Name: Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprenda a otimizar condições de eletroporação em fibroblastos embrionários de camundongo usando o sistema Gene Pulser MXcell. Este método permite testar múltiplas condições rapidamente para estudos de expressão gênica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1) preparação celular <ol><li> Ao usar células aderentes, é necessário trypsinize e recolher as células antes da eletroporação. </li><li> Para comparar transfecção entre os quatro embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) culturas, representando três diferentes números de passagem, execute o seguinte em cada frasco. </li><li> Aspirar off meios de cultura celular. </li><li> Adicionar PBS para lavar células. </li><li> Remover PBS; adicionar tripsina suficiente para cobrir as células, e aguarde alguns minutos para permitir tripsina para separar células. </li><li> Verifique frascos com um microscópio para verificar a condição das células, smack frasco para retirar as células, e depois verificar frasco novamente para fazer as células se são todos destacados. </li><li> Esperar mais tempo e repetir se necessário. </li><li> Uma vez que todas as células são separadas, adicionar soro para neutralizar a mídia contendo tripsina. </li><li> Transferência de células para um tubo de centrifugação e as células de pelotas por centrifugação (300 xg = rcf). </li><li> Remover as células sobrenadante e ressuspender em um volume conhecido de PBS. </li><li> Contagem de células. </li><li> Transferência para um novo tubo o volume apropriado de suspensão de células para fornecer o número necessário de células para experiências (você precisará de 150 mL de células por poço, a uma densidade de 1 x 10 6 células / mL). </li><li> Células centrífuga. </li><li> Remover as células no sobrenadante e ressuspender o volume apropriado de Gene tampão de eletroporação Pulser para conseguir uma densidade de células de 1 x 10 6 células / mL. </li><li> Adicionar 20 mg de mL por plasmídeo de suspensão de células e misture delicadamente. </li></ol> 2) a configuração navio Eletroporação e eletroporação Configuração de placa e eletroporação <ol><li> Câmara de plugue placa no módulo de potência do sistema de eletroporação Gene Pulser MXcell. </li><li> Pipetar 150 mL mistura de células ou tampão em poços de uma placa de eletroporação de 96 poços. </li><li> Colocar placa na câmara de placa e de pulso. </li><li> Retire a placa da câmara. </li><li> Misture bem o conteúdo pipetando cima e para baixo em cada poço. </li><li> Transferência de células de cada poço para pré-aquecido tampão em 12-lamelas. </li><li> Toque placa para distribuir células e colocá-lo em incubadora. </li><li> Vamos recuperar as células por 24 horas. </li></ol> Cuvete de configuração e eletroporação <ol start="9"><li> Desligue câmara de placa do módulo de potência do sistema de eletroporação Gene Pulser MXcell e conecte o ShockPod ™ cuvete câmara. </li><li> Pipetar 600 mL da suspensão de células em uma cubeta de eletroporação 0,4 centímetros lacuna. </li><li> Coloque tina em câmara ShockPod e entregar pulso elétrico. </li><li> Remover cuvete da câmara. </li><li> Mix conteúdo cuvete pipetando cima e para baixo na cuvete. </li><li> Transferência de células de cada poço para pré-aquecido tampão em 12-lamelas. </li><li> Toque placa para distribuir células e colocá-lo em incubadora. </li><li> Vamos recuperar as células por 24 horas. </li></ol> 3) Resultados Representante Depois transfecting células e que lhes permita recuperar, analisar a eficiência de transfecção qualitativamente, por microscopia de epifluorescência, e quantitativamente, utilizando citometria de fluxo. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Células que foram sucesso electroporated e agora estão expressando o gene GFP aparecem sob microscopia de epifluorescência. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Vendo as células em contraste de fase permite a visualização de ambas as células transfectadas e untransfected. Estas são as células que foram expostas ao pulso de tensão menor eletroporação em 200V. As células são em grande parte confluentes devido à alta densidade celular. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. O mesmo campo de visão sob epifluorescência mostra um número de células estão expressando o marcador GFP, mas estes são apenas uma pequena porcentagem das células visíveis na imagem anterior. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Em 250V, o número total de células vivas visto sob contraste de fase diminui ligeiramente. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. De acordo com epifluorescência, pode-se ver que o número de células expressando GFP tem aumentado. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. No mais alto da tensão aplicada, 375V, há menos células vivas visível. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. No entanto, uma grande porcentagem das células restantes estão expressando GFP. Que condição é ideal depende do delineamento experimental. Em alguns experimentos o maior número de células transfectadas pode ser bom, em outros experimentos a transfecção maior percentual poderia ser melhor. Estamos interessados ​​no percentual de células que são GFP positivos em cada condição e como os percentuais variam com a idade das células. Citometria de fluxo pode fornecer informações quantitativas sobre os resultados transfecção em cada uma das condições de eletroporação diferentes. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Aqui, a porcentagem de células que são GFP positivas na passagem de cinco células em cada uma das 12 condições eletroporação são mostrados. O percentual máximo de transfecção foi de aproximadamente 80% maior sob o pulso de tensão de decaimento exponencial, condição 6, e 70% sob o pulso forte onda quadrada testada, a condição 12. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig9.jpg" alt="Figura 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Com as células passaram nove vezes antes da eletroporação, o padrão geral de transfecção percentual é quase idêntico, mas com uma diminuição muito ligeira no percentual de transfecção. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig10.jpg" alt="Figura 10" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 10"> Figura 10. Mostrado aqui são as percentagens de células GFP na passagem 13 células que mostram uma queda acentuada na porcentagem de transfecção em relação às células mais jovens. Os maiores porcentagens de transfecção foram de aproximadamente metade do que foi alcançado com as células mais jovens demonstrando a importância do uso de células saudáveis, logo após o isolamento possível. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Condições eletroporação usada para as células usando o MEF transfecting Gene Pulser MXcell </td></tr><tr><td> Condição (1-6) Exponencial pulsos Decay, todos com 350 uF, 1000OHM </td><td> Tensão (V) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 200 </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 250 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 300 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 326 </td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td> 350 </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 376 </td><td></td></tr><tr><td> Condição (7-12) Onda pulsos quadrados, todos com 2,000 uF, 1000 ohm, e 1 de pulso </td><td> Tensão (V) </td><td> Duração de pulso (ms) </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 200 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 250 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 300 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 250 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 300 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table>

Os autores são empregados por Bio-Rad Laboratories, que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo

Este artigo vídeo demonstra como usar o sistema de eletroporação MXcell facilmente identificar as condições óptimas para eletroporação MEFs ou outras linhagens de células primárias. O formato de placa de 96 poços permite muitas réplicas de experimental ou otimização condições a serem executadas simultaneamente, o que pode eliminar a necessidade de muitos experimentos separados. Ao realizar este procedimento, deve-se lembrar de usar as células saudáveis, logo após o isolamento possível e usar condições de eletroporação que são compatíveis com o buffer de eletroporação.

<table><tbody><tr><td>Buffer de Eletroporação Gene Pulser&amp;#174;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2676</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell&amp;#8482;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Câmara para Cubeta ShockPod&amp;#8482; do Sistema Gene Pulser MXcell&amp;#8482;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2673</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell&amp;#8482; com Câmara para Cubeta ShockPod&amp;#8482;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2674</td><td></td></tr></tbody></table>

usando o sistema de eletroporação gene pulser mxcell para transfectar pilhas com alta eficiência

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

É cada vez mais evidente que eletroporação é a forma mais eficaz para introduzir DNA plasmídeo ou siRNA em células primárias. O Gene Pulser sistema de eletroporação MXcell e Gene tampão de eletroporação Pulser (Bio-Rad) foram desenvolvidos especificamente para facilmente transfectar ácidos nucleicos em células de mamíferos e de difícil transfecção de células, tais como pilhas e tronco. Vamos demonstrar como executar um experimento simples para identificar rapidamente as melhores condições de eletroporação. Vamos demonstrar como executar várias amostras através de uma série de condições para que eletroporação um experimento pode ser realizado ao mesmo tempo, como otimização é realizada. Também vamos mostrar como as condições ideais identificados com placas de 96 poços eletroporação pode ser usado com cubetas de eletroporação padrão, facilitando a mudança de placas para eletroporação cubetas de eletroporação, mantendo a eficiência eletroporação mesmo. No vídeo, também vamos discutir alguns dos principais fatores que podem levar ao sucesso ou fracasso de experiências eletroporação.

Este procedimento mostra como usar o sistema de Gene Pulser eletroporação MXcell rapidamente e facilmente identificar as melhores condições de eletroporação de fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) ou outras células primárias. Considerações para solução de problemas também são discutidos no vídeo associado.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Tornou-se cada vez mais evidente que a eletroporação é a maneira mais eficaz de introduzir DNA plasmídico ou siRNA em células primárias. O Gene Pulser ...

O objetivo geral deste protocolo é identificar as condições ideais de eletroporação para transfectar linhagens celulares primárias utilizando fibroblastos embrionários de camundongo ou mfs. Como exemplo, células MF e o ácido nucleico de escolha são carregados em uma placa de eletroporação de 96 poços acoplada ao sistema de células Gene Pulser MX, o que permite testar múltiplas condições de eletroporação em um único ensaio. Em experimentos de otimização, as células são cultivadas após a eletroporação e analisadas quanto à eficiência de transfeção.Utilizando microscopia fluorescente em epifluorescência e citometria de fluxo, as condições de eletroporação mais eficientes podem então ser selecionadas para futuras transfeções. Olá, sou Adam McCoy, cientista sênior da Divisão de Expressão Gênica da BioRad Laboratories. Hoje vamos mostrar um procedimento para identificar facilmente as melhores condições de eletroporação para transfectar linhagens celulares primárias.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a expressão gênica nessas células. Hoje, estarei utilizando três números diferentes de passagem de MEFs ou fibroblastos embrionários de camundongo. Estou utilizando culturas com diferentes números de passagem por duas razões.Primeiro, mostrarei quão importante é a saúde celular. Com linhagens celulares primárias, mesmo apenas alguns dias a mais em cultura podem fazer diferença na eficiência de transfeção. Em segundo lugar, quero demonstrar que o processo de identificação das melhores condições é o mesmo, mesmo que a eficiência de transfeção diminua com as células mais velhas. Seu experimento provavelmente não envolverá células de idades diferentes.Você pode seguir o mesmo procedimento com o seu próprio desenho experimental. Se quiser comparar a expressão gênica em células controle e tratadas, você pode primeiro encontrar as melhores condições e depois realizar o seu experimento utilizando as condições que identificou. Ou então, pode fazer a sua otimização e o experimento em conjunto.Como demonstrarei hoje, usarei um plasmídeo que codifica GFP para analisar a eficiência de transfeção por citometria de fluxo. Porém, o procedimento de eletroporação seria o mesmo mesmo que você esteja fazendo algo diferente, como introduzir irna e analisar a expressão gênica por PCR em tempo real. Então, vamos começar.Os fibroblastos embrionários de camundongo, ou mets, utilizados neste protocolo são células aderentes. Assim, o primeiro passo no trabalho com essas células é destacá-las do fundo do frasco utilizando protocolos-padrão de cultura de tecidos que envolvem a tripsinização. Após as células se desatacharem do frasco, neutralize a tripsina com meio contendo soro e colete as células em tubos cónicos de 50 mililitros.Uma vez coletadas, centrifugue as células após a formação do pellet. Elas devem ser lavadas por ressuspendência, suspendendo-as em um volume conhecido de PBS. Após a ressuspendão completa, conte as células sabendo que será necessária uma concentração de 1 milhão de células por mililitro para experimentos de eletroporação.Calcule o número apropriado de células com base na contagem celular e transfira-as para um tubo limpo. Centrifugue por mais tempo para obter o pellet celular. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante.Re-suspenda as células no tampão de eletroporação até uma concentração de 1 milhão de células por mililitro e adicione 20 microgramas por mililitro do plasmídeo. As placas são divididas em 96 poços, com colunas numeradas de 1 a 12 e linhas de A a H; cada conjunto de quatro poços, ou conjunto de poços, compartilha um par de placas de eletrodos, de modo que as células nesses poços recebem o mesmo pulso. Por exemplo, os poços 1A, 1B, 1C e 1D estão eletricamente conectados em um único conjunto de poços e, portanto, receberiam todos o mesmo pulso.O próximo conjunto de quatro poços, dois, A, B, C e D, receberia todos o segundo pulso quando o protocolo é iniciado, mesmo que os parâmetros possam ser os mesmos, a placa de eletroporação de 96 poços também é configurada de modo que a metade superior e inferior da placa seja dividida. Assim, os poços, um E, um F, um G e um H na parte inferior da placa, todos receberam um pulso. Mas é distinto do pulso recebido pelos poços um, A, B, C e D na parte superior.Neste experimento, apenas metade da placa será utilizada. Os três primeiros poços de cada conjunto de poços contêm células de diferentes idades. As células da linha superior, linha A, foram subcultivadas cinco vezes.As células da linha B foram subcultivadas nove vezes e as células da linha C foram subcultivadas 13 vezes. A linha D contém apenas tampão de eletroporação antes da eletroporação. É recomendável verificar o seu protocolo para garantir que as configurações estejam corretas.Este protocolo fornecerá seis pulsos de decaimento exponencial seguidos por seis pulsos de onda quadrada. Os pulsos de decaimento exponencial aumentam de 200 volts a 450 volts e todos utilizam apenas 350 microfurões. Devido à baixa resistência do tampão de pulso genético ou de eletroporação utilizado.Os pulsos de onda quadrada variam tanto em voltagem quanto na duração do pulso. A configuração de capacitância do instrumento precisa ser ajustada à condutância da mistura de eletroporação. Se estiver usando um tampão de maior resistência para a eletroporação, como o DMEM, o mesmo intervalo de voltagem pode ser utilizado, mas com uma capacitância maior, como 950 microferrets para os pulsos de decaimento exponencial.Se a capacitância ideal do tampão que você está usando não for conhecida, será necessário variar também a capacitância nas condições de eletroporação que estão sendo testadas. O próximo passo é carregar 150 microlitros da mistura de células e plasmídeo em cada poço utilizado neste experimento. O quarto poço de cada conjunto de poços utilizados é preenchido com tampão de eletroporação.Após carregar a placa, coloque-a na câmara da placa MXL e feche a tampa. Em seguida, pressione pulsar para eletroporar as células. O eletroporador aplica os pulsos elétricos sequencialmente a cada poço, conforme as condições especificadas no protocolo escolhido.Leva alguns segundos para eletroporar todas as células. Após o pulso ser concluído, remova a placa da câmara de placas mista enviada. Transfira as células de cada poço para uma placa de cultura contendo meio de cultura pré-aquecido.Essas células-tronco mesenquimais são cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS. As amostras controle que não foram eletroporadas são retiradas da mistura remanescente de plasmídeo celular e adicionadas a placas de cultura contendo a cultura pré-aquecida. Utilize meio de mesma composição que o usado com as células eletroporadas. Por fim, agite suavemente.Em seguida, toque levemente na placa para distribuir as células antes de colocá-la no incubador por 24 horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, antes de analisar a eficiência de transfeção e identificar quais condições de eletroporação são as melhores para o seu experimento. Uma vez identificadas as condições ótimas de eletroporação, há a opção de dois métodos de eletroporação para experimentos futuros. O pesquisador pode optar por eletroporar as células em placas de 96 poços ou em cubetas, uma amostra por vez.As cubetas só podem analisar uma amostra por vez e exigem quatro vezes o volume necessário para um poço das placas de 96 poços, mas as cubetas individuais são menos caras e fáceis de usar quando é necessário um pequeno número de amostras. O sistema Gene Pulse ou MX Cell é projetado para que se possa usar as mesmas configurações de eletroporação nas placas e nas cubetas desta vez. Em vez da câmara de placa, utilize o MXL Shock Pod para cubetas.Desconecte a câmara de placas da parte traseira do instrumento e conecte o módulo de choque. Como o módulo de choque fornece apenas o pulso programado para o conjunto de poços A, B, C, D um, talvez seja necessário selecionar um programa diferente. Para selecionar um programa previamente salvo, pressione início.Em seguida, selecione a opção três, protocolos do usuário. Se você já estiver na pasta de usuário correta, pressione enter para selecionar os protocolos do usuário e role para baixo. Para destacar o programa correto, pressione enter para selecionar esse programa.O instrumento está agora pronto. Agora que o programa foi selecionado, prepare as cubetas. A mistura de plasmídeo e MEFs é preparada da mesma maneira mostrada anteriormente.Carregue cada vet de 0,4 centímetro com o mesmo volume utilizado para um conjunto completo de poços. Nas placas de 96 poços. Como um conjunto de poços corresponde a quatro poços, foram utilizados 150 microlitros de tampão ou mistura celular por poço, totalizando 600 microlitros da mistura celular com plasmídeo por vet.Em seguida, coloque o vet na câmara da cápsula de choque, pressione pulso para aplicar o choque elétrico às células. Após a eletroporação, prossiga conforme o método de placa misturando as células e, em seguida, transfira alíquotas para placas de cultura celular preenchidas com meio pré-aquecido, configurando o controle. Agite suavemente a placa e dê leves batidas nas placas que não foram eletroporadas.Em seguida, deixe as células recuperarem por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono antes de analisar a eficiência de transfeção após a transfeção das células e o período de recuperação. Analise a eficiência de transfeção de forma qualitativa utilizando microscopia fluorescente de epifluorescência e de forma quantitativa utilizando citometria de fluxo. Células que foram eletroporadas com sucesso e que agora expressam o gene GFP aparecem verdes ao microscópio de epifluorescência, conforme mostrado aqui em um resultado típico bem-sucedido. A visualização das células em contraste de fase permite observar tanto as células transfectadas quanto as não transfectadas.Mostradas aqui estão as células que foram expostas ao pulso de eletroporação com a menor voltagem, de 200 volts. As células estão amplamente confluentes devido à alta densidade celular. O mesmo campo de visão em fluorescência epiluminescente mostra que várias células estão expressando o marcador GFP, mas estas representam apenas uma pequena porcentagem das células visíveis na imagem anterior obtida com 250 volts.O número total de células vivas observadas em contraste de fase diminui ligeiramente sob fluorescência epiluminescente. Podemos observar que o número de células expressando GFP aumentou na tensão mais alta aplicada, 375 volts. Existem menos células vivas visíveis, no entanto, uma grande porcentagem das células restantes está expressando GFP.Qual condição é ideal depende do delineamento experimental. Em alguns experimentos, o maior número de células transfectadas pode ser ideal. Em outros experimentos, a maior porcentagem de transfeção pode ser a melhor.Estamos interessados na porcentagem de células que são positivas para GFP em cada condição e na forma como essas porcentagens variam com o fluxo da idade celular. A citometria pode fornecer informações quantitativas sobre os resultados da transfeção em cada uma das diferentes condições de eletroporação. São apresentadas aqui as porcentagens de células que são positivas para GFP na passagem.Cinco células. Em cada uma das 12 condições de eletroporação, a porcentagem máxima de transfeção foi de aproximadamente 80% sob a maior tensão com decaimento exponencial. A condição de pulso seis e 70 sob o pulso de onda quadrada mais forte testado, condição 12, com as células passadas nove vezes antes da eletroporação.O padrão geral da porcentagem de transfeção é quase idêntico, mas com uma ligeira diminuição nas porcentagens de transfeção apresentadas. Abaixo estão as porcentagens de células GFP nas células da passagem 13, que mostram uma redução acentuada na porcentagem de transfeção em relação às células mais jovens. As porcentagens mais altas de transfeção foram aproximadamente a metade do valor alcançado com as células mais jovens, demonstrando a importância de utilizar células saudáveis logo após o isolamento.Acabei de mostrar como usar o sistema de eletroporação MXL para identificar as condições ideais para mapeamento por eletroporação ou outras linhagens celulares primárias. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar células saudáveis logo após o isolamento e de utilizar condições de eletroporação compatíveis com o tampão de eletroporação. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

using-gene-pulser-mxcell-electroporation-system-to-transfect-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este procedimento descreve como estabelecer culturas primárias de células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos e é seguido por transfecção usando o Gene Pulser sistema de eletroporação MXCell.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

Este procedimento descreve um método para o isolamento e cultura do órgão murino de Corti com ou sem o limbo espiral e neurônios do gânglio espiral. Nós também demonstrar um método para a expressão de um gene exógeno repórter no órgão de Corti explante por eletroporação.

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

Transfecção gênica por eletroporação é melhorada aproximadamente duas vezes quando a orientação do campo elétrico é alterado durante a aplicação do pulso, enquanto que a viabilidade das células não é afetado. O aumento da transfecção do gene é causada pelo aumento da área de membrana que é feito competentes para a entrada de DNA na célula.

Mudando a direção e orientação do campo elétrico Durante Elétrica Aplicação Pulsos melhora a transferência de Gene Plasmid In vitro</em

Este vídeo demonstra a técnica de eletroporação que introduz o DNA do plasmídeo codificador de proteínas fluorescentes em precursores de células granulares cerebelares primárias de camundongos.

Entrega de genes in vitro mediada por eletroporação: uma técnica de pulso elétrico para introduzir plasmídeos codificadores de proteínas repórter fluorescentes em células cultivadas

A eletroporação de próxima geração é um método eficiente para transfectar células Th17 humanas com pequenos RNAs para alterar a expressão gênica e o comportamento celular.

RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Desenvolvemos um protocolo para transfectar células epiteliais primárias de pigmento humano por eletroporação com o gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) usando o sistema de transposon da Bela Adormecida (SB). A transfecção bem-sucedida foi demonstrada pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR), immunoblotting e ensaio imunoenzimático (ELISA).

Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida

Aqui, apresentamos um protocolo de eletroporação in vitro reprodutível para manipulação genética de precursores primários de células de grânulo cerebelar (GCPs) que é econômico, eficiente e viável. Além disso, este protocolo também demonstra um método simples para o estudo molecular de vias primárias de sinalização de Ouriço dependentes de cílios em células GCP primárias.

Método de eletroporação eficiente e econômico para estudar vias de sinalização dependentes de cítio primário no precursor da célula de grânulo

Este protocolo descreve o procedimento de edição do genoma em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos usando complexos ribonucleoprotéicos Cas9-sgRNA montados in vitro e liberados por eletroporação.

Ruptura Gênica de Alta Eficiência em Macrófagos Primários Derivados da Medula Óssea Usando Complexos Eletroporados Cas9-sgRNA

Um protocolo detalhado é fornecido para o uso da tecnologia CRISPR / Cas9 para obter knock-in direcionado altamente eficiente de grandes construções multicistrônicas em células T humanas primárias por meio da via de reparo de DNA de junção de extremidade mediada por homologia (HMEJ). As células T projetadas com este protocolo adaptável ao cGMP mantêm excelente expansão celular, citotoxicidade e produção de citocinas.

Engenharia não viral de células T humanas primárias por meio de integração direcionada de junção de extremidade mediada por homologia de grandes modelos de DNA

A entrega de editores genômicos como RNAs é um meio particularmente potente de modificar os genomas das células primárias e linhagens celulares de mamíferos. O objetivo desse protocolo é entregar editores genômicos como mRNA em células e linhagens celulares primárias de mamíferos, seguido por sequenciamento e análise direcionados da Illumina para quantificar os resultados da edição.

Edição do Genoma em Células Primárias de Mamíferos por Eletroporação do RNA Editor

Aprenda a otimizar condições de eletroporação em fibroblastos embrionários de camundongo usando o sistema Gene Pulser MXcell. Este método permite testar múltiplas condições rapidamente para estudos de expressão gênica.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Explorar mais vídeos