Name: Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: Aprenda o protocolo de hibridização in situ por fluorescência (FISH) para análise de espermatozoides humanos. Este método permite rastrear aneuploidias cromossômicas em homens inférteis, auxiliando no diagnóstico clínico reprodutivo.

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Este trabalho foi financiado pela Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Os autores agradecem a J. Blanco e F. Vidal para a sua supervisão e encorajamento, e Lucas J. para a sua assistência técnica.

I. O processamento da amostra e fixação de células <ol><li> Deixe a amostra de sêmen em recipientes esterilizados em temperatura ambiente por 20 minutos até que a liquefação. </li><li> Transferir a amostra para um tubo de centrífuga e girá-lo em 1000g por 5 minutos. </li><li> Remova cuidadosamente e desprezar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur. </li><li> Adicionar solução hipotônica (KCl, 0.075M) pré-aquecido a 37 ° C, gota a gota, ao misturar em um vortex para obter um volume final de 10 ml. </li><li> Colocar o tubo em banho-maria a 37 ° C por 30 minutos. </li><li> Centrifugar a 1000g por 5 minutos. Cuidadosamente desprezar o sobrenadante por decantação, sem perturbar o sedimento. </li><li> Depois de ressuspender o sedimento, adicionar preparados na hora de Carnoy (metanol 03:01: ácido acético) fixador gota a gota, ao misturar em um vortex para obter um volume final de 8 ml. </li><li> Repetir os pontos 6 e 7 quantas vezes forem necessárias para obter um pó branco. </li><li> Adicionar metanol preparados na hora: ácido acético (3:1), gota a gota para ajustar o volume final para a concentração celular exigidos para a obtenção de células boa divulgação (nos casos com uma bola pequena, algumas gotas serão suficientes enquanto amostras com uma quantidade elevada de espermatozóides recuperados, o volume final pode chegar a 1-2 ml). A lâmina pode ser feita por deixar cair a amostra ressuspenso em um slide ungreased e examiná-la sob um microscópio de contraste de fase. Isso permitirá verificar a dispersão de celulares obtidos e permitirá corrigi-lo, se for necessário, em slides adicionais. </li><li> Para fazer com que as extensões, queda de uma altura mínima de 40 cm duas ou três gotas de suspensão de células para o centro de slides unfrosted (anteriormente armazenados em metanol a -20 ° C para as desengordurar). Para possibilitar a localização da amostra durante todo o protocolo, marque a área que contém a extensão de esperma no lado oposto da lâmina utilizando um lápis de diamante. </li><li> Armazenar os slides a -20 ° C durante pelo menos 24 horas. Nota: A adição de metanol: ácido acético (3:1), gota a gota enquanto mistura é um passo muito importante para evitar a formação de agregados de esperma. </li></ol> II. Descondensação <ol><li> As lâminas armazenadas a -20 ° C devem ser descongelados para continuar com o protocolo (deixá-los em temperatura ambiente). </li><li> Coloque o slide em dois frascos coplin consecutivos com solução de citrato de sódio 2x solução salina (2xSSC) por 3 minutos cada. </li><li> Transferir as lâminas através de uma série de lavagens de etanol durante 2 minutos em cada frasco coplin. Comece com etanol 70%, seguido de 90% e terminar com 100%. Secar a lâmina, deixando-o em temperatura ambiente. </li><li> Incubar as lâminas em solução ditiotreitol (1,4-ditiotreitol 5mM, Triton 1% X-100, 2-Amino-2-(hidroximetil) -1,3-propanodiol 50mm) a 37 ° C na incubadora para decondense a cromatina. Este produto age quebrando as pontes de dissulfeto do protaminas que bobina o DNA no núcleo espermatozóides. Este é um passo muito importante porque o DNA no núcleo de esperma é altamente compactado. O tempo de incubação das lâminas em solução ditiotreitol (TDT) devem ser ajustados de acordo com a reatividade da amostra para este produto. Normalmente, este tempo é de cerca de 8 minutos, embora possa variar de 2 a 15 minutos. </li><li> Imediatamente, transferir o slide para dois potes consecutivos coplin com 2xSSC por 3 minutos em cada coplin. </li><li> Continue colocando a lâmina através de uma série de lavagens de etanol durante 2 minutos em cada frasco coplin (70%, 90% e 100% de etanol). Deixe o slide para secar a temperatura ambiente. Nota: A exposição excessiva à TDT resultaria em dispersar os sinais de FISH no final do procedimento, enquanto que uma exposição muito curto resultaria em uma falta de alguns sinais. </li></ol> III. Hibridização <ol><li> Desnaturar o DNA do esperma, incubando o slide em um frasco com solução de formamida coplin (70% Formamide/2xSSC) a 73 ° C por 5 minutos. </li><li> Transferir as lâminas através de soluções de etanol para 1 minuto por coplin jar (começar com etanol 70%, 85% e terminar com 100%). Deixe o slide para secar a temperatura ambiente. </li><li> Adicionar diretamente l 5 do correspondente ready-to-use a mistura para uma sonda lamínula 15x15 (Painel Probe Assay AneuVysion Multi-color: CEP 18/X/Y ou LSI 13/21). </li><li> Como é mostrado no vídeo, coloque cuidadosamente o slide sobre a lamínula para unir a região-alvo e da mistura da sonda. Selá-lo com cimento de borracha. </li><li> Coloque o slide em uma pré-aquecido 37 ° C câmara de hibridação (HYBrite ™) e incubar-lo a 37 ° C por 24/06 horas. Nota: Considerando que a desnaturação da amostra de esperma é obrigatória, a necessidade de desnaturação das sondas é determinado pelo fabricante. As misturas sondas utilizadas neste protocolo está pronto para usar e, neste caso, desnaturação da sonda não é necessária. O volume da mistura sonda irá variar de acordo com o tamanho da área hibridizada. </li></ol> IV. Lavagenspós-hibridização <ol><li> Retire a lâmina da câmara de hibridização. </li><li> Remover o cimento de borracha e com cuidado retire a lamínula de correr suavemente para o lado. </li><li> Para eliminar os sinais de hibridação inespecífica lugar do slide por 2 minutos em uma jarra com coplin 0.4xSSC/0.3% NP-40 pré-aquecido a 73 ° C em banho-maria. </li><li> Transferir as lâminas para uma solução 2xSSC/0.1% NP-40 lavar em temperatura ambiente por 1 minuto. Deixe o slide para secar a temperatura ambiente. </li><li> Adicionar um produto de contraste para a região de destino (8 l para uma lamínula 18x18). O produto mais utilizado é de 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.). </li><li> Como é mostrado no vídeo, cobrir a região hibridizada com uma lamínula (para preservar a hibridização da lamínula pode ser selada com verniz das unhas). </li><li> Loja slides hybridized a -20 ° C no escuro até a sua análise perspectiva. Sob essas condições os slides podem ser armazenadas por até 12 meses sem perda significativa da intensidade do sinal de fluorescência. Nota: A temperatura mais alta ou um tempo de lavagem excessiva pode resultar na eliminação de alguns sinais, enquanto o oposto não lavar a sonda hibridizações inespecíficas. O volume do produto adicionado contracoloração irá variar de acordo com o tamanho da área de hibridação para cobrir. </li></ol> Visualization V. As preparações podem ser avaliados sob um microscópio de epifluorescência equipado com um filtro de banda tripla para DAPI / Texas Red / FITC e única banda de filtros para Aqua, FITC e Red Texas. Critérios de avaliação padrão devem ser seguidas para a correta avaliação dos núcleos de esperma 1. A preparação hibridizado com sondas para os cromossomos X, Y e 18 devem mostrar sinais para estes três cromossomos. Todos os espermatozóides normais deve mostrar um sinal azul (correspondente ao cromossomo 18), e um sinal verde (X-rolamento espermatozóides) ou um sinal vermelho (Y-rolamento espermatozóides). Na preparação hibridizado com sondas para os cromossomos 13 e 21, um sinal verde para o cromossomo 13 e um sinal vermelho para o cromossomo 21 deve ser diferenciado em todos os espermatozóides normais.

<ol><li>Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+chromosome+21+disomy+in+human+spermatozoa+as+determined+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Este protocolo descreve como processar amostras de sêmen humano para a obtenção de preparações FISH esperma. Usando este protocolo, é possível analisar anormalidades cromossômicas em gametas masculinos. Espermatozóides triagem aneuploidia tem aplicações tanto no contexto da pesquisa básica e no aconselhamento reprodutivo dado a homens inférteis. Embora no diagnóstico clínico dos cromossomos mais estudados são X, Y, 13, 18 e 21, outras sondas comerciais para uma vasta gama de cromossomos e loci estão disponíveis e também...

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditiotreitol (DTT)</td><td>Material</td><td>Grupo Roche</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol</td><td>Material</td><td>Grupo Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Material</td><td>Merck &amp;& Cia., Inc.</td><td>100.063</td><td></td></tr><tr><td>AneuVysion&amp;#174; Kit Multicolor de Sonda de DNA&lt;ul style=&quot;preenchimento:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;20x Salina-Citrato de Sódio&lt;/li&gt;&lt;li&gt;4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI II)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sonda de DNA CEP 18/X/Y&lt;/li&gt;&lt;li&gt;NP-40&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sonda de DNA LSI 13/21&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>Material</td><td>Vysis Inc.</td><td>32-161075 &lt;ul style=&quot;preenchimento:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;30-805850&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804941 &lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171077&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804820&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171078&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5804R</td><td>Ferramenta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga</td><td>Material</td><td>Nalge Nunc international</td><td>347856</td><td></td></tr><tr><td>frasco Coplin (vidro)</td><td>Material</td><td>Barloworld Scientific</td><td>Hellendahl (ZCT278)</td><td></td></tr><tr><td>frasco Coplin (plástico)</td><td>Material</td><td>Deltalab</td><td>191087</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura (15x15)</td><td>Material</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600115</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura (18x18)</td><td>Material</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600118</td><td></td></tr><tr><td>Lápis de diamante</td><td>Material</td><td>Hammacher</td><td>335117010</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Material</td><td>Merck &amp;& Cia., Inc.</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Material</td><td>Grupo Roche</td><td>11814320001</td><td></td></tr><tr><td>Freezer</td><td>Ferramenta</td><td>Zanussi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luvas</td><td>Material</td><td>Sanyo</td><td>101/3300</td><td></td></tr><tr><td>HYBrite&amp;#8482;</td><td>Ferramenta</td><td>Vysis Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Óleo de imersão</td><td>Material</td><td>Olympus Corporation</td><td>35505</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Ferramenta</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Material</td><td>Merck &amp;& Cia., Inc.</td><td>106.009</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Material</td><td>Labsystems</td><td>Finnpipette (4500000)</td><td></td></tr><tr><td>Ponteira de reposição para micropipeta</td><td>Material</td><td>Daslab</td><td>16-2001</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de unha</td><td>Material</td><td>Quo-cosméticos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio epifluorescente Olympus BX60</td><td>Ferramenta</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Equipado com filtro triplo para DAPI/Texas Red/FITC e filtros monocromáticos para Aqua, FITC e Texas Red.</td></tr><tr><td>Pipeta de Pasteur</td><td>Material</td><td>Rubilabor</td><td>211.0230</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de contraste de fase</td><td>Ferramenta</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta plástica (3 ml)</td><td>Material</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Material</td><td>Fluka</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>Cimento de borracha</td><td>Material</td><td>Melhor teste</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas</td><td>Material</td><td>Knittel Glaser</td><td>4520022</td><td></td></tr><tr><td>Caixas Protetoras para Lâminas</td><td>Material</td><td>Deltalab</td><td>19276.1</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente estéril</td><td>Material</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Material</td><td>PentaFerte</td><td>002022300</td><td></td></tr><tr><td>Termômetro</td><td>Material</td><td>Comark Instruments, Inc</td><td>KM12</td><td></td></tr><tr><td>Água tri-destilada</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Material</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Material</td><td>B. Braun Medical</td><td>Aesculap (BD224R)</td><td></td></tr><tr><td>Laminar vertical &lt;em&gt;capela de fluxo&lt;/em&gt;</td><td>Ferramenta</td><td>Burdinola</td><td>OR-ST 1500</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Ferramenta</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15012</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Ferramenta</td><td>Raypa&amp;#174;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescência in situ hybridization (fish) protocolo no esperma humano

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidias são as anormalidades cromossômicas mais freqüentes em humanos. A maioria destas anormalidades resultam de erros durante o processo de meiose gametogénicas nos pais. Nos machos humanos, estes erros podem levar à produção de espermatozóides com anormalidades cromossômicas numéricas que representam um maior risco de transmissão destas anomalias à descendência. Por esta razão, a técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) em núcleos espermáticos tornou-se um protocolo amplamente incorporada no contexto do diagnóstico clínico. Esta prática fornece uma estimativa das freqüências de anormalidades cromossômicas numéricas nos gametas dos pacientes que procuram para aconselhamento genético reprodutivo. Até à data, os cromossomos mais freqüentemente incluídos na análise FISH espermatozóides são cromossomos X, Y, 13, 18 e 21. Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar e fixar uma amostra de sêmen humano, como decondense e desnaturar a cromatina de espermatozóides, como proceder para obter preparações FISH esperma, e como visualizar os resultados no microscópio. Observações especiais dos passos mais relevantes são dadas para alcançar os melhores resultados.

Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar uma amostra de sêmen para alcançar boa qualidade de fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação em espermatozóides humanos. Preparações obtidas podem ser usadas para triagem aneuploidia no contexto do diagnóstico clínico.

Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano

As aneuploidias são as anormalidades cromossômicas mais frequentes em humanos. A maioria dessas anormalidades resulta de erros meióticos durante a gametogênese...

O protocolo de hibridização fluorescente in situ em núcleos de espermatozoides humanos foi amplamente incorporado na área de diagnóstico clínico. Uma das aplicações desta metodologia é a triagem da ploidia de espermatozoides. Como parte da orientação sobre reprodução oferecida a homens inférteis, observa-se que a presença de anomalias numéricas é maior nesses indivíduos do que na população geral, e frequentemente apresentam parâmetros seminais anormais.Isso representa um risco aumentado de transmitir essas anomalias a qualquer descendente. Hoje vamos ilustrar o protocolo de hibridização fluorescente in situ em núcleos de espermatozoides descondensados para a análise dos cromossomos 13, 18, 21, X e Y. Uma vez que a amostra tenha sido coletada, ela deve ser mantida em temperatura ambiente por 20 minutos até que ocorra a liquefação. Para iniciar o protocolo, a amostra deve ser transferida para um tubo de centrífuga.As soluções que vamos utilizar na primeira parte do experimento são hipertônicas, pré-aquecidas a 37 graus C, e ácido acético em metanol na proporção de três para um. Essas devem ser preparadas recentemente. Em seguida, a amostra está pronta para ser centrifugada a mil Gs durante cinco minutos.Agora, remova cuidadosamente o sobrenadante e adicione a solução hipertônica gota a gota até atingir um volume de aproximadamente 10 mililitros. Este tubo deve permanecer a 37 graus C por 30 minutos, e então a amostra deve ser centrifugada novamente. A centrifugação faz com que os espermatozoides se acumulem no fundo do tubo, permitindo-nos substituir a solução hipotônica pelo metanol.A centrifugação com ácido acético deve ser repetida para trocar o metanol com ácido acético tantas vezes quantas forem necessárias para obter um pellet branco. Quando isso ocorrer, deve-se adicionar mais metanol com ácido acético. O volume final deve ser ajustado de acordo com a dispersão celular que se deseja obter em extensões posteriores.O passo final consiste em realizar as extensões, deixando a amostra fixada cair sobre lâminas Reed armazenadas em metanol a menos 20 graus C. É útil demarcar a área da lâmina que contém a extensão de espermatozoides para futuras localizações. Isso pode ser facilmente feito usando um lápis de diamante no lado oposto da lâmina. Após verificar uma dispersão celular ideal, as lâminas devem ser armazenadas a menos 20 graus C por um mínimo de 24 horas.Antes de prosseguir com o protocolo. Nesta parte do experimento, vamos utilizar solução de citrato de sódio salina, série de etanol, DRE fatal e fide. Quando as lâminas tiverem sido descongeladas, as amostras fixadas devem ser lavadas e desidratadas mergulhando-as em dois frascos coplin consecutivos contendo duas vezes SSC.Isso levará três minutos para cada coplano. Em seguida, as lâminas devem ser submersas por dois minutos em cada frasco de coplano de etanol, em ordem crescente de concentração. Neste ponto, para prosseguir com as etapas seguintes, as lâminas devem ser secas completamente.Dado que o DNA no núcleo do espermatozoide é altamente compactado, é necessário descondensar a cromatina antes de desnaturá-lo. Isso pode ser feito usando uma solução de DTT a 37 graus C. Este é um produto que atua rompendo as pontes de enxofre da protamina que enrola o DNA no núcleo dos espermatozoides. O tempo de incubação da lâmina em DTT deve ser ajustado de acordo com a reatividade da amostra de sêmen a este produto.Normalmente, isso leva cerca de oito minutos, embora possa variar de dois a 15 minutos; após esse período, as lâminas devem ser transferidas imediatamente para duas vezes SSC durante três minutos e novamente por mais três minutos, seguido por dois minutos em cada um dos frascos de etanol coplano. Para a hibridização da sonda, é essencial trabalhar com fitas simples de DNA. Isso exige uma etapa de desnaturação antes da adição das sondas, envolvendo um período de incubação de cinco minutos em uma solução de formamida a 73 graus C. Para concluir o tratamento das lâminas, é necessária uma transferência final na solução de etanol, submergindo as lâminas por um minuto por frasco coplano.Os lâminas estão então prontos para ser hibridizados nos estudos de FISH realizados para diagnóstico clínico. Os cromossomos mais comumente analisados incluem os cromossomos sexuais e os cromossomos 13, 18 e 21. Para analisar esses cromossomos, utilizaremos um kit multicolorido de sonda de DNA da vices.Isto contém um frasco com uma combinação de sondas para a região do satélite alfa dos cromossomos X, Y e 18, marcados com origem verde e aqua, respectivamente, e outro frasco com uma combinação de sondas para os cromossomos 13 e 21, marcados com verde e laranja, respectivamente. O volume da mistura de sonda adicionada variará de acordo com o tamanho da área que você deseja hibridizar, tomando como referência uma lamínula de 15 por 15. Um volume de cinco microlitros é suficiente.As duas misturas de sondas são pré-desnaturadas em um tampão de hibridização para facilitar o uso, permitindo adicioná-las diretamente às lâminas descondensadas e desnaturadas. Também existem outras sondas comerciais disponíveis para uma ampla variedade de cromossomos e Loki que podem ser utilizadas nestes experimentos. Geralmente, no entanto, essas sondas exigem um tratamento de pré-desnaturação antes da adição da mistura à amostra-alvo.Nessas situações, é suficiente seguir as instruções do fabricante. A região alvo deve ser coberta com uma lamínula e selada com cola de borracha. Em seguida, as lâminas estão prontas para serem colocadas na câmara de hibridização, pré-aquecida a 37 graus C, e incubadas nessa temperatura por seis a 24 horas.Na parte final do protocolo, vamos utilizar essas duas soluções de lavagem compostas por diferentes concentrações de solução de citrato de sódio salino e o detergente NP 40. Após o tempo de incubação, as lâminas podem ser removidas da câmara de hibridização para eliminar o cimento de borracha. Em seguida, remova cuidadosamente a lamínula.Como mostrado, os lâminas são submersos por dois minutos na primeira solução de lavagem, pré-aquecida a 73 graus C. Em seguida, são transferidos para a segunda solução de lavagem à temperatura ambiente por mais um minuto. Essas duas lavagens nos ajudarão a eliminar quaisquer sinais de hibridização inespecíficos. Após essas duas lavagens, precisamos aguardar a secagem completa dos lâminas para concluir a última etapa do protocolo.Neste momento, é adicionado um produto de contracoloração para facilitar a visualização do núcleo das células. Um dos produtos mais comuns utilizados para este fim é o dpi. O volume adicionado também deve ser ajustado conforme o tamanho da área hibridizada, tomando como referência uma lamínula de 18 por 18.Um volume de oito microlitros de DPI é suficiente. A lamínula pode ser selada com esmalte de unha, e agora os preparos estão prontos para serem visualizados. Caso contrário, podem ser armazenados a menos 20 graus C até sua análise prospectiva.O microscópio que vamos utilizar para a visualização é um Olympus BX 60 epifluorescente equipado com um filtro de três bandas para dpi, Texas Red e FITC, e filtros de banda única para aqua FITC e Texas Red. Através do filtro de três bandas, a preparação hibridizada com x, Y e 18 exibe sinais para esses três cromossomos. Utilizando o filtro de banda única para aqua, podemos visualizar apenas os sinais fluorescentes para o cromossomo 18. Devemos esperar um desses sinais em cada espermatozoide normal.No entanto, ao usar o filtro de banda única apenas para FITC, alguns espermatozoides exibem um sinal fluorescente verde correspondente ao cromossomo X. Os espermatozoides que não apresentam o sinal verde devem exibir um sinal vermelho para o cromossomo Y, que pode ser especificamente visualizado por meio do filtro para Texas red. Visualizando a hibridização 1321 por meio do filtro de três bandas, podemos distinguir os sinais para esses dois cromossomos.O sinal verde corresponde ao cromossomo 13 e pode ser visualizado especificamente utilizando o filtro de banda única para FITC. O filtro de banda única para Texas Red permite-nos visualizar especificamente os sinais para o cromossomo 21. Todos os espermatozoides normais devem exibir um sinal para cada uma dessas duas sondas.Para resumir, aqui estão as principais etapas do protocolo. Novamente, o processo de fixação deve ser realizado com precisão para obter extensões de boa qualidade, com a adição gota a gota de ácido acético metanólico. Para evitar a formação de agregados de espermatozoides no processo de descondensação, o tempo de incubação na solução de DTT deve ser ajustado de acordo com a reatividade da amostra de sêmen a este produto.Uma exposição excessiva dos espermatozoides ao DTT resultaria em sinais dispersos ao final do protocolo, enquanto uma exposição insuficiente resultaria em hibridização nula da sonda e ausência de alguns sinais. Embora a desnaturação da amostra de espermatozoides seja obrigatória, a desnaturação da sonda deve ser adaptada às indicações do fabricante. É importante manter um controle rigoroso sobre o tempo e a temperatura das duas lavagens pós-hibridização.Uma temperatura mais alta ou um tempo de lavagem excessivo pode resultar na eliminação de alguns sinais, enquanto o oposto não eliminaria sinais inespecíficos. Por fim, o uso de um microscópio epifluorescente equipado com filtros específicos adequados é essencial para uma boa visualização e interpretação dos sinais. E é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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