Name: Obtenção altamente purificada Toxoplasma gondii Oocistos por um gradiente de cloreto de césio descontínuos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Aprenda a purificar oocistos de Toxoplasma gondii com alta pureza usando gradiente descontínuo de cloreto de césio. Este método é essencial para experimentos de biologia molecular e cultura de tecidos.

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Gostaríamos de agradecer a Nichole Brinkman e Michael Ware para revisão técnica do manuscrito e Abu Sayed e Dr. Linda Ransick para apoio técnico e administrativo. Os Estados Unidos Agência de Proteção Ambiental através do seu Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento parcialmente financiado e colaborou na pesquisa aqui descrita com o número do contrato EP-D-06-096 para Dynamac, Inc. e um número de convênio interinstitucional DW-12-92289801-0 para USDA. Ele foi submetido a revisão Agência e aprovado para publicação. Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais não constitui endosso ou recomendação para o uso. MJS endereço atual: Dynamac, Inc. Cincinnati, OH.

<p class="jove_title"&gt; 1. Geral precauções de segurança quando se trabalha com<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocistos</p&gt;<ol&gt;<li&gt; É importante seguir todas as precauções de segurança quando se trabalha com<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocistos. Na maioria dos indivíduos saudáveis,<em&gt; T. gondii</emInfecção&gt; é facilmente controlado pelo sistema imunológico, no entanto, um resultado ao longo da vida a infecção. Indivíduos imunocomprometidos são particularmente suscetíveis à toxoplasmose e não deve lidar com<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocistos. Mulheres grávidas também não devem lidar com<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocistos, porque a infecção pode causar defeitos congênitos graves<sup&gt; 8</sup&gt;.</li&gt;<li<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocistos só deve ser manipulado em uma área designada e com pessoal treinado. Sinais indicando<em&gt; T. gondii</em&gt; Trabalho de oocistos está em andamento deve ser enviada para alertar outras pessoas de entrar na área designada.</li&gt;<li&gt; Use equipamento de protecção individual (EPI), tais como jaleco, vestido descartável, luvas descartáveis ​​e óculos de protecção adequada ou uma viseira ao manusear<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocistos.</li&gt;<li&gt; Mudanças freqüentes de luvas são recomendados. Não manuseie nenhum equipamento de laboratório com<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocisto contaminados luvas.</li&gt;<li&gt; Sempre use bandejas de metal revestidas com uma autoclave forros descartáveis ​​absorventes quando se trabalha com<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocistos. Garantir que todos os racks, tubos, etc utilizados são descartáveis ​​ou autoclaváveis.</li&gt;<li&gt; Todos os<em&gt; T. gondii</emResíduos&gt; deve ser autoclavado duas vezes para pelo menos uma hora.</li&gt;<li&gt; Todos os equipamentos não descartáveis ​​(racks, bandejas, etc) também devem ser autoclavados duas vezes para pelo menos uma hora.</li&gt;<li&gt; Linhas de vácuo utilizado para aspirar líquidos deve ser conectado a um filtro de Vacushield ™ para evitar a contaminação da bomba de vácuo.</li&gt;<li&gt; Todos os afetados bancada de laboratório-tops devem ser desinfectados após completar o trabalho com<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocistos. Acabado de fazer hipoclorito de 10% deve ser aplicada liberalmente para a área de trabalho e permitiu seco. A área deve ser bem lavado com água.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. Preparação de tampões e soluções</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Prepare uma solução de 1 L de sacarose 2,2 M, dissolvendo 752,66 g de sacarose em 600 ml DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Mexa delicadamente e calor usando uma placa aquecida mexa para dissolver a sacarose. Uma vez completamente dissolvido, trazer volume de 1 L com DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Isto deve ser seguido por esterilização em autoclave a solução para pelo menos 20 minutos.</li&gt;<li&gt; Prepare um 1L tampão TE (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA), pH 7,2 pela adição de 6,05 g de Tris-HCl e 3,7 g de EDTA em 700 ml de DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O, ajustar o pH para 7,2, em seguida, levar o volume para 1 L com DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; Para o gradiente de CsCl, prepare uma solução estoque de CsCl com uma gravidade específica de 1,15 (1,15-CsCl), adicionando 21,75 g de CsCl com 103,25 ml de tampão TE. Solução A, misture 30 ml de TE com 20 ml de 1,15-CsCl. Solução B, misturar 20 ml de TE com 30 ml de 1,15-CsCl e 12,5 ml de solução de vermelho de fenol. Solução para C, misturar 10 ml de TE com 40 ml de 1,15-CsCl (Tabela 1).</li&gt;<li&gt; Prepare uma solução de 1L 1 N de hidróxido de sódio (NaOH) pela dissolução de 40 g de NaOH, em 800 ml de DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Uma vez dissolvido, levar o volume para 1 L com DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; Prepare uma solução de L 1 a 2% (por volume) de H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; 20 ml de mistura de H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Com 980 ml de DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. Flutuar sacarose</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Adicionar 10 ml de uma suspensão fecal de<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocistos, em 2% H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt;, Em um tubo de centrífuga de 50 ml. Deve-se notar que a suspensão fecal refere-se a amostras que foram pré-processadas através de um procedimento de flotação de sacarose, como descrito anteriormente<sup&gt; 8</sup&gt;. Quando as amostras fecais são inicialmente colhidos os gatos infectados são processados ​​através de uma bóia de sacarose, como descrito na referência 8. Este flutuar sacarose adicional é necessário para minimizar ainda mais os restos fecais transitar para o processo de purificação CsCl e obter a mais pura<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocistos possível.</li&gt;<li&gt; Neutralize o H 2%<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Adicionando 6 ml (3 / 5 volumes) de 1 N de NaOH para a suspensão fecal. Misture bem em vórtice.</li&gt;<li&gt; Adicionar um volume igual (16 ml) de 2,2 M de sacarose a criação de uma concentração final de 1,1 M à suspensão fecal e misturar bem em vórtice.</li&gt;<li&gt; Cuidadosamente sobrepor a sacarose / suspensão fecal com 10 ml DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O usando uma pipeta 10 ml. Centrifugar a suspensão a 1.200 xg por 20 min em temperatura ambiente sem freio.</li&gt;<li&gt; Cuidadosamente recolher a água superior e camadas interfase e transferir para um novo tubo de 50 ml de centrífuga cônico pipetando a partir da interface ar-água, sem roda da pipeta. É importante para minimizar a transição de sacarose ao coletar a camada de interfase.</li&gt;<li&gt; Misture o restante sacarose / solução pelota fecal em vortex do tubo.</li&gt;<li&gt; Repetir os passos 3.4 e 3.5.</li&gt;<li&gt; Trazer o volume das duas soluções interfase oocisto a 50 ml com DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O e centrifugar os tubos a 2000 xg por 10 minutos em temperatura ambiente.</li&gt;<li&gt; Aspirar o sobrenadante de cada tubo e ressuspender pellets com 5 ml tampão TE e piscina a suspensão de oocistos juntos. O volume total agrupada deverá ser de 10 ml.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. CsCl gradiente</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Prepare um gradiente de CsCl descontínua em um tubo de policarbonato de 50 ml de Oak Ridge com cuidado underlaying cada camada usando uma seringa de 50 ml com uma calibre 18 ponta e, autoclavável, agulha de aço, e uma torneira de 2 vias. Nota: vermelho de fenol é adicionado à solução B para distinguir facilmente entre as camadas de gradiente (Tabela 1).</li&gt;<li&gt; Aos poucos adicione as seguintes soluções para o tubo na ordem listada abaixo. Note-se que a taxa de fluxo não deve exceder mais de 0,5 ml / seg.<ol&gt;<li&gt; 10 ml da amostra de suspensão TE / oocistos</li&gt;<li&gt; Solução ml 8 A</li&gt;<li&gt; 8 ml da solução B</li&gt;<li&gt; 8 ml da solução C</li&gt;</ol&gt;</li&gt;<li&gt; Centrifugue o tubo de Oak Ridge a 12.000 xg por 60 min a 4 ° C, sem freio. Uso de um rotor ângulo fixo é aceitável, mas uma alta velocidade balançando resultados balde em uma melhor separação dos oocistos a partir da amostra de suspensão com o mínimo de manchas de detritos fecais ao longo do lado ou do tubo. A extensão das manchas depende da composição da suspensão fecal e, portanto, pode ser necessário para executar dois gradientes CsCl se a suspensão fecal é extremamente sujo.</li&gt;<li&gt; Após a centrifugação, recolher a banda de oocistos opaco / branco contendo entre as soluções A e B. Para minimizar a contaminação com detritos fecais, vá diretamente para a banda de oocistos sem perturbar o gradiente e recolher a interfase oocisto usando uma pipeta 10 ml. Transferir o oocisto interfase para um 50 ml novo tubo de centrífuga cônico. Tentar minimizar a quantidade de solução de CsCl aspirado ao coletar o oocisto interfase, uma vez que pode representar um problema na granulação dos oocistos durante a etapa de lavagem.</li&gt;<li&gt; Lave oocistos com 30-40 ml de DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Centrifugar o tubo em 2.000 xg à temperatura ambiente por 10 min sem freio. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento de oocistos. Repetir a lavagem duas vezes.</li&gt;<li&gt; No final da lavagem final, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de ácido sulfúrico 2% e armazenar a 4 ° C até o uso. Oocistos está agora pronto para manipulação posterior. Pureza de oocistos pode ser verificada microscopicamente pela ausência de detritos fecais na amostra.</li&gt;</ol

<ol><li>Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+viable+Toxoplasma+gondii+in+beef%2C+chicken%2C+and+pork+from+retail+meat+stores+in+the+United+States%3A+risk+assessment+to+consumers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers.</a> J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).</li>
<li>Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+from+animals+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: from animals to humans.</a> Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).</li>
<li>Bowie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+toxoplasmosis+associated+with+municipal+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water.</a> Lancet. 350, 173-177 (1997).</li>
<li>Moura, L. de <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis%2C+Brazil%2C+from+field+to+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene.</a> Emerg. Infect. Dis. 12, 326-329 (2006).</li>
<li>Jones, J. L., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis+-+Recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis - Recent developments.</a> Exp. Parasitol. doi: 10.1016/j.exppara.2009.03.013, (2009).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+detect+Toxoplasma+gondii+oocysts+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">How to detect Toxoplasma gondii oocysts in environmental samples.</a> FEMS Microbiol. Rev. 27, 651-661 (2003).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Toxoplasma+gondii+oocysts+by+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient.</a> J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).</li>
<li>Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).</li>
</ol>

obtenção altamente purificada toxoplasma gondii oocistos por um gradiente de cloreto de césio descontínuos

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii é um protozoário patógeno intracelular obrigatório que normalmente infecta seres humanos. É um apicomplexan bem caracterizado associados a causar surtos de doenças alimentares e transmitidas pela água. O hospedeiro definitivo é a espécie de felino, onde ocorre a replicação sexual resultando no desenvolvimento do oocisto altamente infecciosa e ambientalmente resistente. A infecção ocorre através da ingestão de cistos de tecido de carne contaminada ou oocistos do solo ou água. Infecção é geralmente assintomática em indivíduos saudáveis, mas resulta em uma infecção latente ao longo da vida que pode reativar causando encefalite toxoplásmica e morte se o indivíduo torna-se imunocomprometidos. Carne contaminada com T. cistos gondii têm sido a principal fonte de infecção na Europa e nos Estados Unidos, mas as recentes mudanças na gestão animal e práticas de criação e manipulação de alimentos melhorados e procedimentos de processamento reduziram significativamente a prevalência de T. cistos gondii em carne 1, 2. No entanto, a seroprevalência em humanos permanece relativamente elevada, sugerindo que a exposição a partir de solo contaminado de oocistos ou água é provável. De fato, os surtos pela água da toxoplasmose foram relatados em todo o mundo apoiando a exposição teoria para a forma de oocistos ambiental representa um risco significativo de saúde 3-5. A pesquisa data, no entendimento da prevalência de T. gondii oocistos na água e meio ambiente são limitados devido à falta de ferramentas para detecção de oocistos no ambiente 5, 6. Isto é principalmente devido à falta de protocolos de purificação eficientes para a obtenção de um grande número de oocistos altamente purificada T gondii de gatos infectados para fins de pesquisa. Este estudo descreve o desenvolvimento de um método modificado CsCl que facilmente purifica T. gondii oocistos de fezes de gatos infectados que são adequados para biológica molecular e manipulação de cultura de tecidos 7.

Este estudo descreve o desenvolvimento de um método modificado CsCl que facilmente purifica oocistos T. gondii a partir de fezes de gatos infectados que são adequados para biológica molecular e manipulação de cultura de tecidos

Obtenção altamente purificada Toxoplasma gondii Oocistos por um gradiente de cloreto de césio descontínuos

Toxoplasma gondii é um patógeno protozoário intracelular obrigatório que comumente infecta seres humanos. É um apicomplexo bem caracterizado associado a ...

Toxoplasma gondii são geralmente obtidos a partir das fezes de gatos infectados e isolados por meio de um procedimento de flutuação, resultando em uma suspensão parcialmente purificada, cultura molecular e tecidual. Experimentos com este parasita, no entanto, exigem oocistos altamente purificados para alcançar esse objetivo. Os oocistos são ainda purificados utilizando uma etapa de flutuação em sacarose, na qual os oocistos são ressuspendidos, recobertos com uma camada de sacarose e água e centrifugados para separar os oocistos da maior parte da matéria fecal.A camada de OSIS é então transferida para um novo tubo sobreposto com césio, cloreto e centrifugado. A faixa distinta de OSIS resultante é então coletada e lavada, pronta para uso em experimentos que requerem teon io altamente purificado para auxiliar. Olá, sou a Dra. Sarah Staggs, funcionária da Dynam, uma contratada do Laboratório Nacional de Pesquisa sobre Exposição da Agência de Proteção Ambiental dos EUA.Hoje vamos mostrar um procedimento para purificar Toxoplasma Gandhi io Oasis a partir das fezes de gatos de laboratório infectados, utilizando um gradiente descontínuo de cloreto de césio. Este procedimento é rotineiramente utilizado em nosso laboratório para isolar OSI, auxiliando em experimentos de biologia molecular e cultivo de tecidos. Então, vamos começar.Antes de iniciar qualquer trabalho com TG O Osis, devem-se considerar importantes precauções de segurança. Pessoas imunocomprometidas, grávidas ou que estejam tentando engravidar não devem manipular o patógeno devido ao risco de adquirir toxoplasmose, que pode causar doenças e graves defeitos congênitos. X. Para reduzir o risco de infecção, reserve um espaço designado para este procedimento e coloque sinais de aviso para alertar outras pessoas antes de entrarem na sala.Lembre-se de usar jaleco de laboratório, avental descartável, luvas descartáveis e proteção ocular adequada ou protetor facial ao manipular cistos T-One IO. Certifique-se de trocar as luvas com frequência e evitar tocar qualquer equipamento com luvas contaminadas. Também é importante trabalhar sobre bandejas metálicas autoclaváveis forradas com forros absorventes descartáveis.E nessa linha, reserve um minuto para garantir que todos os suportes, tubos e outros equipamentos que você pretende usar sejam descartáveis ou autoclaváveis. Se você estiver usando itens não descartáveis, certifique-se de autoclavá-los após o uso por dois ciclos de uma hora. Você também deverá conectar todas as linhas de vácuo a um filtro de proteção a vácuo para evitar a contaminação da bomba de vácuo.Quando terminar o isolamento dos cistos, você precisará aplicar uma solução fresca de hipoclorito a 10% sobre a superfície de trabalho. Deixe secar e, em seguida, enxágue a área várias vezes com água. Uma vez que as devidas precauções de segurança tenham sido adotadas, você poderá prosseguir com seus experimentos.Antes da coleta de T Guni OYS, é necessário primeiramente preparar todas as soluções necessárias para os gradientes de sacarose, flutuação e cloreto de césio. Etapas de centrifugação. As soluções de que você precisará incluem uma solução 2,2 molar de sacarose esterilizada por um ciclo de 20 minutos na autoclave, um litro de tampão TE com pH 7,2, uma solução normal de hidróxido de sódio, uma solução 2% de ácido sulfúrico e uma solução estoque de cloreto de césio com gravidade específica de 1,15.A solução estoque de cloreto de césio a um ponto 15 será usada para preparar as soluções A, B e C, que serão utilizadas para formar o gradiente de cloreto de césio. A solução A é preparada misturando 30 mililitros de TE com 20 mililitros da solução estoque de cloreto de césio a um ponto 15; a solução B é preparada misturando 20 mililitros de TE com 30 mililitros da solução estoque de cloreto de césio a um ponto 15 e, em seguida, adicionando 12,5 microlitros da solução de fenol vermelho. Por fim, a solução C é preparada misturando 10 mililitros de TE com 40 mililitros da solução de cloreto de césio a um ponto 15.Iniciaremos a preparação do gradiente de sacarose tomando uma suspensão fecal de 10 mililitros de T osis em ácido sulfúrico 2% e transferindo-a para um tubo cônico de centrífuga de 50 mililitros. A fonte da matéria fecal provém das fezes de gatos infectados que já foram previamente processadas por meio de um procedimento de flutuação em sacarose descrito anteriormente em um livro-texto escrito pelo Dr. JP Duby, intitulado Toxoplasmosis of Animals and Humans. Esta etapa adicional reduz ainda mais a quantidade de detritos fecais no processo de purificação com cloreto de césio e ajuda a obter a maior pureza possível dos cistos de T goi.Em seguida, neutralizamos o ácido sulfúrico adicionando três quintos do volume de uma solução normal de hidróxido de sódio à suspensão fecal. Misture bem a suspensão por vortex. A seguir, adicione um volume igual de sacarose e misture bem a suspensão por vortex.Usando 10 mililitros por tubo, sobreponha cuidadosamente a suspensão fecal de sacarose com 10 mililitros de água bidestilada. Após concluir com cuidado, coloque os tubos no centrifugador e centrifugue a 1200 ×g por 20 minutos à temperatura ambiente, sem frear ao final da centrifugação. Tendo o cuidado de não perturbar a interface, retire suavemente a pipeta da interface ar-água para coletar as camadas superior aquosa e de interface.É muito importante tentar minimizar a quantidade da camada de sacarose que é transferida enquanto você coleta a camada de interface. Transfira essas camadas para um novo tubo cônico de centrífuga de 50 mililitros. Vortexe o tubo para misturar a solução remanescente do pellet fecal em sacarose.Repita mais uma vez a sobreposição de água anterior nos passos de centrifugação. Após a centrifugação, colete as camadas superior aquosa e de interface e transfira-as para um novo tubo. Use água bidestilada para ajustar o volume das soluções da interface de cistos dois oh oh a 50 mililitros.Em seguida, centrifugue os tubos a 2000 vezes G durante 10 minutos à temperatura ambiente. Por fim, aspire o sobrenadante S de cada tubo. Re-suspenda os pellets em cinco mililitros de tampão TE e prepare as suspensões de osmose.Os osis estão agora prontos para a etapa de gradiente de cloreto de césio. Começaremos preparando um gradiente descontínuo de cloreto de césio em um tubo de polycarbonato Oak ridge de 50 mililitros. Adicione 10 mililitros da suspensão contendo TE e osis utilizando uma seringa de 50 mililitros com agulha de aço autoclavável romba de 18 gauge.E, com uma torneira de dois sentidos, adicione lentamente as seguintes soluções diretamente ao fundo do tubo. Oito mililitros da solução A, oito mililitros da solução B e oito mililitros da solução C. Certifique-se de que a taxa de fluxo não exceda 0,5 mililitro por segundo. Também é importante observar que o vermelho de fenol na solução B ajuda a distinguir as camadas do gradiente.Agora você está pronto para centrifugar o tubo Oak ridge a 12.000 × g durante 60 minutos a quatro graus Celsius sem freio, utilizando um rotor de ângulo fixo de alta velocidade. Após a conclusão da centrifugação, coletamos a faixa branca opaca entre as soluções A e B. Esta faixa contém os oócitos. Utilizando uma pipeta de 10 mililitros, dirija-se diretamente à faixa de oócitos sem perturbar o gradiente e colete os oócitos.Tente minimizar a quantidade de solução de cloreto de césio que você aspira enquanto coleta o cisto, pois o excesso de cloreto de césio pode dificultar a formação do pellet dos cistos durante a lavagem. Em seguida, transfira o OSIS para um novo tubo cônico de centrífuga de 50 mililitros. Agora, lave os cistos O com 30 a 40 mililitros de água bidestilada e, em seguida, centrifugue o tubo a 2000 × g, à temperatura ambiente, por 10 minutos, sem freio; aspire cuidadosamente o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet dos cistos O.Repita a lavagem mais duas vezes. Após a conclusão das lavagens finais, aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de ácido sulfúrico 2%. Verifique o OSIS ao microscópio para garantir que todos os detritos fecais tenham sido removidos com sucesso da amostra.Os osis estão agora prontos para manipulações adicionais, ou você pode armazená-los a quatro graus Celsius até que esteja pronto para usá-los. Veja a seguir como os osis não purificados se apresentam ao microscópio de contraste de interferência diferencial com aumento de 400 x. Observe a presença de grandes quantidades de contaminantes fecais no campo, o que torna muito difícil identificar os assistes OSI.Aqui está como os OISS aparecem em 400 x após o protocolo de purificação por gradiente de cloreto de césio. Observe a ausência de detritos fecais. Acabamos de mostrar como purificar Toxoplasma Gandhi Iasis das fezes de gatos infectados em laboratório utilizando um gradiente descontínuo de cloreto de césio.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de seguir todas as diretrizes de segurança e ter sempre cuidado ao sobrepor o gradiente de cloreto de césio, adicionando cada camada muito lentamente e tentando não perturbar ou misturar o gradiente. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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