Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano

O protocolo de hibridização fluorescente in situ em núcleos de espermatozoides humanos foi amplamente incorporado na área de diagnóstico clínico. Uma das aplicações desta metodologia é a triagem da ploidia de espermatozoides. Como parte da orientação sobre reprodução oferecida a homens inférteis, observa-se que a presença de anomalias numéricas é maior nesses indivíduos do que na população geral, e frequentemente apresentam parâmetros seminais anormais.

Isso representa um risco aumentado de transmitir essas anomalias a qualquer descendente. Hoje vamos ilustrar o protocolo de hibridização fluorescente in situ em núcleos de espermatozoides descondensados para a análise dos cromossomos 13, 18, 21, X e Y. Uma vez que a amostra tenha sido coletada, ela deve ser mantida em temperatura ambiente por 20 minutos até que ocorra a liquefação. Para iniciar o protocolo, a amostra deve ser transferida para um tubo de centrífuga.

As soluções que vamos utilizar na primeira parte do experimento são hipertônicas, pré-aquecidas a 37 graus C, e ácido acético em metanol na proporção de três para um. Essas devem ser preparadas recentemente. Em seguida, a amostra está pronta para ser centrifugada a mil Gs durante cinco minutos.

Agora, remova cuidadosamente o sobrenadante e adicione a solução hipertônica gota a gota até atingir um volume de aproximadamente 10 mililitros. Este tubo deve permanecer a 37 graus C por 30 minutos, e então a amostra deve ser centrifugada novamente. A centrifugação faz com que os espermatozoides se acumulem no fundo do tubo, permitindo-nos substituir a solução hipotônica pelo metanol.

A centrifugação com ácido acético deve ser repetida para trocar o metanol com ácido acético tantas vezes quantas forem necessárias para obter um pellet branco. Quando isso ocorrer, deve-se adicionar mais metanol com ácido acético. O volume final deve ser ajustado de acordo com a dispersão celular que se deseja obter em extensões posteriores.

O passo final consiste em realizar as extensões, deixando a amostra fixada cair sobre lâminas Reed armazenadas em metanol a menos 20 graus C. É útil demarcar a área da lâmina que contém a extensão de espermatozoides para futuras localizações. Isso pode ser facilmente feito usando um lápis de diamante no lado oposto da lâmina. Após verificar uma dispersão celular ideal, as lâminas devem ser armazenadas a menos 20 graus C por um mínimo de 24 horas.

Antes de prosseguir com o protocolo. Nesta parte do experimento, vamos utilizar solução de citrato de sódio salina, série de etanol, DRE fatal e fide. Quando as lâminas tiverem sido descongeladas, as amostras fixadas devem ser lavadas e desidratadas mergulhando-as em dois frascos coplin consecutivos contendo duas vezes SSC.

Isso levará três minutos para cada coplano. Em seguida, as lâminas devem ser submersas por dois minutos em cada frasco de coplano de etanol, em ordem crescente de concentração. Neste ponto, para prosseguir com as etapas seguintes, as lâminas devem ser secas completamente.

Dado que o DNA no núcleo do espermatozoide é altamente compactado, é necessário descondensar a cromatina antes de desnaturá-lo. Isso pode ser feito usando uma solução de DTT a 37 graus C. Este é um produto que atua rompendo as pontes de enxofre da protamina que enrola o DNA no núcleo dos espermatozoides. O tempo de incubação da lâmina em DTT deve ser ajustado de acordo com a reatividade da amostra de sêmen a este produto.

Normalmente, isso leva cerca de oito minutos, embora possa variar de dois a 15 minutos; após esse período, as lâminas devem ser transferidas imediatamente para duas vezes SSC durante três minutos e novamente por mais três minutos, seguido por dois minutos em cada um dos frascos de etanol coplano. Para a hibridização da sonda, é essencial trabalhar com fitas simples de DNA. Isso exige uma etapa de desnaturação antes da adição das sondas, envolvendo um período de incubação de cinco minutos em uma solução de formamida a 73 graus C. Para concluir o tratamento das lâminas, é necessária uma transferência final na solução de etanol, submergindo as lâminas por um minuto por frasco coplano.

Os lâminas estão então prontos para ser hibridizados nos estudos de FISH realizados para diagnóstico clínico. Os cromossomos mais comumente analisados incluem os cromossomos sexuais e os cromossomos 13, 18 e 21. Para analisar esses cromossomos, utilizaremos um kit multicolorido de sonda de DNA da vices.

Isto contém um frasco com uma combinação de sondas para a região do satélite alfa dos cromossomos X, Y e 18, marcados com origem verde e aqua, respectivamente, e outro frasco com uma combinação de sondas para os cromossomos 13 e 21, marcados com verde e laranja, respectivamente. O volume da mistura de sonda adicionada variará de acordo com o tamanho da área que você deseja hibridizar, tomando como referência uma lamínula de 15 por 15. Um volume de cinco microlitros é suficiente.

As duas misturas de sondas são pré-desnaturadas em um tampão de hibridização para facilitar o uso, permitindo adicioná-las diretamente às lâminas descondensadas e desnaturadas. Também existem outras sondas comerciais disponíveis para uma ampla variedade de cromossomos e Loki que podem ser utilizadas nestes experimentos. Geralmente, no entanto, essas sondas exigem um tratamento de pré-desnaturação antes da adição da mistura à amostra-alvo.

Nessas situações, é suficiente seguir as instruções do fabricante. A região alvo deve ser coberta com uma lamínula e selada com cola de borracha. Em seguida, as lâminas estão prontas para serem colocadas na câmara de hibridização, pré-aquecida a 37 graus C, e incubadas nessa temperatura por seis a 24 horas.

Na parte final do protocolo, vamos utilizar essas duas soluções de lavagem compostas por diferentes concentrações de solução de citrato de sódio salino e o detergente NP 40. Após o tempo de incubação, as lâminas podem ser removidas da câmara de hibridização para eliminar o cimento de borracha. Em seguida, remova cuidadosamente a lamínula.

Como mostrado, os lâminas são submersos por dois minutos na primeira solução de lavagem, pré-aquecida a 73 graus C. Em seguida, são transferidos para a segunda solução de lavagem à temperatura ambiente por mais um minuto. Essas duas lavagens nos ajudarão a eliminar quaisquer sinais de hibridização inespecíficos. Após essas duas lavagens, precisamos aguardar a secagem completa dos lâminas para concluir a última etapa do protocolo.

Neste momento, é adicionado um produto de contracoloração para facilitar a visualização do núcleo das células. Um dos produtos mais comuns utilizados para este fim é o dpi. O volume adicionado também deve ser ajustado conforme o tamanho da área hibridizada, tomando como referência uma lamínula de 18 por 18.

Um volume de oito microlitros de DPI é suficiente. A lamínula pode ser selada com esmalte de unha, e agora os preparos estão prontos para serem visualizados. Caso contrário, podem ser armazenados a menos 20 graus C até sua análise prospectiva.

O microscópio que vamos utilizar para a visualização é um Olympus BX 60 epifluorescente equipado com um filtro de três bandas para dpi, Texas Red e FITC, e filtros de banda única para aqua FITC e Texas Red. Através do filtro de três bandas, a preparação hibridizada com x, Y e 18 exibe sinais para esses três cromossomos. Utilizando o filtro de banda única para aqua, podemos visualizar apenas os sinais fluorescentes para o cromossomo 18. Devemos esperar um desses sinais em cada espermatozoide normal.

No entanto, ao usar o filtro de banda única apenas para FITC, alguns espermatozoides exibem um sinal fluorescente verde correspondente ao cromossomo X. Os espermatozoides que não apresentam o sinal verde devem exibir um sinal vermelho para o cromossomo Y, que pode ser especificamente visualizado por meio do filtro para Texas red. Visualizando a hibridização 1321 por meio do filtro de três bandas, podemos distinguir os sinais para esses dois cromossomos.

O sinal verde corresponde ao cromossomo 13 e pode ser visualizado especificamente utilizando o filtro de banda única para FITC. O filtro de banda única para Texas Red permite-nos visualizar especificamente os sinais para o cromossomo 21. Todos os espermatozoides normais devem exibir um sinal para cada uma dessas duas sondas.

Para resumir, aqui estão as principais etapas do protocolo. Novamente, o processo de fixação deve ser realizado com precisão para obter extensões de boa qualidade, com a adição gota a gota de ácido acético metanólico. Para evitar a formação de agregados de espermatozoides no processo de descondensação, o tempo de incubação na solução de DTT deve ser ajustado de acordo com a reatividade da amostra de sêmen a este produto.

Uma exposição excessiva dos espermatozoides ao DTT resultaria em sinais dispersos ao final do protocolo, enquanto uma exposição insuficiente resultaria em hibridização nula da sonda e ausência de alguns sinais. Embora a desnaturação da amostra de espermatozoides seja obrigatória, a desnaturação da sonda deve ser adaptada às indicações do fabricante. É importante manter um controle rigoroso sobre o tempo e a temperatura das duas lavagens pós-hibridização.

Uma temperatura mais alta ou um tempo de lavagem excessivo pode resultar na eliminação de alguns sinais, enquanto o oposto não eliminaria sinais inespecíficos. Por fim, o uso de um microscópio epifluorescente equipado com filtros específicos adequados é essencial para uma boa visualização e interpretação dos sinais. E é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.