Combinando nervos periféricos Enxertia e Modulação Matrix reparar o cabo de Rat feridos Spinal

O preparo para o enxerto de um nervo periférico em um local de lesão medular começa com a pré-degeneração do NGP sete a dez dias antes do enxerto. O ramo do nervo tibial de uma rata doadora é seccionado. Uma hemicisão no nível cervical cinco ou C5 é realizada por aspiração.

O PNG é removido do rato doador e posicionado contra a parede rostral da cavidade da lesão, sendo fixado por sutura com ouro à dura-máter. Três semanas depois, é realizada uma lesão no quadrante dorsal em C7; uma espuma de gel saturada com C-H-A-B-C é colocada na cavidade por 15 minutos para digerir os proteoglicanos da cicatriz glial. Dois dias depois, C-H-A-B-C é microinjetado adjacente ao local da lesão, e a extremidade distal do PNG é posicionada contra a lesão do quadrante dorsal.

Olá, sou John Hula. Sou diretor do Centro de Pesquisa em Lesão da Medula Espinal da Faculdade de Medicina da Drexel University. Sou a Dra. Veronica Tom do laboratório Hula e sou Martha Mean.

Do laboratório Hula. Hoje demonstraremos um procedimento de transplante de um segmento de nervo periférico para a medula espinhal lesada de uma rata adulta. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a regeneração de axônios e a recuperação da função após lesão medular.

Ok, vamos começar. Para se preparar para cirurgia microscópica, sanitize a estação cirúrgica e autóclave todos os instrumentos cirúrgicos. Prepare a barreira térmica e os pequenos pedaços de espuma de gel com menos de dois milímetros cúbicos para hemostasia microcirúrgica.

Prepare cotonetes, compressas de gaze e instrumentos cirúrgicos. Coloque a rata anestesiada sobre a mesa de preparação após confirmar, com um aperto no dedo do pé, que o animal está completamente anestesiado. Depile uma ampla área de pelos do campo cirúrgico pretendido e lave o local da cirurgia seguindo a técnica de anti-sepsia descrita no protocolo de texto acompanhante.

Em seguida, coloque o rato sobre a barreira térmica, cubra seu nariz e boca com o cone de inalação e reduza a isoflurana para 3% e a taxa de fluxo para 0,2 litros por minuto. Administre a dose apropriada do antibiótico ampicilina por injeção subcutânea e do analgésico buprenorfina por injeção intramuscular. O nervo periférico ou PN é seccionado de sete a dez dias antes de sua remoção para promover a degeneração, o que proporciona um ambiente mais adequado para o crescimento axonal do que uma preparação fresca do nervo.

Para iniciar a secção do pn, posicione o animal de lado. Troque para luvas estéreis e coloque um campo cirúrgico estéril ao redor do local da cirurgia. Faça uma incisão em linha reta da cabeça do fêmur até o joelho, mantendo-se paralelo e a aproximadamente três milímetros do fêmur, cortando os músculos bíceps femorais superficiais ao longo da mesma linha da incisão na pele para expor o músculo vasto lateral subjacente.

Uma vez exposto o músculo vasto lateral, use uma tesoura para fazer um pequeno corte nele próximo ao joelho e estenda-o em direção à cabeça do fêmur. Separe suavemente com afastadores o vasto lateral até que os ramos nervosos tibial e perineal conjuntos do nervo ciático sejam visualizados correndo paralelos ao fêmur. Em seguida, siga esses ramos nervosos em direção à cabeça do fêmur até que o tronco principal do nervo ciático seja identificado.

Apenas abaixo da bifurcação do nervo isquiático, use pinças finas para separar cuidadosamente o tecido conjuntivo ou epineúrio que envolve o ramo do nervo tibial. Este é o ramo maior. Uma vez isolado o ramo do nervo tibial, passe uma ligadura de seda de seis zero ao redor dele e aperte.

Use tesoura microcirúrgica para seccionar o nervo logo após a ligadura. Passe o fio cirúrgico através do músculo vasto lateral e amarre em um nó. Isso fornecerá uma referência para localizar facilmente a extremidade cortada do nervo tibial.

Quando o nervo for coletado. Posteriormente, feche o músculo vasto lateral com seis suturas de seda 6-0. Depois disso, feche o músculo PMOs do bíceps com seis suturas de seda 6-0.

Por fim, feche a pele com clipes de ferida Michelle. Desligue o fluxo de isoflurano e remova o cone de inalação nasal. Coloque o animal em uma gaiola de contenção sobre uma barreira térmica.

Retorne o animal à sua gaiola de origem. Quando estiver alerta e ativo, sete a dez dias depois, o segmento de PN estará pronto para ser colhido. Para iniciar o transplante, coloque o animal anestesiado sobre a barreira térmica.

Após confirmar que o animal está completamente anestesiado, remova os grampos da ferida e separe a incisão na pele. Pode não ser necessário raspar a área previamente, pois a pele deve se separar facilmente, evitando contaminação. Ao eliminar a necessidade de cortar através da pelagem, corte a sutura do músculo superficial para expor o vasto lateral e, em seguida, corte a sutura nesse músculo.

Siga a linha de sutura até a extremidade cortada do nervo tibial e remova a sutura do nervo. Use pinças finas para dissecar o epineúrio ao longo de um segmento de 15 milímetros do nervo tibial e corte essa extremidade distal. Remova o segmento nervoso e imerja-o em solução salina balanceada de Hank estéril.

Estamos agora prontos para a próxima etapa, que consiste em induzir uma lesão medular para o transplante do PN, que pode ser autólogo ou heterólogo. Coloque a rata anestesiada sobre a barreira térmica e administre antibióticos e analgésicos conforme descrito na seção anterior para induzir uma lesão medular em HEMI-seção. Primeiro, localize a incisura occipital e o processo vertebral dorsal proeminente do T dois.

Realize uma incisão ao longo de todo o comprimento entre esses marcos externos. Corte ao longo da linha média do músculo trapézio superficial e separe os músculos cervicais ardis subjacentes. Insira um afastador para manter os músculos separados.

Os músculos supraespinais profundos devem ser cortados a partir das apófises vertebrais dorsais de C quatro, C cinco e C seis. Usando R jurados, realize uma laminectomia parcial de C cinco para expor toda a face direita e a porção medial da face esquerda da medula espinhal. Utilize a veia dorsal proeminente como referência para a linha média da medula espinhal.

Em seguida, utilize uma lâmina de bisturi microcirúrgico para perfurar a dura-máter e estender o corte sobre a medula espinhal do nível C cinco. Faça uma pequena incisão na aracnoide e na pia-máter subjacentes com uma micropipeta de vidro esticada. Comece a aspirar o lado dorsal direito da medula espinhal aplicando pressão suave e utilizando pinças microcirúrgicas para separar o tecido e facilitar sua remoção.

Continue pelas porções intermediária e ventral da medula espinhal para criar uma cavidade com dois milímetros de comprimento, completa da região dorsal à ventral e da linha média até as meninges laterais. Coloque espuma de gel embebida em solução salina na cavidade da lesão da seção HEMI. Para obter hemostasia, remova o segmento previamente colhido de nervo periférico da solução de Hank.

Sinta suavemente a epineuro nos três milímetros proximais do segmento nervoso e aproxime essa extremidade da parede rostral da cavidade da lesão na seção HEMI. Fixe o segmento com suturas 10-0 através do epineuro à dura-máter. Em seguida, feche a dura com sutura sobre a extremidade implantada do enxerto, colocando o enxerto entre duas peças de membrana elástica cel.

Posicione o enxerto ao longo dos processos vertebrais C6, C7 e T1. Não aproxime a extremidade distal do nervo à medula espinhal ou ao tecido muscular. Feche os músculos em camadas com suturas 4-0 e feche a incisão na pele com clipes cirúrgicos.

Por fim, coloque o animal em uma gaiola de contenção sobre uma barreira térmica e devolva-o à sua gaiola de origem. Uma vez alerta e ativo, os axônios regenerados que alcançam a extremidade distal do enxerto de PN frequentemente não conseguem se estender de volta à medula espinhal. Por isso, utilizamos microinjeções de condroitinase ACE para degradar o tecido cicatricial que envolve a área da lesão.

Este procedimento é realizado 21 dias após o transplante de PN para iniciar, confirmando que o animal está completamente anestesiado. Em seguida, remova os grampos da ferida e administre antibióticos e analgésicos conforme mostrado anteriormente. Corte os pontos superficiais para expor a membrana elástica que envolve o enxerto nervoso utilizando pinças finas e tesouras de mola.

Libere cuidadosamente o comprimento do nervo das membranas elásticas celulares. Retraia o nervo do campo cirúrgico. Realize uma laminectomia parcial no lado direito do processo vertebral de C sete.

Fure as meninges com uma lâmina de micro-escalpelo e, por aspiração, prepare uma cavidade lesional dorsal quadrante de um milímetro cúbico na medula espinhal C7. Coloque espuma de gel embebida em solução salina na cavidade lesional para obter hemostasia. Em seguida, substitua a espuma de gel pela embebida em condroitina nace.

Um BC. Trate o local da lesão por 15 minutos, fornecendo a cada cinco minutos uma espuma em gel recém-umedecida com condroitina. Cubra o comprimento externo do enxerto nervoso com membrana escolar. Feche os músculos superficiais com quatro pontos de sutura e a incisão da pele com grampos cirúrgicos.

Coloque o animal em uma gaiola de contenção sobre uma barreira térmica e devolva-o à sua gaiola de origem assim que estiver alerta e ativo. Dois dias depois, 23 dias após o transplante de PN, realiza-se novamente uma cirurgia no animal para microinjeção de NA de condroitina na medula espinhal. Como anteriormente, os clipes da ferida são removidos do animal anestesiado e são administrados antibióticos e analgésicos.

Corte as suturas superficiais para expor a membrana elástica que envolve o enxerto nervoso. Exponha o local do enxerto C sete sem perturbar o enxerto. Em seguida, utilize uma seringa Hamilton com uma cânula de vidro estirada para microinjetar um microlitro de condroitina ace A BC no lado direito da medula espinhal, aproximadamente um milímetro distal à aproximação do enxerto com a medula espinhal.

Retire suavemente a EUR dos dois milímetros distais do segmento nervoso e aproxime essa extremidade da cavidade da lesão no nível C sete. Fixe o segmento com suturas 10 oh através do epineúrio até a dura-máter. Feche os músculos superficiais com suturas 4 oh e a incisão na pele com grampos cirúrgicos.

Coloque o animal em uma gaiola de contenção sobre uma barreira térmica e devolva-o à sua gaiola de origem assim que estiver alerta e ativo. Quando este procedimento for otimizado, o segmento do nervo periférico se integrará estreitamente à medula espinhal do hospedeiro, permitindo visualizar axônios espinhais que regeneram para dentro do enxerto. Realizamos o preenchimento por difusão do enxerto com dextrina aminada biotinilada ou BDA ascendente e descendente.

Os axónios espinais geralmente entrarão no enxerto, crescerão numa linha relativamente reta paralela ao comprimento do enxerto e se estenderão até a extremidade distal do enxerto a uma taxa de aproximadamente um milímetro por dia. Os axónios dos nervos periféricos penetrarão na medula espinal adjacente. Se o NACE de condroitina tiver sido usado para remover proteoglicanos inibitórios do tecido cicatricial circundante ao atingir a extremidade distal, muito poucos axónios de nervos periféricos se estendem para o tecido hospedeiro após o tratamento quando tratados com veículo.

No entanto, se a interface distal foi tratada com condroitina, um número significativamente maior de axônios emerge do enxerto para reinervar a medula espinhal. Conforme mostrado aqui em uma seção representativa de 15 a 20 seções por animal onde é observado o crescimento axonal, este gráfico de barras demonstra um aumento significativo no crescimento axonal após o tratamento com conjoin nace A BC. A detecção imunoquímica de marcadores sinápticos em neurônios da medula espinhal em resposta à estimulação elétrica dos axônios dentro do enxerto pode ser utilizada para avaliar a conectividade funcional entre o enxerto transplantado e a medula espinhal do hospedeiro.

Essa região da medula espinhal contendo o sítio de aproximação distal foi corada imunocitoquimicamente para amina dextrina biotinilada em verde e para o marcador sináptico sinapsina em vermelho; as setas indicam áreas nas quais houve colocalização dos marcadores, indicando que algumas fibras que se regeneraram a partir do enxerto formaram contatos sinápticos funcionais. A conectividade funcional entre os neurônios do enxerto e da medula espinhal foi também demonstrada por ensaio de expressão de CFOs. Após a estimulação sináptica dos neurônios do hospedeiro além da interface distal, esse marcador de ativação trans-sináptica pode ser identificado por muitos neurônios positivos para CFOs no tecido ipsilateral ao local do enxerto, e, em maior aumento, muito poucos neurônios positivos para CFOs podem ser observados no tecido contralateral ao enxerto.

Acabamos de mostrar como preparar um local de lesão medular para o transplante de um enxerto de nervo periférico, a fim de promover a regeneração após lesão medular. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter comprimento nervoso suficiente antes do enxerto e de posicionar o enxerto em estreita aproximação ao local da lesão medular. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.