Name: Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Aprenda o isolamento de células germinativas primordiais de embriões de camundongo em estágios específicos de desenvolvimento. Este método permite estudar diferenciação celular com aplicações em pesquisas sobre infertilidade e câncer.

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Os autores gostariam de agradecer a ajuda inestimável de: Dr. Neal First e Kourtney Wilkinson para manuscrito edição; Dr Lucy Senter, Dr. Brigit Willeford e Mike Basett de assistência com a formação e animal cuidados na instalação do mouse MSU ALAC credenciados; Dr. Dwayne Sábio por sua assistência com microscopia e captura de imagem; Cesar Monroy, Hannah Swoope, e Bobbie Huddleston por sua assistência com a produção de vídeo na MSU. Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Pesquisa Institucional e do Departamento de Ciências Biológicas da Mississippi State University.

Parte 1: Laparotomia rato grávidas <ol><li> Usando deslocamento cervical, euthanize um rato C57BL6J fêmea grávida em 10,5-11,5 dpc. </li><li> Limpe o abdômen com sabão antimicrobiano, e em seguida, fazer a barba dele. </li><li> Após o barbear, lavar o abdômen com uma solução salina. </li><li> Depois, seque o abdômen com uma gaze estéril. </li><li> Cobrir o mouse com um novo campo estéril. </li><li> Faça uma incisão ventral usando uma pinça e tesouras de dissecação. </li><li> Identificar e remover todo o útero da cavidade abdominal. Embriões de camundongos será visível dentro do útero. </li><li> Transferência do útero em uma placa de Petri cheia de D-PBS, e mantê-lo no gelo. </li><li> Usando um bisturi e pinças esterilizadas,, remova a placenta e extra tecidos embrionários de cada embrião. </li><li> Transferência de embriões em uma placa de Petri fresco cheio de D-PBS. </li><li> Meça o comprimento dos embriões mouse. Descobrimos que os tamanhos diferentes conforme a idade do embrião. Por exemplo 8,5 dpc medido a uma média de 6 mm, 10,5 dpc medido a uma média de 11mm, e 12,5 dpc medido a uma média de 16 mm. </li><li> Em seguida, retire suas caudas para extração de DNA. </li></ol> Parte 2: Dissecção cume Gonadal Sob estereomicroscópio e Luz fonte Schott Fostec <ol><li> Coloque um papel de filtro numa placa de Petri. Então, coloque o embrião de rato em cima do papel de filtro para secar o embrião e imobilizar para dissecção. </li><li> Utilizando um escalpelo esterilizado, fazer um corte transversal do embrião de rato acima da origem do cordão umbilical. </li><li> Sob microscópio estereoscópico, utilizando uma pinça estéril fina e uma agulha estéril provocações bem, retire os intestinos e fígado para que o sistema urinário é visível. Os rins estão localizados lateralmente na cavidade abdominal, e da bexiga está localizado medial e caudal em comparação com os rins. O embrião pode ser identificado como do sexo masculino, porque os sulcos são gonadal localizados em cada lado da bexiga. No feminino, as cristas gonadais estão firmemente unido à extremidade caudal lateral dos rins. </li><li> Descasque o cume fora gonadal deslizando uma agulha por trás dele. A crista gonadal é removida cortando-se os tecidos que suportam. </li><li> Transferir os cumes gonadal para uma placa de Petri novo repleto de novas D-PBS. Microscopicamente, a crista gonadal masculino devem ser retirados, grandes e de formato oval. Em contraste, a crista gonadal feminina deve ser manchado, têm forma alongada e ser menor em comparação com a crista gonadal masculino. </li></ol> Parte 3: Digestão cume Gonadal Sob estereomicroscópio: <ol><li> Mesonefro Dissection: gônadas o independente do mesonefro e crista utilizando uma agulha fina e afiada. <ul><li> É importante remover a mesonefro do cume gonadal, porque é um tecido somático que overgrow no processo de derivação PGC. </li></ul></li><li> Digestão cume gonadal: Colete limpa cumes gonadal em uma gota de doce 0.5ul D-PBS. Adicionar 20 ml de colagenase / Dispase Solution (concentração final de 1mg/ml). <ul><li> Embriões devem ser processados ​​individualmente. Cada embrião deve ter o seu próprio separado e rotulado placa de Petri. </li></ul></li><li> Gonadal cume Mincing: Corte a crista gonadal em pedaços pequenos usando uma agulha estéril e estéril pinças finas n º 4. </li><li> Incubação: placas de Petri são transferidos para uma incubadora a 37 ° C por 15 minutos. <ul><li> O período de incubação pode variar entre os tecidos. </li></ul></li><li> Pipetagem: Após 15 minutos, o tecido pode ser dissociada por pipetagem. Usando pipetas de vidro puxado capilares com diâmetros entre 40 milímetros -100 Quebre os pedaços pipetando cima e para baixo. Isto irá formar pequenos aglomerados. Transferir os pedaços de 0,5 ml de um pré aquecido queda de D-PBS para uma lavagem final. </li><li> Após a lavagem, transferir os pedaços de tubos de eppendorf. <ul><li> Não mais expor o tecido a colagenase. </li><li> Não faça uma suspensão única célula. Isto é importante para a formação de colônia. Se é uma suspensão de células individuais, PGCs tendem a se diferenciar e migrar. </li><li> Este processo não deve ser superior a 20 minutos, ou suas células vão perder a viabilidade. </li></ul></li><li> Centrifugar a 2000 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 0,5 ml de knock out complementada media (pré-aquecido a 37 ° C). </li></ol> Parte 4: Primordial Cultura Células Germinal "Você deve executar os próximos passos rapidamente para preservar a viabilidade de PGCs para isolamento e derivação. <ol><li> 24 horas antes deste processo, você deve preparar uma mitoticamente inativado camada MEF-CF1 alimentador seguindo o protocolo de Zhang J. et al 2008. <ul><li> Prepare 20 pratos para um pregnant rato fêmea (6-8 embriões). </li><li> MEFs perder a capacidade de ser uma camada de alimentação (promover o crescimento e evitar a diferenciação) após 5-6 passagens. </li><li> Não use MEFs com mais de 48 horas. </li></ul></li><li> Imediatamente antes PGCs chapeamento, o meio MEF deve ser lentamente retirada da camada de alimentação MEF. </li><li> Em seguida, adicionar 0,5 ml / poço do pré-aquecido médio knockout suplementado para a camada de alimentação MEF. <ul><li> MEF mídia contém soro fetal bovino que induz a diferenciação de PGCs. </li><li> Meio Knockout deve ser completada com fatores de crescimento específicos espécie imediatamente antes do uso para garantir a atividade do fator de crescimento. </li></ul></li><li> Usando distribuição simétrica, PGCs placa sobre a camada de alimentação MEF. <ul><li> Se estas partes estão muito perto, eles tendem a se agregar e fazer colônias densas que atribuem pouco ou começar a diferenciar. </li><li> Placas de cultura deve ser rotulado com o nome de linha de células embrionárias Germinal, o número de passagem, e data. </li></ul></li><li> Cuidadosamente, transferir a placas de cultura em estufa a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Monitorar as células a cada 24 horas. </li><li> Após 48 horas, retire 250 ml de mídia a partir do topo da cultura para evitar a perturbação anexo da colônia. Em seguida, adicione 250 ml de fresco suplementado knock-out de mídia (pré-aquecido a 37 ° C). </li><li> Após o passo 7, esperar mais 48 horas, e, em seguida, remover completamente todos os meios de comunicação e substituí-la por meio suplementado fresco knock-out (pré-aquecido a 37 ° C). Fazer isso a cada 2 dias por 8-10 dias até PGC formam colônias. </li></ol> Parte 5: Células embrionárias Germinal <ol><li> Após 10 dias de isolamento PGC, colônias de células embrionárias germinativas se formam. </li><li> Linhas de células germinais embrionárias são mantidas vivas por passagens manual de cada 8-10 dias. Eles continuam a apresentar uma morfologia indiferenciada e expressam marcadores de pluripotência, como alkalyne fosfatase, Oct-4, SSEA-1, e SOX-2 </li></ol> Notas <ul><li> Condições estéreis / assépticas são essenciais na sala de cultura. </li><li> Para a derivação e cultura, PGCs são processados ​​em uma Classe II Purifier Gabinete de segurança Bio. </li><li> Incubações estão em 37 ° C umidificada e 5% CO 2 incubadora. </li><li> Todos os meios e reagentes são filtrados antes de serem utilizados em um filtro de 0,2 um, armazenadas a 4 ° C, e pré-aquecido a 37 ° C antes do uso. </li><li> Durante as etapas de dissecção, todos os embriões e tecidos devem ser mantidos no gelo. </li><li> Todos os frascos de reagente são descontaminados com etanol antes de colocar em um armário. </li><li> Uso de luvas, jaleco, enfermeira e bonés são obrigatórios. </li></ul> Conclusão Nós fornecemos um vídeo que mostra como isolar, retirar e cultura embrionárias células germinais de cristas gonadais de 10,5-11,5 embriões de camundongos dpc. O isolamento reprodutível e cultura a longo prazo de linhagens de células embrionárias germinal fornece um fundamento essencial para o estudo do desenvolvimento embrionário precoce, genéticas e epigenéticas padrões germinal, a formação das gônadas, os efeitos ambientais de órgãos adjacentes durante o processo de desenvolvimento da gametogênese nos embriões masculinos e femininos, e determinação dos caminhos que leva ao câncer e infertilidade. <img src="/files/ftp_upload/1635/1635figure1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1">

<ol><li>DeFelici, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeFelici%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A laboratory Handbook</a>. 1, Second Edition, 73-85 (1998).</li>
<li>Donovan, P. J., De Miguel, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+Germ+Cells+into+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Turning Germ Cells into Stem Cells.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).</li>
<li>Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLabosky%2C+PA+%22Molecular+embryology%3A+methods+and+protocols%22">Molecular embryology: methods and protocols</a>. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).</li>
<li>Mc Laren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Mouse+Embryonic+Germ+Cells+into+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis.</a> Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).</li>
<li>Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+tissue+and+cell+interactions+play+key+roles+in+mouse+germ+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification.</a> Development. 128, 481-490 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+MEFs+to+Matrigel+I%3A+Passaging+hESCs+in+the+Presence+of+MEFs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Esta pesquisa foi realizada após revisão e Animal Care Use Institucional e Comitê de aprovação (IACUC) do nosso protocolo de mouse # 08030 (O Papel das espécies reativas de oxigênio-ROS no germe de desenvolvimento de linha e formação de tumores: Holding e criação de protocolo) no Mississippi State University.

Pinça N º 14 e 15, 35 mm bisturi, tesouras de dissecação, campos cirúrgicos, sabão antimicrobiano, solução salina 0,9%, gaze, recipiente de espuma de gelo, lâmina de barbear, bisturi de 35 mm, pinças de multa n º 4 e 5, provocando agulha fina com manusear, filtro de folhas de papel, e puxou pipetas de vidro.<br /<br /&gt; Equipamento: estereomicroscópio dissecação, fonte de luz Schott Fostec, microscópio invertido, micropipeta 10 e 200ul, centrífuga, bio Gabinete de segurança.

isolamento e derivação de células embrionárias de rato germinal

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

A capacidade de células germinais embrionárias (EG) de se diferenciar em células germinativas primordiais (PGCs) e mais tarde em gametas durante as primeiras fases de desenvolvimento é um modelo perfeito para resolver a nossa hipótese sobre o câncer e infertilidade. Este protocolo mostra como isolar células germinativas primordiais das gônadas em desenvolvimento 10,5-11,5 dias pós coitum embriões (DPC) do mouse. Desenvolvimento gonadal cumes de embriões de camundongos (C57BL6J) foram dissociadas pela ruptura mecânica com colagenase, então banhado em um rato camada de alimentador de embrião de fibroblastos (MEF-CF1) que foi previamente mitoticamente inativada com mitomicina C na presença de mídia nocaute e suplementada com inibidor de leucemia fator (LIF), fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) e fator de Stem Cell (SCF). Usando esses métodos otimizados para a identificação PCG, isolamento e estabelecimento de condições de cultura permite culturas de longo prazo de células EG por mais de 40 dias. O embrionárias linhagens de células germinais embrionárias mostrou fenótipo e expressão de marcadores utilizados comum do estado pluripotente. Isolamento e derivação de células germinais na cultura fornecer uma ferramenta para entender o seu desenvolvimento in vitro e oferecer a oportunidade de acompanhar os danos cumulativos ao nível genético e epigenético após a exposição ao estresse oxidativo.

A capacidade de células germinais embrionárias de se diferenciarem em células germinativas primordiais durante estágios iniciais de desenvolvimento é um modelo perfeito para abordar nossa hipótese sobre o câncer e infertilidade. Este protocolo mostra como isolar células germinativas primordiais das gônadas em desenvolvimento 10,5-11,5 dias após a embriões de camundongos coitum.

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

A capacidade das células germinativas embrionárias (EG) de se diferenciarem em células germinativas primordiais (PGCs) e, posteriormente, em gametas durante o desenvolvimento precoce...

Olá, meu nome é Har Moreno do Laboratório de Genética Reprodutiva e Células-Tronco da Universidade Estadual do Mississippi. Olá, meu nome é Clara St. Também do Laboratório de Genética Reprodutiva e Células-Tronco da Universidade Estadual do Mississippi. As células germinativas primordiais ou PGC são as precursoras dos gametas femininos e masculinos no ovário e testículo, respectivamente.Em embriões de camundongo, as CPG migram do intestino posterior e atravessam a crista genital entre 8,5 e 9,5 dias. Após isso, as CPG chegam à crista genital entre 10,5 e 11,5 dias.As CAs Postum começam a formar o segmento gonadal na fêmea D. As cs pg migram para a extremidade lateral do rim para iniciar a formação do segmento gonadal feminino. Em contraste, nos machos, as PGCs migram para ambos os lados da bexiga.Para começar a formar. As células germinativas masculinas são um excelente modelo de pesquisa para estudar vias de desenvolvimento onic em presença de estresse oxidativo como causa de infertilidade e câncer. Então, vamos começar.Hoje vamos mostrar como coletar e isolar células PV a partir de cristas gonadais em desenvolvimento em embriões de camundongo de 10,5 a 11,5 dias. As cristas gonadais são dissociadas por destruição mecânica para serem implantadas em uma camada de fibroblastos embrionários de boca de embrião. Após 10 dias de cultivo em condições otimizadas, colônias germinativas embrionárias apresentarão fenótipos embrionários. Além disso, após passagens, elas podem ser identificadas pela expressão de marcadores de pluripotência.Os seguintes materiais são necessários para esta etapa de dissecação estéril. Pacote que contém campos estéreis, pinças, tesouras, lâminas de barbear, sabões antimicrobianos, soluções salinas, placa de Petri contendo PBS Pep sobre gelo e gaze. Uma fêmea grávida de camundongo BL6 no dia 10,5 a 11 dias de gestação é eutanasiada por dislocação cervical. Limpe o abdômen com sabão antimicrobiano e, em seguida, depile-o.Lave o abdômen utilizando soluções salinas. Seque com uma gaze estéril. Cubra o camundongo com um novo campo estéril.Realize uma incisão ventral utilizando pinça e tesoura de dissecação. Identifique e remova todo o útero da cavidade abdominal. Os embriões com boca visível estarão presentes dentro do útero.Com muita cautela. Passe pelos ligamentos que ainda estão presos ao corno uterino. Complete a dissecação fazendo um corte transversal ao longo da vagina.Transfira o útero para uma placa de Petri, feche com GPVS e mantenha na gelo. Separe os tecidos extraembrionários dos embriões. Utilizando um escalpelo estéril e uma pinça.Transfira os embriões bucais para uma nova placa de Petri contendo DPBS. Meça o comprimento do embrião bucal. Observamos que os tamanhos variaram de acordo com a idade do embrião.Por exemplo, 8,5 dias após o acasalamento medidos em média seis milímetros, 10,5 dias após o acasalamento medidos em média 11 milímetros e 12,5 dias após o acasalamento medidos em média 16 milímetros. Remova suas caudas mediante extração de DNA. Os seguintes materiais são necessários para a dissecação: microscópio estereoscópico, cabine de segurança biológica, PDS, bisturi estéril.Pinceta fina estéril, agulha fina estéril para dissecção com cabo, discos de papel de filtro em placa de Petri. Coloque um papel de filtro em uma placa de Petri, depois posicione o embrião da boca em cima do papel de filtro para secar o embrião e imobilizá-lo para a dissecção. Usando um bisturi estéril, faça um corte transversal no embrião da boca acima da origem do cordão umbilical sob um microscópio estereoscópico.Usando pin&ccedil;as finas est&eacute;reis e uma agulha est&eacute;ril de disseca&ccedil;&atilde;o fina, remova os intestinos e o f&iacute;gado para que o sistema urin&aacute;rio fique vis&iacute;vel. A bexiga est&aacute; localizada em um plano medial.O embrião pode ser identificado como macho porque as pontes genitais estão localizadas em ambos os lados da bexiga. Usando pin&ccedil;as finas est&eacute;reis e uma agulha fina est&eacute;ril, remova a crista genital macho direita cortando o tecido que a sustenta. Utilize o mesmo procedimento para remover a crista genital macho esquerda.Transfira ambas as cristas genitais masculinas para um pequeno recipiente de Petri contendo DPDS fresco microscopicamente. Você pode visualizar a crista gonadal masculina presa à estrutura do mesonefride. As cristas gonadas masculinas devem apresentar-se grandes e com formato oval sob um microscópio estereoscópico.Remova os intestinos utilizando pin&ccedil;as finas est&eacute;reis e uma agulha fina est&eacute;ril para dissec&ccedil;&atilde;o. Os rins est&atilde;o localizados lateralmente na cavidade abdominal, e a bexiga est&aacute; localizada mais medial e caudal em compara&ccedil;&atilde;o aos rins. A crista gonadal feminina difere da crista gonadal masculina em raz&atilde;o de sua morfologia e localiza&ccedil;&atilde;o anat&ocirc;mica.As cristas gonadais femininas estão firmemente presas à extremidade lateral caudal do rim. Usando pinças finas estéreis e uma agulha fina estéril, remova a crista gonadal feminina esquerda cortando os tecidos que a fixam ao rim.Repita o mesmo procedimento para remover a crista gonadal feminina direita. Transfira ambas as cristas genitais femininas para um pequeno recipiente de Petri contendo PDS fresco ao microscópio. É possível visualizar a crista gonadal masculina presa ao Neso Nera.Essas cristas genitais femininas devem apresentar formato alongado e ser menores em comparação com as cristas genitais masculinas, utilizando agulhas estéreis, finas e afiadas. Separe as cristas genitais femininas do meso e de outros tecidos somáticos utilizando agulhas estéreis, finas e afiadas. Separe as cristas genitais masculinas do mesonefro e de outros tecidos somáticos.É importante remover os meso Neros da crista ne Natal, pois é um tecido somático que irá supercrescer durante o processo de derivação de PGCs. Colete a crista gonadal em uma gota de 0,5 microlitro de DPVS fresco com soluções de colagenase distaste. Sob microscópios estereoscópicos, os tecidos gonadais são cortados em pequenos pedaços utilizando agulhas finas e afiadas estéreis.As placas de Petri são transferidas para uma estufa a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após 15 minutos, o tecido pode ser dissociado por pipetagem utilizando pipetas capilares de vidro puxadas com diâmetros diferentes entre 40 e cem mícrons. Desagregue os fragmentos pipetando para cima e para baixo.Isso formará pequenos agregados. Esses pequenos agregados são lavados com 0,5 microlitros de DPDX após a lavagem. Em seguida, são transferidos para cubos Eend a 2000 RPM durante cinco minutos.À temperatura ambiente após a centrifugação, o sobrenatante é removido e o pellet é ressuspenso em 0,5 mililitros de meio knockout suplementado, livre de soro, aquecido a 37 graus Celsius por 24 horas. Antes desse processo, você deve preparar uma camada de fibroblastos embrionários de camundongo inativados por irradiação, linhagem MEFCF1, imediatamente antes de semear as CPG. O meio de cultura deve ser removido da camada de alimentação previamente preparada.Em seguida, adicione pontualmente mililitros do meio knockout suplementado previamente aquecido a 37 graus Celsius sobre a camada de suporte de metano. Sob microscópios estereoscópicos e usando uma distribuição simétrica, pequenos agregados de PT GC são semeados sobre as camadas de suporte de metano. Se esses fragmentos estiverem próximos, tendem a se agregar e formar colônias densas que aderem mal ou começam a diferenciar na cultura.As placas devem ser rotuladas com o nome da linhagem de células germinativas embrionárias, número de passagem e data. Transfira cuidadosamente as placas de cultura para uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO₂. Após 10 dias da isolamento, é possível identificar colônias de células germinativas embrionárias com base em sua morfologia característica. Além disso, após a primeira passagem, elas podem ser identificadas pela expressão de marcadores pluripotentes, como fosfatase alcalina, Oct4, SSEA-1 e Sox2.Hoje vamos mostrar como coletar e cultivar células germinativas embrionárias a partir de CPGs de camundongos com 10,5 a 11,5 dias pós-coito. A caracterização das células germinativas embrionárias como precursoras das células germinativas é essencial para pesquisas relacionadas à gametogênese, fertilidade e câncer.Obrigado por assistir ao nosso vídeo. Boa sorte em seu experimento.

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Este vídeo demonstra um protocolo para isolar e cultivar células primárias do córtex cerebral do telencéfalo dorsolateral de embriões de camundongos.

Isolamento e Cultura de Células de Telencéfalos Dorsolaterais de Embriões de Camundongos

Nos últimos anos, a formação de células germinativas, utilizando métodos de cultura in vitro tem sido demonstrada utilizando vários tipos diferentes de células estaminais somáticas. Este artigo irá apresentar visualmente a diferenciação de células-tronco derivadas de células de rato recém-nascidos oócito-como iniciais.

Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes<em&gt; In vitro</em

Desenvolvemos um protocolo para gerar agregados de células-tronco embrionárias de camundongos que exibem auto-organização, quebra de simetria e alongamento paralelo ao desenvolvimento axial. Esta técnica permite o estudo de processos de desenvolvimento axial e a geração de tipos de células que de outra forma seriam difíceis de realizar em cultura de monocamada.

Geração de Agregados of Mouse Células-Tronco Embrionárias que mostram quebra de simetria, Polarização e Comportamento Coletivo Emergent<em&gt; In Vitro</em

Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

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Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

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Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

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