Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

O objetivo geral deste protocolo é identificar as condições ideais de eletroporação para transfectar linhagens celulares primárias utilizando fibroblastos embrionários de camundongo ou mfs. Como exemplo, células MF e o ácido nucleico de escolha são carregados em uma placa de eletroporação de 96 poços acoplada ao sistema de células Gene Pulser MX, o que permite testar múltiplas condições de eletroporação em um único ensaio. Em experimentos de otimização, as células são cultivadas após a eletroporação e analisadas quanto à eficiência de transfeção.

Utilizando microscopia fluorescente em epifluorescência e citometria de fluxo, as condições de eletroporação mais eficientes podem então ser selecionadas para futuras transfeções. Olá, sou Adam McCoy, cientista sênior da Divisão de Expressão Gênica da BioRad Laboratories. Hoje vamos mostrar um procedimento para identificar facilmente as melhores condições de eletroporação para transfectar linhagens celulares primárias.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a expressão gênica nessas células. Hoje, estarei utilizando três números diferentes de passagem de MEFs ou fibroblastos embrionários de camundongo. Estou utilizando culturas com diferentes números de passagem por duas razões.

Primeiro, mostrarei quão importante é a saúde celular. Com linhagens celulares primárias, mesmo apenas alguns dias a mais em cultura podem fazer diferença na eficiência de transfeção. Em segundo lugar, quero demonstrar que o processo de identificação das melhores condições é o mesmo, mesmo que a eficiência de transfeção diminua com as células mais velhas. Seu experimento provavelmente não envolverá células de idades diferentes.

Você pode seguir o mesmo procedimento com o seu próprio desenho experimental. Se quiser comparar a expressão gênica em células controle e tratadas, você pode primeiro encontrar as melhores condições e depois realizar o seu experimento utilizando as condições que identificou. Ou então, pode fazer a sua otimização e o experimento em conjunto.

Como demonstrarei hoje, usarei um plasmídeo que codifica GFP para analisar a eficiência de transfeção por citometria de fluxo. Porém, o procedimento de eletroporação seria o mesmo mesmo que você esteja fazendo algo diferente, como introduzir irna e analisar a expressão gênica por PCR em tempo real. Então, vamos começar.

Os fibroblastos embrionários de camundongo, ou mets, utilizados neste protocolo são células aderentes. Assim, o primeiro passo no trabalho com essas células é destacá-las do fundo do frasco utilizando protocolos-padrão de cultura de tecidos que envolvem a tripsinização. Após as células se desatacharem do frasco, neutralize a tripsina com meio contendo soro e colete as células em tubos cónicos de 50 mililitros.

Uma vez coletadas, centrifugue as células após a formação do pellet. Elas devem ser lavadas por ressuspendência, suspendendo-as em um volume conhecido de PBS. Após a ressuspendão completa, conte as células sabendo que será necessária uma concentração de 1 milhão de células por mililitro para experimentos de eletroporação.

Calcule o número apropriado de células com base na contagem celular e transfira-as para um tubo limpo. Centrifugue por mais tempo para obter o pellet celular. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante.

Re-suspenda as células no tampão de eletroporação até uma concentração de 1 milhão de células por mililitro e adicione 20 microgramas por mililitro do plasmídeo. As placas são divididas em 96 poços, com colunas numeradas de 1 a 12 e linhas de A a H; cada conjunto de quatro poços, ou conjunto de poços, compartilha um par de placas de eletrodos, de modo que as células nesses poços recebem o mesmo pulso. Por exemplo, os poços 1A, 1B, 1C e 1D estão eletricamente conectados em um único conjunto de poços e, portanto, receberiam todos o mesmo pulso.

O próximo conjunto de quatro poços, dois, A, B, C e D, receberia todos o segundo pulso quando o protocolo é iniciado, mesmo que os parâmetros possam ser os mesmos, a placa de eletroporação de 96 poços também é configurada de modo que a metade superior e inferior da placa seja dividida. Assim, os poços, um E, um F, um G e um H na parte inferior da placa, todos receberam um pulso. Mas é distinto do pulso recebido pelos poços um, A, B, C e D na parte superior.

Neste experimento, apenas metade da placa será utilizada. Os três primeiros poços de cada conjunto de poços contêm células de diferentes idades. As células da linha superior, linha A, foram subcultivadas cinco vezes.

As células da linha B foram subcultivadas nove vezes e as células da linha C foram subcultivadas 13 vezes. A linha D contém apenas tampão de eletroporação antes da eletroporação. É recomendável verificar o seu protocolo para garantir que as configurações estejam corretas.

Este protocolo fornecerá seis pulsos de decaimento exponencial seguidos por seis pulsos de onda quadrada. Os pulsos de decaimento exponencial aumentam de 200 volts a 450 volts e todos utilizam apenas 350 microfurões. Devido à baixa resistência do tampão de pulso genético ou de eletroporação utilizado.

Os pulsos de onda quadrada variam tanto em voltagem quanto na duração do pulso. A configuração de capacitância do instrumento precisa ser ajustada à condutância da mistura de eletroporação. Se estiver usando um tampão de maior resistência para a eletroporação, como o DMEM, o mesmo intervalo de voltagem pode ser utilizado, mas com uma capacitância maior, como 950 microferrets para os pulsos de decaimento exponencial.

Se a capacitância ideal do tampão que você está usando não for conhecida, será necessário variar também a capacitância nas condições de eletroporação que estão sendo testadas. O próximo passo é carregar 150 microlitros da mistura de células e plasmídeo em cada poço utilizado neste experimento. O quarto poço de cada conjunto de poços utilizados é preenchido com tampão de eletroporação.

Após carregar a placa, coloque-a na câmara da placa MXL e feche a tampa. Em seguida, pressione pulsar para eletroporar as células. O eletroporador aplica os pulsos elétricos sequencialmente a cada poço, conforme as condições especificadas no protocolo escolhido.

Leva alguns segundos para eletroporar todas as células. Após o pulso ser concluído, remova a placa da câmara de placas mista enviada. Transfira as células de cada poço para uma placa de cultura contendo meio de cultura pré-aquecido.

Essas células-tronco mesenquimais são cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS. As amostras controle que não foram eletroporadas são retiradas da mistura remanescente de plasmídeo celular e adicionadas a placas de cultura contendo a cultura pré-aquecida. Utilize meio de mesma composição que o usado com as células eletroporadas. Por fim, agite suavemente.

Em seguida, toque levemente na placa para distribuir as células antes de colocá-la no incubador por 24 horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, antes de analisar a eficiência de transfeção e identificar quais condições de eletroporação são as melhores para o seu experimento. Uma vez identificadas as condições ótimas de eletroporação, há a opção de dois métodos de eletroporação para experimentos futuros. O pesquisador pode optar por eletroporar as células em placas de 96 poços ou em cubetas, uma amostra por vez.

As cubetas só podem analisar uma amostra por vez e exigem quatro vezes o volume necessário para um poço das placas de 96 poços, mas as cubetas individuais são menos caras e fáceis de usar quando é necessário um pequeno número de amostras. O sistema Gene Pulse ou MX Cell é projetado para que se possa usar as mesmas configurações de eletroporação nas placas e nas cubetas desta vez. Em vez da câmara de placa, utilize o MXL Shock Pod para cubetas.

Desconecte a câmara de placas da parte traseira do instrumento e conecte o módulo de choque. Como o módulo de choque fornece apenas o pulso programado para o conjunto de poços A, B, C, D um, talvez seja necessário selecionar um programa diferente. Para selecionar um programa previamente salvo, pressione início.

Em seguida, selecione a opção três, protocolos do usuário. Se você já estiver na pasta de usuário correta, pressione enter para selecionar os protocolos do usuário e role para baixo. Para destacar o programa correto, pressione enter para selecionar esse programa.

O instrumento está agora pronto. Agora que o programa foi selecionado, prepare as cubetas. A mistura de plasmídeo e MEFs é preparada da mesma maneira mostrada anteriormente.

Carregue cada vet de 0,4 centímetro com o mesmo volume utilizado para um conjunto completo de poços. Nas placas de 96 poços. Como um conjunto de poços corresponde a quatro poços, foram utilizados 150 microlitros de tampão ou mistura celular por poço, totalizando 600 microlitros da mistura celular com plasmídeo por vet.

Em seguida, coloque o vet na câmara da cápsula de choque, pressione pulso para aplicar o choque elétrico às células. Após a eletroporação, prossiga conforme o método de placa misturando as células e, em seguida, transfira alíquotas para placas de cultura celular preenchidas com meio pré-aquecido, configurando o controle. Agite suavemente a placa e dê leves batidas nas placas que não foram eletroporadas.

Em seguida, deixe as células recuperarem por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono antes de analisar a eficiência de transfeção após a transfeção das células e o período de recuperação. Analise a eficiência de transfeção de forma qualitativa utilizando microscopia fluorescente de epifluorescência e de forma quantitativa utilizando citometria de fluxo. Células que foram eletroporadas com sucesso e que agora expressam o gene GFP aparecem verdes ao microscópio de epifluorescência, conforme mostrado aqui em um resultado típico bem-sucedido. A visualização das células em contraste de fase permite observar tanto as células transfectadas quanto as não transfectadas.

Mostradas aqui estão as células que foram expostas ao pulso de eletroporação com a menor voltagem, de 200 volts. As células estão amplamente confluentes devido à alta densidade celular. O mesmo campo de visão em fluorescência epiluminescente mostra que várias células estão expressando o marcador GFP, mas estas representam apenas uma pequena porcentagem das células visíveis na imagem anterior obtida com 250 volts.

O número total de células vivas observadas em contraste de fase diminui ligeiramente sob fluorescência epiluminescente. Podemos observar que o número de células expressando GFP aumentou na tensão mais alta aplicada, 375 volts. Existem menos células vivas visíveis, no entanto, uma grande porcentagem das células restantes está expressando GFP.

Qual condição é ideal depende do delineamento experimental. Em alguns experimentos, o maior número de células transfectadas pode ser ideal. Em outros experimentos, a maior porcentagem de transfeção pode ser a melhor.

Estamos interessados na porcentagem de células que são positivas para GFP em cada condição e na forma como essas porcentagens variam com o fluxo da idade celular. A citometria pode fornecer informações quantitativas sobre os resultados da transfeção em cada uma das diferentes condições de eletroporação. São apresentadas aqui as porcentagens de células que são positivas para GFP na passagem.

Cinco células. Em cada uma das 12 condições de eletroporação, a porcentagem máxima de transfeção foi de aproximadamente 80% sob a maior tensão com decaimento exponencial. A condição de pulso seis e 70 sob o pulso de onda quadrada mais forte testado, condição 12, com as células passadas nove vezes antes da eletroporação.

O padrão geral da porcentagem de transfeção é quase idêntico, mas com uma ligeira diminuição nas porcentagens de transfeção apresentadas. Abaixo estão as porcentagens de células GFP nas células da passagem 13, que mostram uma redução acentuada na porcentagem de transfeção em relação às células mais jovens. As porcentagens mais altas de transfeção foram aproximadamente a metade do valor alcançado com as células mais jovens, demonstrando a importância de utilizar células saudáveis logo após o isolamento.

Acabei de mostrar como usar o sistema de eletroporação MXL para identificar as condições ideais para mapeamento por eletroporação ou outras linhagens celulares primárias. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar células saudáveis logo após o isolamento e de utilizar condições de eletroporação compatíveis com o tampão de eletroporação. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.