Um In Vitro Teste de Irritação da pele (SIT), utilizando o EpiDerm Reconstruído epidérmico humano Model (RHE)

Epiderm é um modelo reconstruído in vitro da epiderme humana derivado de células humanas normais, desenvolvido pela Matt Tech Corporation. O protocolo validado de teste de irritação cutânea EC VM com Epiderm substitui os testes tradicionais baseados em animais para produtos como cosméticos, matérias-primas e agentes industriais que entrarão em contato com a pele humana. Este teste começa no dia zero, quando o kit de irritação cutânea e o tecido Epiderm chegam ao laboratório e são submetidos posteriormente à pré-condicionamento em meio de ensaio após uma incubação noturna.

No primeiro dia, a superfície atípica do tecido epidérmico é exposta por uma hora a um composto irritante putativo e, em seguida, o irritante é removido com uma etapa de lavagem no segundo dia. Após uma incubação de 24 horas, o inserto de cultura é colocado em meio fresco e o meio antigo pode ser usado para análise de citocinas e quimiocinas liberadas. O tecido é tratado com um composto conhecido como MTT, que é convertido pela redutase mitocondrial em um formazão sal de cor roxa-escura.

Fornecendo uma leitura da viabilidade celular. A ausência de cor roxa escura na amostra é um indicador de viabilidade reduzida. E quando a leitura colorimétrica de um composto em teste for inferior a 50% dos controles negativos, o composto em teste pode ser classificado como um irritante.

Olá, sou Helena Kava da Matt Corporation. Hoje vamos mostrar a vocês o procedimento para testes de irritação cutânea in vitro utilizando o modelo de pele humana reconstruída epiderm. Este procedimento, dependendo dos requisitos regulatórios, pode ser usado como substituição total ou parcial do teste de irritação cutânea rápida in vivo.

Este novo procedimento in vitro pode ser utilizado para identificação de riscos e rotulagem de produtos químicos e matérias-primas cosméticas. Então, vamos começar. O Epiderm é derivado de cultura de queratinócitos epidérmicos humanos para formar um modelo tridimensional, multicamadas e altamente diferenciado da epiderme humana.

Os tecidos são metabolicamente e mitoticamente ativos, imitam de perto seus equivalentes in vivo tanto estrutural quanto bioquimicamente, e o fazem com reprodutibilidade garantida, assim como a epiderme humana. O epiderme é composto por camadas basais, espinhosas e granulosas organizadas e por um estrato córneo multicamadas. Esta última camada contém camadas lipídicas lamelares intercelulares de Miller dispostas em padrões análogos aos encontrados in vivo.

Esses tecidos são cultivados em meio livre de soro. Cada tecido é cultivado em um inserto de cultura celular individual. Outras configurações estão disponíveis, incluindo um formato de alto rendimento com 96 poços.

A produção do tecido leva aproximadamente três semanas para ser concluída. Em um ponto específico deste processo, o tecido é elevado até a interface ar-líquido e todo o líquido é removido da superfície APIC do tecido. Os tecidos são alimentados apenas pela superfície basolateral, que permanece em contato com o meio de cultura proprietário da mat tech. Um kit Epiderm típico contém 24 tecidos, cada um com nove milímetros de diâmetro, em seu próprio inserto de cultura tecidual, além de meio de ensaio suficiente para realizar este teste de irritação cutânea.

Os 24 inserts são firmemente acomodados em gel de AGA rosa infundido com meio, com um tecido em cada poço de uma placa padrão de 24 poços. O envio é realizado por transportadora expressa a uma temperatura de três a quatro graus centígrados antes do início dos testes com substâncias químicas. Utilizando o sistema de teste EPIDERM, prepare e esterilize todos os instrumentos e ferramentas utilizados no ensaio conforme descrito no protocolo escrito. Parte dos materiais, como cotonetes, deve vir em embalagem estéril ou ser autoclavada.

O etanol a 70% deve ser usado para esterilizar instrumentos como pinças, e a irradiação UV ou gama deve ser usada para esterilizar as garrafas de lavagem. Duas soluções críticas utilizadas no ensaio devem ser previamente preparadas: DPBS e uma solução de SDS a 5%. Em água destilada, aproximadamente dois litros de DPBS estéril com pH sete serão usados no ensaio, com um kit contendo 24 tecidos de epiderme.

O DPBS estéril atua como controle negativo, bem como solução de lavagem. O SDS a 5% deve ser preparado e usado como controle positivo. O ensaio de irritação cutânea inicia-se após o recebimento do kit EPIDERM EPI 200 SIT.

Certifique-se de verificar a integridade de todos os componentes do kit e entre em contato imediatamente com a corporação Mat Tech caso haja alguma preocupação; se tudo estiver presente, prossiga para a próxima etapa. Para iniciar o teste, deixe o meio de ensaio fornecido com o kit atingir a temperatura ambiente. Não pré-aqueça na câmara de fluxo laminar.

Prepare uma placa estéril de seis poços para cada três inserts de tecido epidérmico e pipete 0,9 mililitros do meio de ensaio em cada poço sob condições estéreis. Abra o saco plástico que contém a placa de 24 poços com os tecidos epidérmicos sob fluxo de ar estéril. Remova a gaze estéril e use pinças estéreis para retirar cuidadosamente cada insert contendo o tecido epidérmico.

Remova qualquer aros remanescente que adere às faces externas do inserto por meio de uma leve pressão sobre gaze estéril ou papel de filtro. Em seguida, coloque os tecidos em uma placa estéril de 24 poços vazia nos próximos cinco minutos. Inspecione visualmente os insertos.

Registre quaisquer defeitos no tecido e excesso de umidade na superfície. Não utilize tecidos defeituosos ou tecidos completamente cobertos por líquido.

Implantes teciduais ideais. Devem apresentar uma superfície seca e estar livres de descolamentos, partes irregulares ou excesso de líquido na superfície. Em seguida, utilizando um cotonete estéril, seque cuidadosamente a superfície dos tecidos.

Tente não tocar diretamente no tecido. Os efeitos capilares são suficientes para remover a umidade da superfície após a secagem. Transfira três tecidos para a linha superior de cada seis.

Placa de poços pré-preenchida com 0,9 mililitro de meio de ensaio. Libere quaisquer bolhas de ar aprisionadas sob os insertos. Em seguida, coloque as placas de seis poços contendo os insertos no incubador por uma hora.

Pré-incubação a 37 graus Celsius. Ao final do primeiro período de pré-incubação, transfira os insertos dos poços superiores para os poços inferiores da placa de seis poços. Coloque as placas de volta no incubador para uma pré-incubação noturna.

Coloque o restante do meio do ensaio na geladeira. Após a pré-incubação noturna, os produtos químicos de teste podem ser aplicados aos insertos de tecido epidérmico. Antes de iniciar o ensaio de exposição aos produtos químicos, coloque todos os dispositivos, soluções e produtos químicos de teste necessários em temperatura ambiente.

No capela estéril, limpe todos os frascos de materiais não estéreis com etanol 70% antes de colocá-los dentro da capela. O controle negativo DPBS estéril, o controle positivo 5% SDS e a água destilada devem ser colocados na capela e mantidos em temperatura ambiente também. Um frasco grande deve ser reservado para resíduos.

Prepare uma placa de seis poços para cada produto químico, preenchendo apenas a fileira superior com 0,9 mililitros de meio de ensaio por poço. Rotule cada placa com o número do tecido e o nome do produto químico.

Aproximadamente cinco minutos antes da exposição planejada aos produtos químicos, remova as placas de seis poços contendo os tecidos pré-condicionados do incubador. Em seguida, avalie visualmente a superfície dos tecidos.

Remova qualquer umidade usando pontas de algodão estéreis e não pressione a superfície do tecido. Por fim, identifique as tampas da placa de seis poços com os códigos ou nomes dos materiais testados. Não teste mais de seis substâncias químicas, incluindo controles negativo e positivo, cada um em triplicata, em uma única execução do teste.

Utilize uma aplicação química e intervalo de lavagem de um minuto para manipular substâncias-teste conhecidas. Siga as instruções fornecidas na ficha de dados de segurança do material ou FDS para amostras codificadas ou desconhecidas. Siga as diretrizes de segurança química e utilize um armário ventilado.

Use luvas e proteja os olhos e o rosto. Aplique os tecidos com os produtos químicos a intervalos de um minuto para facilitar a lavagem dos produtos químicos de teste após a exposição; mantenha as placas com os tecidos sob dose na cabine de fluxo laminar até que o último tecido seja dosado. Uma pipeta com ponta bulbosa será usada ao longo do procedimento para manipular o tecido e os compostos de teste. A chama de um bico de Bunsen pode ser utilizada para moldar a ponta bulbosa ao testar produtos químicos líquidos.

Dispense 30 microlitros do artigo de teste líquido diretamente sobre o tecido e inicie imediatamente o cronômetro para que ele conte o tempo decorrido. Coloque a malha de náilon sobre a superfície do tecido. Quando o cronômetro atingir um minuto, adicione o segundo composto líquido. Utilize três tecidos por produto químico testado, lembrando-se de adicionar cada composto em intervalos de um minuto.

Para testar semissólidos, utilize uma pipeta de deslocamento positivo para dispensar 30 microlitros diretamente sobre o tecido. Se necessário, espalhe o produto químico com uma pipeta Pasteur para corresponder ao tamanho do tecido. Pouco antes da aplicação da substância sólida, umedeça a superfície do tecido com 25 microlitros de DPBS estéril para melhorar o contato entre a superfície do tecido e o produto químico em teste; encha uma colher de aplicação afiada de 25 miligramas com o material de teste finamente moído.

Aplicar o produto químico de teste sólido na superfície do tecido. Se necessário, usar uma pipeta com ponta estéril para esvaziar completamente a colher. Agitar suavemente os suportes para melhorar a distribuição do sólido sobre a superfície.

Você também pode usar a ponta em forma de bulbo da sua pipeta para ajustar ao tamanho do tecido. Não pressione a superfície do tecido. Por fim, aplique DPBS como controle negativo e SDS a 5% como controle positivo aos insertos de tecido, também em triplicata, após a aplicação no último tecido, e transfira todas as placas para o incubador úmido a 37 graus Celsius por 35 mais ou menos um minuto.

Durante esta incubação, certifique-se de colocar todos os materiais necessários para as etapas de lavagem na câmara de fluxo laminar. Após a incubação de 35 minutos, remova todas as placas do incubador. Coloque-as na câmara estéril e aguarde um período de 60 minutos para que a exposição química seja concluída para o tecido da primeira dose.

Em seguida, inicie o procedimento de lavagem. Enxágue os tecidos com DPBS estéril 15 vezes. Para remover qualquer resíduo do material em teste, preencha o inserto do tecido utilizando um fluxo contínuo de DPBS fornecido a 1,5 centímetro de distância da superfície do tecido e esvazie-o.

Certifique-se de que o fluxo de DPBS não seja fraco demais, pois a substância de teste não será removida. Lembre-se de manter o intervalo de tempo de um minuto para lavar quatro tecidos com uma malha de náilon cinco vezes e remover cuidadosamente a malha com pinça pontiaguda. Em seguida, prossiga com as 10 lavagens restantes após a 15ª, enxaguando com a garrafa de lavagem completamente submersa o inserto três vezes com 150 mililitros de DPBS e agitando para remover o restante do material de teste.

Por fim, lave o tecido. Insira uma vez por dentro e outra vez por fora com DPBS estéril. Remova qualquer excesso de DPBS do tecido agitando suavemente o inserto e secando-o em papel filtro estéril.

Em seguida, transfira os insertos de tecido manchados para a nova placa de seis poços previamente preenchida com meio de ensaio. Lembre-se novamente de que todas essas etapas devem ser realizadas dentro do intervalo de um minuto para manter o tempo de exposição de 60 minutos para cada amostra exposta. Após a lavagem do último tecido, seque cuidadosamente a superfície de cada tecido com um cotonete estéril com ponta de algodão.

Se houver vestígios da substância química ainda presentes na superfície, tente removê-los utilizando o cotonete estéril. Por fim, incube os tecidos na incubadora pelas próximas 24 horas. Registre o horário de início da incubação na ficha de documentação dos métodos.

Registre também todas as diferentes aplicações na ficha de documentação do método. Anexe ao procedimento operacional padrão fornecido pela Mat Tech Corporation o movimento das placas na cabine de segurança. Transfira o inserto para a parte inferior da placa de seis poços previamente preenchida com 0,9 mililitro de meio.

Colete o meio da fileira superior e transfira para uma placa de 24 poços previamente rotulada, a qual é então colocada a menos 20 graus Celsius. Até a análise, a análise de citocinas e/ou quimiocinas liberadas no meio de cultura é uma etapa opcional. Prossiga com a incubação por mais 18 horas, mais ou menos três horas, para o ensaio de MTT; rotule 2 placas de 24 poços com os nomes químicos ou códigos.

Lembre-se de que o MTT é tóxico, portanto, use luvas de proteção ao manipulá-lo. Prepare a solução de MTT descongelando o concentrado de MTT e diluindo-o com o diluente para MTT.

Proteja da luz, pois o MTT é sensível à luz, e utilize dentro de duas a três horas. Como o MTT se degrada ao longo do tempo, pipete 300 microlitros do meio com MTT em cada poço da placa de 24 poços. Agora, remova as placas de 6 poços do incubador.

Enxugue a parte inferior dos inserts em papel absorvente e transfira-os para a placa de 24 poços previamente preenchida com MTT. Coloque a placa de 24 poços no incubador e incube por três horas. Não se esqueça de registrar o horário de início da incubação com MTT no MDS; siga rigorosamente o tempo de incubação de três horas para evitar obter leituras diferentes de MTT. Quando a incubação com MTT for concluída, use uma bomba de sucção com um coletor de resíduos tóxicos para aspirar suavemente o meio de MTT de todos os poços.

Reencha as cavidades com DPBS e aspire. Repita esse procedimento de lavagem mais duas vezes e certifique-se de que os tecidos estejam secos após a última aspiração. Após as lavagens, transfira os insertos para uma nova placa de 24 poços e imerja os insertos pipetando suavemente dois mililitros da solução extratora em cada inserto.

O nível subirá acima das bordas superiores do inserto, cobrindo completamente os tecidos por ambos os lados. Selle a placa de 24 poços usando um selador térmico ou parafina para inibir a evaporação do extrato. Registre o horário de início da extração na ficha de documentação de métodos e realize a extração por pelo menos duas horas à temperatura ambiente, com agitação suave em um agitador de placas. Após o período de extração, perfure os insertos com uma agulha de injeção ou com a ponta de bulbo da sua pipeta e permita que o extrato escorra para o poço de onde o inserto foi retirado.

Descarte os inserts perfurados e pipete a solução no poço para cima e para baixo três vezes até que fique homogênea. Um agitador de placas ajustado a 120 rpm também pode ser usado para cada tecido. Transfira duas alíquotas de 200 microlitros da solução azul de formazana para uma placa de microtitulação de fundo plano com 96 poços.

Transfira as duplicatas de acordo com o desenho fixo da placa fornecido na planilha que acompanha este protocolo em vídeo para as amostras branco. Utilize isopropanol, leia a densidade óptica ou DO em um espectrofotômetro para placa de 96 poços utilizando um comprimento de onda de 570 nanômetros, sem utilizar filtro de referência. Insira os resultados na planilha para o cálculo automático dos valores.

Considere correções devido à interferência do produto químico em teste conforme descrito no protocolo complementar; um produto químico em teste é classificado como irritante. Se a viabilidade tecidual em porcentagem for igual ou inferior a 50% após análise espectrofotométrica, a OD570 dos tecidos do controle negativo (NC) for maior ou igual a um e menor ou igual a 2,5, e a viabilidade média dos tecidos do controle positivo (PC), expressa como porcentagem dos tecidos controle negativo, for inferior a 20%, e o desvio padrão (SD) calculado a partir das viabilidades teciduais percentuais individuais de três replicatas tratadas de forma idêntica for inferior a 18%, compostos que apresentem valores de viabilidade celular inferiores a 50% podem ser considerados irritantes.

Acabamos de mostrar como realizar o teste validado de irritação cutânea de 60 minutos e 42 horas com o modelo de pele humana reconstruída Epiderm. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a maior parte do teste é realizada em condições estéreis ou assépticas. Se houver necessidade de alguma modificação do método ou se você precisar de uma explicação mais detalhada sobre qualquer etapa do procedimento, não hesite em nos contatar para obter ajuda e orientação.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.