. Este protocolo pode ser usado para a imagem do comportamento metastático das células tumorais em microambientes distintos em tumores e permite a imagem a longo prazo dos vasos sanguíneos, células tumorais e células hospedeiras.

Photoswitching intravital e acompanhamento de Dendra2 marcado células tumorais através da janela de imagem mamária é uma técnica que nos permite a imagem do comportamento metastático das células tumorais em microambientes tumorais escolhido em detrimento de uma escala temporal de dias.

Dendra2 Photoswitching através da janela de imagem mamária

Na última década, a microscopia intravital de tumores mamários em camundongos e ratos com resolução de célula única1-4 resultou em insights importantes sobre...

Este vídeo ilustra um protocolo que começa com a injeção de uma linhagem celular tumoral que expressa proteína fluorescente na bolsa de gordura mamária do camundongo. Uma câmara especializada para imagem in vivo é construída e, em seguida, implantada cirurgicamente no animal, momento em que os dados de imagem podem ser adquiridos. Olá, sou o Dr. Vic do laboratório dos Doutores John Conde e Jeffrey Siegel do Centro de Biofotônica da Faculdade de Medicina Albert Einstein.Hoje vamos mostrar um procedimento para comutação fotônica intravital e imagem de células cancerígenas marcadas com DRA dois através da janela de imagem de memória. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a influência do microambiente tumoral na motilidade das células tumorais. Vamos começar, usando luvas de látex.Inicie a fabricação da janela de imagem mamária, ou MIW, aquecendo um prato de cultura de tecidos de cinco a 10 centímetros e criando uma superfície curva ao pressionar um objeto duro arredondado, como uma ponteira Dremel de uma polegada, contra o prato. Corte o centro do prato usando uma lâmina de barbear aquecida. Agora, utilize uma ponteira Dremel pequena com formato cônico para fazer um orifício de seis a sete milímetros de diâmetro no centro da base plástica com formato de cúpula.Deixe as bordas da base de plástico completamente lisas lixando-a com a Dremel e, posteriormente, utilizando uma lima. Limar a parte superior da base de plástico para obter uma superfície plana para a lamínula de vidro. O diâmetro da superfície plana lixada deve ser de nove a dez milímetros.Em seguida, cole a lamínula circular de vidro de oito milímetros. Deslize-a sobre a superfície plana usando cola instantânea e deixe secar por 15 minutos. Usando uma agulha aquecida de 26 G, faça oito furos para sutura perfurando do lado externo para o interno da base; os furos devem ser distribuídos uniformemente ao redor da lamínula.Deslize o nwt 0,5 a um milímetro de distância da borda da lamínula. Lave o MIW com água desionizada e, em seguida, novamente com etanol 70%. Use um cotonete para limpar o vidro até que fique completamente transparente.Use acetona para remover quaisquer manchas turvas residuais provenientes do vapor da cola. Por fim, esterilize o MIW expondo-o à luz ultravioleta por três horas em cada lado. Antes de inserir o MIW, a região ao redor do quarto mamilo deverá ter desenvolvido um pequeno tumor de cinco a sete milímetros de diâmetro como resultado da injeção de células tumorais.Na primeira parte, verifique se o tumor não está visivelmente necrótico. Deve haver pele íntegra com pelos na região ao redor. Para começar, prepare um espaço estéril para a cirurgia colocando um pedaço de tecido estéril dentro de uma capela estéril.Coloque um pedaço de gaze estéril no centro e reúna os itens necessários para a cirurgia. Você precisará de um par de tesouras de dissecação pequenas e um par de tesouras de dissecação grandes com mola, pinças microcirúrgicas e pinças hemostáticas, e um porta-agulhas. Após anestesiar o camundongo com 2,5% de avertin, use uma máquina de barbear para animais pequenos para aparar a área acima do tumor. Use creme depilatório para remover os pelos restantes e limpe a pele.Usando cotonetes embebidos em etanol. Transfira o animal para a gaze estéril e aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar que sequem e fiquem infectados. Esterilize a pele com Betadine e depois limpe com etanol 70%.Com o pano cirúrgico anual e estéril, puxe a pele imediatamente medial ao mamilo usando pinça e faça uma incisão de aproximadamente dois milímetros. Separe o coxim adiposo mamário subjacente da pele por meio de dissecação, tesoura e pinça. Após a separação, a pele e o orifício se esticam até um tamanho que acomodará a inserção do MIW.Insira o MIW de forma que haja pele sobre a base do MIW e sutura-o no lugar. Use adesivo tecidual ou cianoacrilato para preencher os orifícios de sutura e fixar o MIW à pele. O animal deve agora ser deixado em recuperação pelos próximos três a quatro dias antes que ocorra a primeira sessão de imagem.Em preparação para a sessão de imagem, podemos descrever a caixa de imagem para aproveitar ao máximo a caixa de imagem. Primeiro, anestesie o animal com isoflurano e aplique pomada oftálmica nos olhos. Conecte o exaustor de isoflurano do aparelho de anestesia à frente da caixa de imagem.No exterior do orifício de entrada. Conecte um segundo tubo ao orifício de saída da caixa de imagem. Esse tubo deve ser conectado ao filtro de gás e, em seguida, ao vácuo.Em seguida, posicione o animal de forma que o MIW esteja voltado para baixo. Segure a caixa e ajuste as portas inferiores para que a base do MIW seja segurada e imobilizada entre elas. A base do MIW deve estar no mesmo nível das portas da caixa de imagem.Embora a lamínula do MIW deva estar apenas alguns milímetros abaixo desse nível, certifique-se de que o posicionamento do MIW entre as portas deslizantes inferiores garanta que a lamínula fique plana e paralela às portas inferiores da caixa. Isso permitirá o foco adequado, rebaixando a objetiva do microscópio para liberar espaço e colocar a caixa sobre a platina do microscópio. Ajuste a platina de modo que a lamínula do MIW fique acima da objetiva.Agora podemos focar a objetiva e iniciar a aquisição de imagens. O procedimento de aquisição descrito aqui é para o microscópio confocal Leica SP five e deve ser usado como orientação para otimizar o experimento com o microscópio específico em uso. Comece observando o tumor através da ocular com um filtro fluorescente verde.Localize os principais vasos sanguíneos que estão claramente fluxando e dispostos planos no mesmo plano focal. Posicione um dos vasos no centro do campo e mude para a detecção por PMT. Vamos configurar a coleta sequencial de imagens para dois canais.Um canal utiliza a linha de laser de 488 nanômetros e coleta a dispersão da matriz extracelular e a emissão da forma verde da dendra dois. O segundo canal utiliza a linha de laser de 543 nanômetros e coleta a emissão da forma vermelha da dendra dois. Adquira imagens tridimensionais antes da comutação fotônica.Em seguida, utilize a opção de varredura da região de interesse para fotoativar uma população escolhida de células com a linha a laser de 405 nanômetros. Colete a emissão da forma vermelha da proteína para monitorar a fotoativação. Agora, colete imagens tridimensionais pós-fotoativação pelo mesmo método utilizado para coletar as imagens pré-fotoativação.Certo, então com o uso de 20% da potência do laser no ultravioleta para ativar ou converter esta área em fotochaveamento, ative mais de uma região no tumor e tire imagens através das oculares usando uma câmera digital nos canais verde e vermelho. Isso ajudará na orientação durante sessões subsequentes de imageamento. Nesta imagem, observa-se uma região retangular de fotochaveamento orientada ortogonalmente em relação ao vaso sanguíneo, a qual não exibe fluorescência.Células não fotoativáveis aparecem verdes, enquanto o espalhamento proveniente da matriz extracelular é roxo. A imagem é uma projeção de intensidade máxima de quatro imagens ao longo do eixo Z. Acabamos de mostrar como fotoativar e imagens células marcadas com a ferramenta RA através da janela de imagem de memória.Utilizar este procedimento é importante para comparar os comportamentos de células tumorais em diferentes áreas do tumor ao longo de dias. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, realizamos imagens intravitais de células cancerígenas pré-injetadas em um modelo de camundongo por meio de uma janela craniana implantada. Esta técnica de imagem de lapso de tempo de alta resolução permite o estudo do comportamento dinâmico das células cancerígenas no camundongo vivo.

Imagem intravital baseada em janela craniana em um modelo de camundongo: uma técnica de imagem para estudar o comportamento de células cancerígenas pré-injetadas no cérebro de um modelo murino

Aqui, descrevemos uma técnica para a entrega localizada de reagentes na glândula mamária de coelho por meio de uma injeção intraductal. Além disso, descrevemos um protocolo para visualização e confirmação da entrega por ultrassonografia de alta resolução de agentes de contraste.

Entrega Intraductal ao Coelho glândula mamária

Uma abordagem é aqui apresentada para imagens intravitais de longo prazo usando janelas de silicone opticamente claras que podem ser coladas diretamente ao tecido/órgão de interesse e à pele. Essas janelas são mais baratas e mais versáteis do que outras atualmente utilizadas no campo, e a inserção cirúrgica causa inflamação e angústia limitadas aos animais.

Imagem intravital longitudinal através de janelas de silicone claras

Este protocolo descreve uma nova janela de imagem mamária com uma tampa substituível (R.MIW). A microscopia intravital após a implantação do R.MIW permite imagens longitudinais e de vários dias da glândula mamária saudável e doente com resolução celular durante os diferentes estágios de desenvolvimento.

Microscopia intravital longitudinal usando uma janela de imagem mamária com tampa substituível

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

O presente protocolo descreve uma técnica fácil para a imagem intravital da glândula mamária de camundongos lactantes por microscopia confocal e multifotônica de varredura a laser.

Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

Apresentamos um protocolo para o implante cirúrgico de uma janela óptica de demora estabilizada para imagens de resolução subcelular do pâncreas murino, permitindo estudos seriados e longitudinais do pâncreas sadio e doente.

Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino

Dinâmica do fluxo sanguíneo cortical pode ser estudada in vivo por corantes fluorescentes imagem dextran injetado na veia da cauda dos roedores com 2-fótons microscopia. Este vídeo mostra como a dinâmica do fluxo sanguíneo na imagem neocórtex de ratos através de um vidro coberto de preparação janela craniana.

Um método para 2-Photon Imagens de Fluxo de Sangue no neocórtex através de uma janela Cranial

O microscópio de luz é uma ferramenta básica para a biologia celular, que deve ter um entendimento completo de como ele funciona, como ele deve ser alinhado para diferentes aplicações, e como ele deve ser mantido como necessário para obter a capacidade máxima de formação da imagem e resolução. Os componentes do microscópio são descritos em detalhes aqui.

Componentes principais do microscópio de luz

Células tumorais mamárias expressar luciferase são implantados subcutaneamente em camundongos e visualizado utilizando imagens ópticas para monitorar o crescimento do tumor e de desenvolvimento não-invasiva em um estudo longitudinal.

In vivo Bioluminescent imagem de tumores mamários Usando Spectrum IVIS

Aprenda a realizar photoswitching de Dendra2 em células tumorais através da janela de imagem mamária em camundongos. Este método permite rastrear o comportamento metastático das células em seu microambiente tumoral in vivo.

Dendra2 Photoswitching através da janela de imagem mamária

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