Dendra2 Photoswitching através da janela de imagem mamária

Este vídeo ilustra um protocolo que começa com a injeção de uma linhagem celular tumoral que expressa proteína fluorescente na bolsa de gordura mamária do camundongo. Uma câmara especializada para imagem in vivo é construída e, em seguida, implantada cirurgicamente no animal, momento em que os dados de imagem podem ser adquiridos. Olá, sou o Dr. Vic do laboratório dos Doutores John Conde e Jeffrey Siegel do Centro de Biofotônica da Faculdade de Medicina Albert Einstein.

Hoje vamos mostrar um procedimento para comutação fotônica intravital e imagem de células cancerígenas marcadas com DRA dois através da janela de imagem de memória. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a influência do microambiente tumoral na motilidade das células tumorais. Vamos começar, usando luvas de látex.

Inicie a fabricação da janela de imagem mamária, ou MIW, aquecendo um prato de cultura de tecidos de cinco a 10 centímetros e criando uma superfície curva ao pressionar um objeto duro arredondado, como uma ponteira Dremel de uma polegada, contra o prato. Corte o centro do prato usando uma lâmina de barbear aquecida. Agora, utilize uma ponteira Dremel pequena com formato cônico para fazer um orifício de seis a sete milímetros de diâmetro no centro da base plástica com formato de cúpula.

Deixe as bordas da base de plástico completamente lisas lixando-a com a Dremel e, posteriormente, utilizando uma lima. Limar a parte superior da base de plástico para obter uma superfície plana para a lamínula de vidro. O diâmetro da superfície plana lixada deve ser de nove a dez milímetros.

Em seguida, cole a lamínula circular de vidro de oito milímetros. Deslize-a sobre a superfície plana usando cola instantânea e deixe secar por 15 minutos. Usando uma agulha aquecida de 26 G, faça oito furos para sutura perfurando do lado externo para o interno da base; os furos devem ser distribuídos uniformemente ao redor da lamínula.

Deslize o nwt 0,5 a um milímetro de distância da borda da lamínula. Lave o MIW com água desionizada e, em seguida, novamente com etanol 70%. Use um cotonete para limpar o vidro até que fique completamente transparente.

Use acetona para remover quaisquer manchas turvas residuais provenientes do vapor da cola. Por fim, esterilize o MIW expondo-o à luz ultravioleta por três horas em cada lado. Antes de inserir o MIW, a região ao redor do quarto mamilo deverá ter desenvolvido um pequeno tumor de cinco a sete milímetros de diâmetro como resultado da injeção de células tumorais.

Na primeira parte, verifique se o tumor não está visivelmente necrótico. Deve haver pele íntegra com pelos na região ao redor. Para começar, prepare um espaço estéril para a cirurgia colocando um pedaço de tecido estéril dentro de uma capela estéril.

Coloque um pedaço de gaze estéril no centro e reúna os itens necessários para a cirurgia. Você precisará de um par de tesouras de dissecação pequenas e um par de tesouras de dissecação grandes com mola, pinças microcirúrgicas e pinças hemostáticas, e um porta-agulhas. Após anestesiar o camundongo com 2,5% de avertin, use uma máquina de barbear para animais pequenos para aparar a área acima do tumor. Use creme depilatório para remover os pelos restantes e limpe a pele.

Usando cotonetes embebidos em etanol. Transfira o animal para a gaze estéril e aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar que sequem e fiquem infectados. Esterilize a pele com Betadine e depois limpe com etanol 70%.

Com o pano cirúrgico anual e estéril, puxe a pele imediatamente medial ao mamilo usando pinça e faça uma incisão de aproximadamente dois milímetros. Separe o coxim adiposo mamário subjacente da pele por meio de dissecação, tesoura e pinça. Após a separação, a pele e o orifício se esticam até um tamanho que acomodará a inserção do MIW.

Insira o MIW de forma que haja pele sobre a base do MIW e sutura-o no lugar. Use adesivo tecidual ou cianoacrilato para preencher os orifícios de sutura e fixar o MIW à pele. O animal deve agora ser deixado em recuperação pelos próximos três a quatro dias antes que ocorra a primeira sessão de imagem.

Em preparação para a sessão de imagem, podemos descrever a caixa de imagem para aproveitar ao máximo a caixa de imagem. Primeiro, anestesie o animal com isoflurano e aplique pomada oftálmica nos olhos. Conecte o exaustor de isoflurano do aparelho de anestesia à frente da caixa de imagem.

No exterior do orifício de entrada. Conecte um segundo tubo ao orifício de saída da caixa de imagem. Esse tubo deve ser conectado ao filtro de gás e, em seguida, ao vácuo.

Em seguida, posicione o animal de forma que o MIW esteja voltado para baixo. Segure a caixa e ajuste as portas inferiores para que a base do MIW seja segurada e imobilizada entre elas. A base do MIW deve estar no mesmo nível das portas da caixa de imagem.

Embora a lamínula do MIW deva estar apenas alguns milímetros abaixo desse nível, certifique-se de que o posicionamento do MIW entre as portas deslizantes inferiores garanta que a lamínula fique plana e paralela às portas inferiores da caixa. Isso permitirá o foco adequado, rebaixando a objetiva do microscópio para liberar espaço e colocar a caixa sobre a platina do microscópio. Ajuste a platina de modo que a lamínula do MIW fique acima da objetiva.

Agora podemos focar a objetiva e iniciar a aquisição de imagens. O procedimento de aquisição descrito aqui é para o microscópio confocal Leica SP five e deve ser usado como orientação para otimizar o experimento com o microscópio específico em uso. Comece observando o tumor através da ocular com um filtro fluorescente verde.

Localize os principais vasos sanguíneos que estão claramente fluxando e dispostos planos no mesmo plano focal. Posicione um dos vasos no centro do campo e mude para a detecção por PMT. Vamos configurar a coleta sequencial de imagens para dois canais.

Um canal utiliza a linha de laser de 488 nanômetros e coleta a dispersão da matriz extracelular e a emissão da forma verde da dendra dois. O segundo canal utiliza a linha de laser de 543 nanômetros e coleta a emissão da forma vermelha da dendra dois. Adquira imagens tridimensionais antes da comutação fotônica.

Em seguida, utilize a opção de varredura da região de interesse para fotoativar uma população escolhida de células com a linha a laser de 405 nanômetros. Colete a emissão da forma vermelha da proteína para monitorar a fotoativação. Agora, colete imagens tridimensionais pós-fotoativação pelo mesmo método utilizado para coletar as imagens pré-fotoativação.

Certo, então com o uso de 20% da potência do laser no ultravioleta para ativar ou converter esta área em fotochaveamento, ative mais de uma região no tumor e tire imagens através das oculares usando uma câmera digital nos canais verde e vermelho. Isso ajudará na orientação durante sessões subsequentes de imageamento. Nesta imagem, observa-se uma região retangular de fotochaveamento orientada ortogonalmente em relação ao vaso sanguíneo, a qual não exibe fluorescência.

Células não fotoativáveis aparecem verdes, enquanto o espalhamento proveniente da matriz extracelular é roxo. A imagem é uma projeção de intensidade máxima de quatro imagens ao longo do eixo Z. Acabamos de mostrar como fotoativar e imagens células marcadas com a ferramenta RA através da janela de imagem de memória.

Utilizar este procedimento é importante para comparar os comportamentos de células tumorais em diferentes áreas do tumor ao longo de dias. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.