Name: Um In Vitro Teste de Irritação da pele (SIT), utilizando o EpiDerm Reconstruído epidérmico humano Model (RHE) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-13T21:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 16 s
Description: Aprenda o teste de irritação cutânea in vitro EpiDerm SIT para toxicologia dermatológica usando epiderme humana reconstruída. Este método validado substitui testes em animais e avalia a viabilidade celular por ensaio MTT.

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Os autores gostariam de agradecer a ZEBET no BfR (Alemanha), BASF SE (Alemanha), Inc. IIVS (EUA), Zet-LSL (Áustria) para a participação no estudo multicêntrico de validação Internacional da EpiDerm Modificado SIT (5 ).

I. condicionado Tissue - Dia 0 <ol><li> Após o recebimento do kit EpiDerm EPI-200 SIT, verificar todos os componentes do kit de integridade (para detalhes veja a Tabela kit de reagentes e equipamentos específicos). </li><li> Para cada três tecidos EpiDerm, prepare uma placa de 6 poços estéreis pré-cheia com 0,9 ml de meio de ensaio. </li><li> Em condições estéreis, abrir o saco plástico contendo a placa de 24 poços contendo os tecidos EpiDerm e remova a gaze estéril. </li><li> Use uma pinça estéril, para remover cada inserção que contém o tecido EpiDerm e coloque a pastilha na placa de 24 poços vazios. Durante esta etapa, remover qualquer restantes transporte agarose que adere às paredes externas da inserção pelo gentil blotting em papel de filtro estéril. </li><li> Dentro dos próximos cinco minutos, inspecionar visualmente os tecidos. Não use tecidos defeituosos ou tecidos que são completamente cobertas com líquido. </li><li> Utilizando uma zaragatoa de algodão ponta, com cuidado secar a superfície dos tecidos. Tente não tocar o tecido diretamente - efeitos capilares são suficientes para eliminar a umidade da superfície do tecido. </li><li> Após a secagem da superfície do tecido, a transferência de três tecidos para a linha superior das placas de seis poços pré-cheia com 0,9 ml de meio de ensaio. Libertar quaisquer bolhas de ar aprisionadas debaixo do inserções. </li><li> Coloque as placas de 6 poços contendo as inserções na incubadora para a 60 ± 5 min de pré-incubação a 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% UR (Umidade Relativa). </li><li> No final dos anos 60 período de 5 min ± pré-incubação, transferir as inserções dos poços superior nos poços inferiores da placa de 6 poços. Coloque as placas de volta para a incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% UR) por um dia para o outro pré-incubação (18 ± 3 h). </li><li> Coloque o restante do meio de ensaio para a (5 ± 3 ° C). Geladeira Após a noite de pré-incubação, os produtos químicos teste pode ser aplicado para os tecidos EpiDerm. Nota: O procedimento de pré-incubação pode ser encurtado em caso de entrega tardia do tecido (por exemplo, se os tecidos chegam na quarta-feira em vez de terça-feira). </li></ol> II. Exposição a substâncias químicas - Dia 1 <ol><li> Prepare uma placa de 6 poços por produto químico teste preenchendo a linha superior apenas com 0,9 ml por poço de meio de ensaio. </li><li> Aproximadamente 5 minutos antes da exposição prevista para produtos químicos, remover as placas de 6 poços contendo os tecidos pré-condicionado da incubadora. </li><li> Avaliar a superfície dos tecidos e retirar a umidade usando cotonetes estéreis. </li><li> Rotular todos os seis tampas bem-placa com os códigos de testar o material ou nomes. </li><li> Dose os tecidos com os produtos químicos teste em intervalos de 1 minuto para facilitar a lavagem dos produtos químicos de teste após a exposição. Mantenha as placas com tecidos dosado na capa estéril, até que o tecido última é dosado. </li><li> Para testar produtos químicos líquidos, dispensar 30 mL da solução diretamente sobre o tecido e colocar a malha de nylon na superfície dos tecidos. Se necessário, suavemente a posição da malha usando o bulbo de vidro dirigido Pasteur pipeta. Não pressione a superfície do tecido. </li><li> Para semi-sólidos de teste, use uma pipeta de deslocamento positivo para dispensar 30 mL diretamente sobre o tecido. Se necessário, a disseminação química com pipeta Pasteur para cobrir a superfície do tecido, tanto quanto possível. </li><li> Para materiais sólidos, pouco antes da aplicação da substância de ensaio, umedecer a superfície do tecido com 25 mL de DPBS estéril. Isto irá melhorar o contato da superfície do tecido com a substância química de ensaio. Encha uma colher de 25 mg aplicação calibrada afiada (ou qualquer outra ferramenta apropriada) com aproximadamente 25 mg de material finamente moído teste. Aplicar o teste químico sólido à superfície do tecido. Se necessário, use uma lâmpada de cabeça Pasteur Pipeta para esvaziar completamente a colher. Agite suavemente o inserções para melhorar a difusão do sólido na superfície. </li><li> No caso de substâncias com consistência cerosa, tentar formar um "cookie como" flat pedaço de cerca de 8 mm de diâmetro e coloque-o em cima do tecido, que foi previamente umedecido com DPBS estéril. Para melhorar o contato entre substância e tecidos, pesar o "cookie" com um aço inoxidável ou de plástico ajuda. </li><li> Aplicar DPBS como o controle negativo e SDS 5% como controle positivo para os tecidos de controle. </li><li> Após a administração do tecido passado, transferir todas as placas para 35 ± 1 minuto para a incubadora umidificada (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% UR). </li><li> Após a 35 ± 1 minuto de incubação a 37 ° C remover todas as placas da incubadora. Coloque as placas na capa estéril e esperar até que um período de 60 minutos de exposição química é preenchido para o primeiro tecido dosado. </li><li> Depois iniciar o procedimento de lavagem usando a inserir um intervalo de tempo por minuto (para um seguroe que o tempo total de exposição para cada inserção é de 60 minutos). </li><li> Use um frasco de lavagem para lavar os tecidos com DPBS estéril. Preencha o tecido inserir 15 vezes usando um fluxo constante de DPBS e esvaziá-lo (Nota:. Para os tecidos com uma malha de nylon, lavar a superfície do tecido 5 vezes e remover a malha cuidadosamente com o apontado, pinças afiadas Depois, continue com os restantes 10 lavagens). </li><li> Após o 15 enxaguar utilizando o frasco de lavagem, submergir completamente a inserção 3 vezes em 150 DPBS ml e agitar para remover o restante do material de teste. </li><li> Finalmente, lave a inserção do tecido uma vez a partir do interior e uma vez do lado de fora com DPBS estéril. </li><li> Remova qualquer excesso de DPBS a partir do tecido agitando a inserir e blotting-lo no papel estéril blotting. </li><li> Transferir as inserções de tecidos riscados para o novo prato 6-bem anteriormente pré-cheia com o meio de ensaio. Todas essas etapas (14-18) deve ser feito dentro de 1 min para cada inserção. </li><li> Após a última tecido é enxaguado, seco cuidadosamente a superfície de cada tecido com algodão estéril ponta cotonete. </li><li> Incubar os tecidos na incubadora para o próximo 24 ± 2 horas (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% UR). Nota: Cada técnico do ensaio não deve testar mais de 6 substâncias, incluindo os controles positivos e negativos em uma corrida de teste único (set), para poder seguir o protocolo, conforme descrito abaixo </li></ol> III. Meio de troca - Dia 2 <ol><li> Após a 24 ± 2 horas pós-incubação, transferir o insere na parte inferior da placa de 6 poços, pré-cheia com 0,9 ml de mídia. Meios de comunicação de linhas superior pode ser recolhida para análise dos pontos finais adicionais (citocinas, quimiocinas, etc.) Análise dos desfechos secundários é opcional. </li><li> Continuar com a pós-incubação (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% UR) por mais 18 ± 3 horas. </li></ol> IV. MTT Assay Viabilidade - Dia 3 <ol><li> Etiqueta de duas placas de 24 poços com os nomes químicos ou códigos. Uma placa servirá para a incubação do tecido com MTT e outro para a etapa de extração. </li><li> Preparar a solução de MTT por descongelamento concentrado MTT (5 mg / ml) e diluir com o diluente MTT. Concentração final da solução de MTT é de 1 mg / ml. </li><li> Pipetar 300 mL da solução de MTT em cada poço da placa de 24 poços. </li><li> Retirar as placas de 6 poços de incubadora, blot o fundo das inserções em um mata-borrão, e transferi-los para a placa de 24 poços de pré-preenchido com MTT. </li><li> Coloque a placa de 24 poços na incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% RH) e incubar por 3 horas ± 5 min. Estritamente as 3 horas o tempo de incubação ± 5 min para evitar o desvio entre as leituras MTT diferentes. </li><li> Quando a incubação MTT está completa, use uma bomba de sucção para aspirar cuidadosamente o meio MTT de todos os poços. </li><li> Recarga dos poços com DPBS e aspirar novamente. Repita esta lavagem mais duas vezes e certifique-se que os tecidos estão secos após a aspiração passado. </li><li> Após a transferência lava as pastilhas a uma placa de 24 poços novos. Mergulhe as pastilhas com cuidado pipetando 2 mL de solução extrator (Isopropanol) em cada inserção. O nível vai subir acima das bordas superiores da inserção, assim, completamente submergindo os tecidos. </li><li> Selar a placa de 24 poços (por exemplo, com Parafilm ou usando saco de vedação) para inibir a evaporação extrator. Extraia o MTT dos tecidos, pelo menos, duas horas à temperatura ambiente com agitação suave em um shaker placa (~ rpm 120). Extração sem agitação durante a noite também pode ser usado. </li><li> Após o período de extração é completa, furar as inserções com uma agulha de injeção ou o bulbo de contas pipeta Pasteur e permitir que o extrato a correr para o bem de que a inserção foi tirada. </li><li> Descartar a inserir perfurado e pipetar a solução no poço de cima para baixo três vezes até que esteja homogêneo. </li><li> Para cada tecido, de transferência de duas alíquotas 200 mL da solução de formazan púrpura em uma placa de 96 poços de fundo plano de microtitulação. Transferir as duplicatas de acordo com o projeto placa fixa dada na planilha que acompanha este protocolo de vídeo. Para espaços em branco, use isopropanol. </li><li> Ler a densidade óptica (DO) dos extratos em espectrofotômetro MTT placa de 96 poços usando um comprimento de onda de 570 nm (540-580), sem um filtro de referência. </li><li> Inserir os resultados na planilha para cálculo automático dos resultados (Figura 1). </li><li> A substância em estudo é rotulado «irritante» (R38 ou GHS categoria 2) se a viabilidade dos tecidos por cento determinado pelo ensaio de MTT é &lt;50% em relação ao controle negativo. Nota: MTT é tóxico, portanto não se esqueça de usar luvas ao manusear. MTT e proteger a sua tãoluções da luz, já que MTT é sensível à luz. Use solução de MTT dentro de algumas horas após o preparo porque degrada com o tempo. </li></ol> V. Qualidade Assay Controles <ul><li> EpiDerm EPI-200-SIT Critérios de aceitação kit: Modelos in vitro RHE deve fornecer dados consistentes e de alta qualidade ao longo do tempo, não apenas durante o processo de validação (8). Diretrizes recomendadas para garantir a longo prazo reprodutibilidade do ensaio e do desempenho incluem "a caracterização completa de células ou tecidos, amostras de cada lote ... para o desempenho, e uso regular de controles e produtos químicos de referência para fornecer uma garantia de consistência de desempenho do ensaio" (9) . Além de critérios de aceitação do ensaio descrito a seguir, cada lote de produção de EpiDerm é o controle de qualidade testada pelo fabricante contra um produto químico de referência adicional (1% Triton X-100). O tempo de exposição necessário para reduzir a viabilidade do tecido a 50% (ET-50) de Triton X-100 é determinado. Para EpiDerm, média anual ET-50 valores têm variado de 5,9 horas para 7,5 horas. O lote a lote para tecidos CV controle negativo (ou seja, a variabilidade da viabilidade de base) foi em média menos de 7,5% por cada ano desde 1996. O valor de ET50 cada lote de produção deve cair dentro de 2 desvios padrão da média histórica Triton X-100 ET50 criada em 1996 (ou seja, ET-50 = 6,7 horas; Limite mínimo de aceitação = 4.8h; limite de aceitação superior = 8.7h), a fim para ser liberado para uso pelo fabricante. </li><li> EPI-200-SIT Ensaio de aceitação Critério 1: Controle Negativo: O OD absoluta do controlo negativo (NC) tecidos (tratados com DPBS estéril) na MTT-teste é um indicador da viabilidade dos tecidos obtidos no laboratório de testes após o envio e armazenamento de procedimentos e sob condições específicas de utilização. O ensaio atende ao critério de aceitação se o OD significa 570 dos tecidos NC é ≥ 1,0 e ≤ 2,5. </li><li> EPI-200-SIT Ensaio de aceitação Critério 2: Controle Positivo A solução a 5% SDS (em H 2 O) é usado como controle positivo (PC) e testado em simultâneo com os produtos químicos de teste. Significa simultâneos que o PC tem que ser testada em cada ensaio, mas não mais do que um PC é necessário por testes dia. Viabilidade do controlo positivo deve ser dentro do intervalo de confiança de 95% dos dados históricos. O ensaio satisfaz o critério da aceitação se a viabilidade média de tecidos PC expressos como% dos tecidos controle negativo é de 20%. </li><li> EPI-200-SIT Ensaio de aceitação Critério 3: Desvio Padrão (SD) A irritação cutânea é previsto a partir da viabilidade média determinada em 3 tecidos único e, portanto, a variabilidade de tecido réplicas deve ser aceitavelmente baixo. O ensaio atende ao critério de aceitação se o SD calculado a partir de viabilidades% cada tecido do 3 identicamente tratados replica é &lt;18%. </li></ul> Resultados representante <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Figura 1"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Figura 2"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Figura 3"> </div> Figura 1 Resultados obtidos para seis artigos de teste, NC e controle PC -. Parte da planilha para o cálculo automático dos resultados. Produtos químicos teste que reduziu a viabilidade do tecido abaixo de 50% referenciados NC são classificados como irritantes. O teste foi otimizado para fornecer resultados que são suficientemente longe da classificação de corte (50% de viabilidade), aumentando assim a robustez do ensaio. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Materiais </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Lista de Materiais">

<ol><li>Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li>
<li>Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li>
<li>Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Skin+Irritation+Test%3A+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation%3A+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li>
<li>Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).</li>
<li>United Nations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Globally+Harmonized+System+of+Classification+and+Labeling+of+Chemicals+%28GHS%29%22">Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS)</a>. , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).</li>
<li>ESAC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Statement+on+the+Scientific+Validity+of+In-Vitro+Tests+for+Skin+Irritation+Testing%22">Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing</a>. , ESAC. (2008).</li>
<li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Issues+and+answers%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li>
<li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Current+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li>
</ol>

Os autores são funcionários da corporação MatTek, que produz reagentes e ferramentas utilizados neste artigo.

Neste vídeo, temos demonstrado a EpiDerm teste de irritação da pele (EpiDerm SIT) desenvolvido e validado para testes in vitro irritação da pele de produtos químicos, incluindo ingredientes cosméticos e farmacêutica. Ao executar este método, é importante trabalhar em condições assépticas e seguir estritamente o protocolo validado, uma vez que desvio do protocolo podem causar resultados diferentes. Algumas modificações do ensaio são possíveis, no entanto, alterações ao protocolo deve ser discutido diretamente com os autores. A única limitação deste método é uma possível interferência da substância de ensaio com a extremidade MTT. Uma substância de cor ou uma que reduz diretamente MTT (e, assim, imita atividade desidrogenase da mitocôndria celular) pode interferir com o endpoint MTT. No entanto, essas substância são um problema somente se no momento do teste MTT (ou seja, 42 horas após a exposição à substância de teste) uma quantidade suficiente da substância de ensaio ainda estão presentes no (ou dentro) dos tecidos. No caso deste evento improvável, o (verdadeiro) redução MTT metabólica e da contribuição por um material de teste colorido ou (false) redução MTT direta pelo material de teste pode ser quantificado através de um procedimento descrito em detalhes no Procedimento de Operação Padrão fornecido pelo ensaio Mattek Corp

um in vitro teste de irritação da pele (sit), utilizando o epiderm reconstruído epidérmico humano model (rhe)

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

O teste EpiDerm Irritação da pele (EpiDerm SIT) foi desenvolvido<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; E validados<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Para<em&gt; In vitro</em&gt; Teste de irritação da pele de produtos químicos, incluindo ingredientes cosméticos e farmacêutica. O SIT EpiDerm utiliza o 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Reconstruída epidérmico humano (RHE) EpiDerm modelo. O procedimento descrito neste protocolo permite a discriminação entre os irritantes da categoria GHS 2 e não-irritantes<sup&gt; (6)</sup&gt;. O teste é realizado ao longo de um período de tempo 4 dias, consistindo de pré-incubação, 60 minutos de exposição, 42 horas pós-incubação eo ensaio de viabilidade MTT. Após o recebimento dos tecidos e pré-incubação durante a noite (Dia 0), os tecidos são topicamente expostos aos produtos químicos de teste (dia 1), que pode ser líquido, semi-sólidos, sólidos ou cera. Três tecidos são utilizados para cada substância em estudo, bem como para o controle positivo (5% aq. Solução SDS), e um controle negativo (DPBS). Exposição a produtos químicos tem a duração de 60 minutos, 35 min do que os tecidos são mantidos em uma incubadora a 37 ° C. As substâncias de ensaio são então removidos da superfície do tecido por um procedimento de lavagem extensiva. As inserções de tecidos são apagados e transferidos para meio fresco. Após um período de incubação 24 h (dia 2), o meio é trocado. O meio pode ser guardado para posterior análise de citocinas ou outros parâmetros de interesse. Após a troca de médio, os tecidos são incubados por um período adicional de 18 horas. No final da 42h inteira de pós-incubação (dia 3), os tecidos são transferidos para solução de MTT amarelo e incubadas por 3 horas. A resultante azul-púrpura sal formazan, formada principalmente pelo metabolismo mitocondrial, é extraído por 2 horas usando isopropanol. A densidade óptica do formazan extraído é determinado usando um espectrofotômetro. Um produto químico é classificado como um irritante se a viabilidade dos tecidos em relação ao controle negativo tecidos tratados é reduzida abaixo de 50%. Este procedimento pode ser usado como substituto completo do teste in vivo irritação de pele de coelho para identificação de perigos e rotulagem de produtos químicos, de acordo com os regulamentos da UE<sup&gt; (7)</sup&gt;.

Neste vídeo, demonstramos a EpiDerm teste de irritação da pele (EpiDerm SIT) desenvolvido e validado para<em&gt; In vitro</em&gt; Teste de irritação da pele de produtos químicos, incluindo ingredientes cosméticos e farmacêutica.

Um In Vitro Teste de Irritação da pele (SIT), utilizando o EpiDerm Reconstruído epidérmico humano Model (RHE)

O teste de irritação cutânea EpiDerm (EpiDerm SIT) foi desenvolvido (1,2,3) e validado (4,5) para a testagem in vitro de irritação cutânea de substâncias químicas, incluindo...

Epiderm é um modelo reconstruído in vitro da epiderme humana derivado de células humanas normais, desenvolvido pela Matt Tech Corporation. O protocolo validado de teste de irritação cutânea EC VM com Epiderm substitui os testes tradicionais baseados em animais para produtos como cosméticos, matérias-primas e agentes industriais que entrarão em contato com a pele humana. Este teste começa no dia zero, quando o kit de irritação cutânea e o tecido Epiderm chegam ao laboratório e são submetidos posteriormente à pré-condicionamento em meio de ensaio após uma incubação noturna.No primeiro dia, a superfície atípica do tecido epidérmico é exposta por uma hora a um composto irritante putativo e, em seguida, o irritante é removido com uma etapa de lavagem no segundo dia. Após uma incubação de 24 horas, o inserto de cultura é colocado em meio fresco e o meio antigo pode ser usado para análise de citocinas e quimiocinas liberadas. O tecido é tratado com um composto conhecido como MTT, que é convertido pela redutase mitocondrial em um formazão sal de cor roxa-escura.Fornecendo uma leitura da viabilidade celular. A ausência de cor roxa escura na amostra é um indicador de viabilidade reduzida. E quando a leitura colorimétrica de um composto em teste for inferior a 50% dos controles negativos, o composto em teste pode ser classificado como um irritante.Olá, sou Helena Kava da Matt Corporation. Hoje vamos mostrar a vocês o procedimento para testes de irritação cutânea in vitro utilizando o modelo de pele humana reconstruída epiderm. Este procedimento, dependendo dos requisitos regulatórios, pode ser usado como substituição total ou parcial do teste de irritação cutânea rápida in vivo.Este novo procedimento in vitro pode ser utilizado para identificação de riscos e rotulagem de produtos químicos e matérias-primas cosméticas. Então, vamos começar. O Epiderm é derivado de cultura de queratinócitos epidérmicos humanos para formar um modelo tridimensional, multicamadas e altamente diferenciado da epiderme humana.Os tecidos são metabolicamente e mitoticamente ativos, imitam de perto seus equivalentes in vivo tanto estrutural quanto bioquimicamente, e o fazem com reprodutibilidade garantida, assim como a epiderme humana. O epiderme é composto por camadas basais, espinhosas e granulosas organizadas e por um estrato córneo multicamadas. Esta última camada contém camadas lipídicas lamelares intercelulares de Miller dispostas em padrões análogos aos encontrados in vivo.Esses tecidos são cultivados em meio livre de soro. Cada tecido é cultivado em um inserto de cultura celular individual. Outras configurações estão disponíveis, incluindo um formato de alto rendimento com 96 poços.A produção do tecido leva aproximadamente três semanas para ser concluída. Em um ponto específico deste processo, o tecido é elevado até a interface ar-líquido e todo o líquido é removido da superfície APIC do tecido. Os tecidos são alimentados apenas pela superfície basolateral, que permanece em contato com o meio de cultura proprietário da mat tech. Um kit Epiderm típico contém 24 tecidos, cada um com nove milímetros de diâmetro, em seu próprio inserto de cultura tecidual, além de meio de ensaio suficiente para realizar este teste de irritação cutânea.Os 24 inserts são firmemente acomodados em gel de AGA rosa infundido com meio, com um tecido em cada poço de uma placa padrão de 24 poços. O envio é realizado por transportadora expressa a uma temperatura de três a quatro graus centígrados antes do início dos testes com substâncias químicas. Utilizando o sistema de teste EPIDERM, prepare e esterilize todos os instrumentos e ferramentas utilizados no ensaio conforme descrito no protocolo escrito. Parte dos materiais, como cotonetes, deve vir em embalagem estéril ou ser autoclavada.O etanol a 70% deve ser usado para esterilizar instrumentos como pinças, e a irradiação UV ou gama deve ser usada para esterilizar as garrafas de lavagem. Duas soluções críticas utilizadas no ensaio devem ser previamente preparadas: DPBS e uma solução de SDS a 5%. Em água destilada, aproximadamente dois litros de DPBS estéril com pH sete serão usados no ensaio, com um kit contendo 24 tecidos de epiderme.O DPBS estéril atua como controle negativo, bem como solução de lavagem. O SDS a 5% deve ser preparado e usado como controle positivo. O ensaio de irritação cutânea inicia-se após o recebimento do kit EPIDERM EPI 200 SIT.Certifique-se de verificar a integridade de todos os componentes do kit e entre em contato imediatamente com a corporação Mat Tech caso haja alguma preocupação; se tudo estiver presente, prossiga para a próxima etapa. Para iniciar o teste, deixe o meio de ensaio fornecido com o kit atingir a temperatura ambiente. Não pré-aqueça na câmara de fluxo laminar.Prepare uma placa estéril de seis poços para cada três inserts de tecido epidérmico e pipete 0,9 mililitros do meio de ensaio em cada poço sob condições estéreis. Abra o saco plástico que contém a placa de 24 poços com os tecidos epidérmicos sob fluxo de ar estéril. Remova a gaze estéril e use pinças estéreis para retirar cuidadosamente cada insert contendo o tecido epidérmico.Remova qualquer aros remanescente que adere às faces externas do inserto por meio de uma leve pressão sobre gaze estéril ou papel de filtro. Em seguida, coloque os tecidos em uma placa estéril de 24 poços vazia nos próximos cinco minutos. Inspecione visualmente os insertos.Registre quaisquer defeitos no tecido e excesso de umidade na superfície. Não utilize tecidos defeituosos ou tecidos completamente cobertos por líquido.Implantes teciduais ideais. Devem apresentar uma superfície seca e estar livres de descolamentos, partes irregulares ou excesso de líquido na superfície. Em seguida, utilizando um cotonete estéril, seque cuidadosamente a superfície dos tecidos.Tente não tocar diretamente no tecido. Os efeitos capilares são suficientes para remover a umidade da superfície após a secagem. Transfira três tecidos para a linha superior de cada seis.Placa de poços pré-preenchida com 0,9 mililitro de meio de ensaio. Libere quaisquer bolhas de ar aprisionadas sob os insertos. Em seguida, coloque as placas de seis poços contendo os insertos no incubador por uma hora.Pré-incubação a 37 graus Celsius. Ao final do primeiro período de pré-incubação, transfira os insertos dos poços superiores para os poços inferiores da placa de seis poços. Coloque as placas de volta no incubador para uma pré-incubação noturna.Coloque o restante do meio do ensaio na geladeira. Após a pré-incubação noturna, os produtos químicos de teste podem ser aplicados aos insertos de tecido epidérmico. Antes de iniciar o ensaio de exposição aos produtos químicos, coloque todos os dispositivos, soluções e produtos químicos de teste necessários em temperatura ambiente.No capela estéril, limpe todos os frascos de materiais não estéreis com etanol 70% antes de colocá-los dentro da capela. O controle negativo DPBS estéril, o controle positivo 5% SDS e a água destilada devem ser colocados na capela e mantidos em temperatura ambiente também. Um frasco grande deve ser reservado para resíduos.Prepare uma placa de seis poços para cada produto químico, preenchendo apenas a fileira superior com 0,9 mililitros de meio de ensaio por poço. Rotule cada placa com o número do tecido e o nome do produto químico.Aproximadamente cinco minutos antes da exposição planejada aos produtos químicos, remova as placas de seis poços contendo os tecidos pré-condicionados do incubador. Em seguida, avalie visualmente a superfície dos tecidos.Remova qualquer umidade usando pontas de algodão estéreis e não pressione a superfície do tecido. Por fim, identifique as tampas da placa de seis poços com os códigos ou nomes dos materiais testados. Não teste mais de seis substâncias químicas, incluindo controles negativo e positivo, cada um em triplicata, em uma única execução do teste.Utilize uma aplicação química e intervalo de lavagem de um minuto para manipular substâncias-teste conhecidas. Siga as instruções fornecidas na ficha de dados de segurança do material ou FDS para amostras codificadas ou desconhecidas. Siga as diretrizes de segurança química e utilize um armário ventilado.Use luvas e proteja os olhos e o rosto. Aplique os tecidos com os produtos químicos a intervalos de um minuto para facilitar a lavagem dos produtos químicos de teste após a exposição; mantenha as placas com os tecidos sob dose na cabine de fluxo laminar até que o último tecido seja dosado. Uma pipeta com ponta bulbosa será usada ao longo do procedimento para manipular o tecido e os compostos de teste. A chama de um bico de Bunsen pode ser utilizada para moldar a ponta bulbosa ao testar produtos químicos líquidos.Dispense 30 microlitros do artigo de teste líquido diretamente sobre o tecido e inicie imediatamente o cronômetro para que ele conte o tempo decorrido. Coloque a malha de náilon sobre a superfície do tecido. Quando o cronômetro atingir um minuto, adicione o segundo composto líquido. Utilize três tecidos por produto químico testado, lembrando-se de adicionar cada composto em intervalos de um minuto.Para testar semissólidos, utilize uma pipeta de deslocamento positivo para dispensar 30 microlitros diretamente sobre o tecido. Se necessário, espalhe o produto químico com uma pipeta Pasteur para corresponder ao tamanho do tecido. Pouco antes da aplicação da substância sólida, umedeça a superfície do tecido com 25 microlitros de DPBS estéril para melhorar o contato entre a superfície do tecido e o produto químico em teste; encha uma colher de aplicação afiada de 25 miligramas com o material de teste finamente moído.Aplicar o produto químico de teste sólido na superfície do tecido. Se necessário, usar uma pipeta com ponta estéril para esvaziar completamente a colher. Agitar suavemente os suportes para melhorar a distribuição do sólido sobre a superfície.Você também pode usar a ponta em forma de bulbo da sua pipeta para ajustar ao tamanho do tecido. Não pressione a superfície do tecido. Por fim, aplique DPBS como controle negativo e SDS a 5% como controle positivo aos insertos de tecido, também em triplicata, após a aplicação no último tecido, e transfira todas as placas para o incubador úmido a 37 graus Celsius por 35 mais ou menos um minuto.Durante esta incubação, certifique-se de colocar todos os materiais necessários para as etapas de lavagem na câmara de fluxo laminar. Após a incubação de 35 minutos, remova todas as placas do incubador. Coloque-as na câmara estéril e aguarde um período de 60 minutos para que a exposição química seja concluída para o tecido da primeira dose.Em seguida, inicie o procedimento de lavagem. Enxágue os tecidos com DPBS estéril 15 vezes. Para remover qualquer resíduo do material em teste, preencha o inserto do tecido utilizando um fluxo contínuo de DPBS fornecido a 1,5 centímetro de distância da superfície do tecido e esvazie-o.Certifique-se de que o fluxo de DPBS não seja fraco demais, pois a substância de teste não será removida. Lembre-se de manter o intervalo de tempo de um minuto para lavar quatro tecidos com uma malha de náilon cinco vezes e remover cuidadosamente a malha com pinça pontiaguda. Em seguida, prossiga com as 10 lavagens restantes após a 15ª, enxaguando com a garrafa de lavagem completamente submersa o inserto três vezes com 150 mililitros de DPBS e agitando para remover o restante do material de teste.Por fim, lave o tecido. Insira uma vez por dentro e outra vez por fora com DPBS estéril. Remova qualquer excesso de DPBS do tecido agitando suavemente o inserto e secando-o em papel filtro estéril.Em seguida, transfira os insertos de tecido manchados para a nova placa de seis poços previamente preenchida com meio de ensaio. Lembre-se novamente de que todas essas etapas devem ser realizadas dentro do intervalo de um minuto para manter o tempo de exposição de 60 minutos para cada amostra exposta. Após a lavagem do último tecido, seque cuidadosamente a superfície de cada tecido com um cotonete estéril com ponta de algodão.Se houver vestígios da substância química ainda presentes na superfície, tente removê-los utilizando o cotonete estéril. Por fim, incube os tecidos na incubadora pelas próximas 24 horas. Registre o horário de início da incubação na ficha de documentação dos métodos.Registre também todas as diferentes aplicações na ficha de documentação do método. Anexe ao procedimento operacional padrão fornecido pela Mat Tech Corporation o movimento das placas na cabine de segurança. Transfira o inserto para a parte inferior da placa de seis poços previamente preenchida com 0,9 mililitro de meio.Colete o meio da fileira superior e transfira para uma placa de 24 poços previamente rotulada, a qual é então colocada a menos 20 graus Celsius. Até a análise, a análise de citocinas e/ou quimiocinas liberadas no meio de cultura é uma etapa opcional. Prossiga com a incubação por mais 18 horas, mais ou menos três horas, para o ensaio de MTT; rotule 2 placas de 24 poços com os nomes químicos ou códigos.Lembre-se de que o MTT é tóxico, portanto, use luvas de proteção ao manipulá-lo. Prepare a solução de MTT descongelando o concentrado de MTT e diluindo-o com o diluente para MTT.Proteja da luz, pois o MTT é sensível à luz, e utilize dentro de duas a três horas. Como o MTT se degrada ao longo do tempo, pipete 300 microlitros do meio com MTT em cada poço da placa de 24 poços. Agora, remova as placas de 6 poços do incubador.Enxugue a parte inferior dos inserts em papel absorvente e transfira-os para a placa de 24 poços previamente preenchida com MTT. Coloque a placa de 24 poços no incubador e incube por três horas. Não se esqueça de registrar o horário de início da incubação com MTT no MDS; siga rigorosamente o tempo de incubação de três horas para evitar obter leituras diferentes de MTT. Quando a incubação com MTT for concluída, use uma bomba de sucção com um coletor de resíduos tóxicos para aspirar suavemente o meio de MTT de todos os poços.Reencha as cavidades com DPBS e aspire. Repita esse procedimento de lavagem mais duas vezes e certifique-se de que os tecidos estejam secos após a última aspiração. Após as lavagens, transfira os insertos para uma nova placa de 24 poços e imerja os insertos pipetando suavemente dois mililitros da solução extratora em cada inserto.O nível subirá acima das bordas superiores do inserto, cobrindo completamente os tecidos por ambos os lados. Selle a placa de 24 poços usando um selador térmico ou parafina para inibir a evaporação do extrato. Registre o horário de início da extração na ficha de documentação de métodos e realize a extração por pelo menos duas horas à temperatura ambiente, com agitação suave em um agitador de placas. Após o período de extração, perfure os insertos com uma agulha de injeção ou com a ponta de bulbo da sua pipeta e permita que o extrato escorra para o poço de onde o inserto foi retirado.Descarte os inserts perfurados e pipete a solução no poço para cima e para baixo três vezes até que fique homogênea. Um agitador de placas ajustado a 120 rpm também pode ser usado para cada tecido. Transfira duas alíquotas de 200 microlitros da solução azul de formazana para uma placa de microtitulação de fundo plano com 96 poços.Transfira as duplicatas de acordo com o desenho fixo da placa fornecido na planilha que acompanha este protocolo em vídeo para as amostras branco. Utilize isopropanol, leia a densidade óptica ou DO em um espectrofotômetro para placa de 96 poços utilizando um comprimento de onda de 570 nanômetros, sem utilizar filtro de referência. Insira os resultados na planilha para o cálculo automático dos valores.Considere correções devido à interferência do produto químico em teste conforme descrito no protocolo complementar; um produto químico em teste é classificado como irritante. Se a viabilidade tecidual em porcentagem for igual ou inferior a 50% após análise espectrofotométrica, a OD570 dos tecidos do controle negativo (NC) for maior ou igual a um e menor ou igual a 2,5, e a viabilidade média dos tecidos do controle positivo (PC), expressa como porcentagem dos tecidos controle negativo, for inferior a 20%, e o desvio padrão (SD) calculado a partir das viabilidades teciduais percentuais individuais de três replicatas tratadas de forma idêntica for inferior a 18%, compostos que apresentem valores de viabilidade celular inferiores a 50% podem ser considerados irritantes.Acabamos de mostrar como realizar o teste validado de irritação cutânea de 60 minutos e 42 horas com o modelo de pele humana reconstruída Epiderm. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a maior parte do teste é realizada em condições estéreis ou assépticas. Se houver necessidade de alguma modificação do método ou se você precisar de uma explicação mais detalhada sobre qualquer etapa do procedimento, não hesite em nos contatar para obter ajuda e orientação.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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