Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila

Para realizar as reconstruções de órgãos em desenvolvimento dentro da Drosophila melanogaster, precisamos determinar o modelo direto que melhor descreve a propagação da luz dentro da própria pupa. O procedimento começa com a seleção de uma pré-pupa branca e a colagem na extremidade de um tubo capilar, de modo que o eixo ântero-posterior da poppa seja orientado paralelamente ao tubo. Um pequeno tubo capilar é preenchido com um pouco de corante fluorescente e inserido na caixa da pupila.

Após um ajuste cuidadoso do eixo, a pupa é girada 360 graus. As imagens são adquiridas em diferentes ângulos. Os dados de iluminação trans fluorescente adquiridos são usados para determinar o modelo direto que será usado para obter imagens do desenvolvimento de órgãos.

Olá, meu nome é Claudia e estou no Centro de Biologia de Assistência do Hospital Geral de Massachusetts, Harvard Medical School. Eu sou Ula Petou do Paramount Lab da Harvard Medical School, e sou Daniel Rozanski do Instituto de Imagens Biológicas e Médicas da Universidade Técnica de Munique e do Heliman Center Munich. Hoje vamos mostrar-lhe um procedimento para reconstrução tridimensional de todo o corpo em Oph Melano Casta.

Usamos este procedimento em nosso laboratório para visualização in vivo do desenvolvimento dos órgãos durante o estado da pupila. Então vamos começar Antes de começar. Observe que não há vídeo de acompanhamento que deva ser visto antes deste, onde alguns aspectos técnicos da tomografia de projeção óptica são explicados com mais detalhes do que aqui.

Além disso, o outro vídeo explica imagens de tecidos ou órgãos preparados de animais maiores. Para todos os experimentos abordados neste vídeo, serão usados transgenes de drosófila forjada. Eles são EL A gal quatro expressos nas glândulas salivares, apteris gal quatro, que é expresso nos tecidos precursores larvais da asa adulta e do tórax, o transgene que produz a proteína fluorescente.

Em resposta à gal quatro chamada U-A-S-G-F-P e branca 1118, os machos de controle não fluorescentes que carregam os transgenes UAS são cruzados com fêmeas virgens que carregam os quatro transgenes GAL para obter tecido. A expressão específica de cruzamentos de GFP é configurada de oito a 10 fêmeas e machos virgens em meios de mosca padrão com uma pitada de fermento de padeiro. Na superfície, os frascos são alojados a 25 graus Celsius em uma incubadora umidificada sob um ciclo de luz escura de 12 horas.

Dois dias após o início do cruzamento, os pais são transferidos para um frasco novo e, cinco a seis dias depois, o PUI começará a preencher o frasco de PrepU branco. Eu sou selecionado para expressão de GFP sob um escopo de dissecação fluorescente. A seleção de pré-pui brancos garante o estadiamento adequado dos animais, uma vez que permanecem brancos por cerca de uma hora.

Após a pupilação, eles se tornam pigmentados ou acastanhados. As PPF que expressam pui são coletadas suavemente dos frascos usando um pincel úmido e colocadas em uma gota de água ou PBS em uma placa de Petri, devem ser limpas de materiais autofluorescentes. Usando o pincel, eles agora devem estar prontos para imagens tomográficas.

Se o PrepU Eu preciso continuar envelhecendo para chegar ao estágio correto de desenvolvimento, eles podem ser deixados em uma placa de Petri com uma toalha de papel molhada ou em um frasco de comida limpa. Isso garantirá umidade suficiente e desenvolvimento adequado para a imagem. O PrepU deve ser aderido ao interior de um tubo capilar de vidro de 800 mícrons de diâmetro.

Pinte a extremidade posterior da pupila com supercola e oriente a superfície colada da pré-pupa no tubo de forma que o acesso ântero-posterior da mosca fique paralelo ao tubo. A parte anterior do animal penderá sobre o tubo capilar. O tubo capilar agora é fixado no estágio rotacional do microscópio.

Na posição vertical, ajuste o eixo de inclinação do estágio de rotação para que o eixo de rotação do tubo fique paralelo às colunas de pixels do CCD de imagem. Com a posição da mosca ajustada, prossiga com a imagem. Neste exemplo, animais com glândulas salivares fluorescentes devem ser visualizados para oph expressando GFP em suas glândulas salivares podem ser gerados a partir de um cruzamento entre EAG quatro e estoques U-A-S-G-F-P.

Começamos com uma pré-pupa montada, iluminamos a pré-pupa com um feixe de excitação e coletamos o sinal fluorescente GFP. Na transiluminação, gire o PrepU 360 graus ao longo de seu eixo vertical e adquira as imagens de transiluminação. Cada imagem corresponde a 10 graus de rotação.

O tempo total de aquisição depende da quantidade de fluorescência e da intensidade do feixe de excitação. Os tempos típicos são da ordem de um minuto. Neste exemplo, uma pupa DSO expressando GFP nos discos imaginais da asa será fotografada.

Esta pupa pode ser coletada de um frasco de um cruzamento entre os estoques Aus GAL quatro e U-A-S-G-F-P. A pré-pupa é montada conforme descrito anteriormente. No entanto, como o tempo de imagem para este experimento é de cerca de oito horas, é fundamental que o ambiente permaneça úmido e em temperatura ambiente Para evitar a desidratação e a morte do animal, um obturador é colocado sobre o feixe de excitação para evitar a extinção de quatro flores no tecido de interesse, bem como para garantir que o animal não seja queimado pelo feixe de laser como antes, ilumine com o feixe de excitação e colete o sinal fluorescente GFP por iluminação trans.

A pré-pupa é completamente girada ao longo de seu eixo vertical. Durante a coleta de dados, a rotação leva apenas um minuto e é repetida em diferentes intervalos de tempo. Para criar uma série de imagens de lapso de tempo das asas durante o desenvolvimento, os dados podem ser adquiridos por pelo menos seis horas a uma taxa de 100 imagens por hora.

É vital que a exposição total à luz seja controlada com este obturador para evitar danos ou branqueamento fotográfico. Este filme mostra imagens adquiridas entre o estágio PrepU e a aversão à cabeça da pupila. Ao reconstruir a imagem tridimensional, há um forte espalhamento para frente que precisa ser contabilizado, que não pode ser aproximado por difusão.

Portanto, para tornar a reconstrução, um modelo de espalhamento direto de propagação da luz deve ser determinado Para simplificar, negligenciamos a absorção. A quantidade de dispersão é testada experimentalmente. Para fazer isso, um objeto estranho com fluorescência padronizada é inserido na pré-pupa branca não fluorescente 1118, que é então escaneada para gerar os dados do modelo direto, começando com o preenchimento de um tubo capilar de sílica de 100 mícrons com corante fluorescente PS 5.5.

Usando a ação capilar, empurre o tubo capilar para dentro da pupa em um ângulo de 45 graus em relação ao eixo anterior, monte o PrepU em um tubo capilar e posicione-o adequadamente no estágio rotativo conforme descrito anteriormente. Agora ilumine a pré-pupa com um feixe de laser de excitação com uma lente de baixa abertura numérica e colete imagens de iluminação trans fluorescente da pré-pupa. Conforme descrito anteriormente, o software MATLAB é usado para ajustar os dados ao modelo teórico direto explícito Para facilitar o processo de reconstrução, a aproximação firme e à equação de transporte é selecionada, pois descreve o regime de espalhamento direto e também se ajusta aos dados experimentais.

Determinado o modelo forward correto, podemos reconstruir as glândulas salivares e obter as reconstruções tomográficas com lapso de tempo. Se você planeja usar uma tomografia de espaço livre, algoritmos de configuração para correspondência de índice também podem ser configurados. Primeiro, mostramos uma reconstrução 3D das glândulas salivares no início do desenvolvimento.

Para comparação, a coloração histológica das glândulas salivares mostra que as reconstruções se correlacionam bem com a histologia. Este filme de lapso de tempo do desenvolvimento dos discos imaginais da asa foi adquirido de um único espécime vivo. Para comparação, a coloração histológica do disco da asa nos mesmos pontos de tempo mostra que as reconstruções se correlacionam bem com a histologia.

Acabamos de mostrar como construir um sistema para criar imagens de estruturas tridimensionais dentro do oph in vivo e ao longo do tempo. Isso permite nos acompanhar, a morfogênese em Drosophila, e acompanhar o desenvolvimento das asas ao longo de seis horas consecutivas. Ao fazer este procedimento, é crucial escolher o modelo direto correto para a propagação da luz dentro da drosófila.

Este método pode ser usado em combinação com técnicas histológicas para lançar luz sobre o desenvolvimento de órgãos durante os estágios da pupila oph, e pode ser modificado para o estudo de diferentes organismos de tamanho semelhante. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.