Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

Olá, sou Mark Parker. Bem-vindo ao Laboratório Eaton Peabody na Enfermaria de Olhos e Ouvidos de Massachusetts em Boston, Massachusetts. Hoje vamos apresentar um protocolo para o isolamento e cultura primária do órgão marinho do kti.

Este protocolo é fundamental em nosso trabalho, pois permite a análise in vitro do órgão essencial para a audição. Para destacar a utilidade dessa abordagem, também demonstraremos um dos muitos usos dos órgãos em nosso laboratório, a eletroporação de genes exógenos nos explantes cultivados. Vamos trabalhar.

O esboço deste procedimento é o seguinte, camundongos neonatais serão decapitados e seus ossos temporais removidos usando dissecção romba. Em seguida, a cóclea será isolada do osso temporal por meio de dissecção romba. O labirinto ósseo da cóclea será então aberto com uma pinça e o ligamento espiral será removido do modo interno da cóclea.

Finalmente, o ligamento espiral será separado do órgão de corde usando uma pinça, rosas translúcidas de células ciliadas podem ser vistas correndo ao longo do comprimento do órgão de kti. Uma parte da membrana do RISE, que foi rompida durante a remoção do ligamento espiral, pode ser vista percorrendo todo o comprimento do lado modular. Como exemplo da utilidade deste procedimento, os explantes de corda de órgãos serão cultivados por 24 horas e, em seguida, eletroporados com um gene repórter fluorescente exógeno.

As etapas iniciais desse procedimento envolvem a preparação das placas de cultura. Coloque uma lamínula de vidro esterilizada que foi armazenada em etanol a 70% em dois poços de uma placa de cultura de células de quatro anéis pré-esterilizada. O uso de apenas dois dos quatro poços limitará a quantidade de tempo que as culturas ficam fora da caixa da incubadora.

A lamínula é preenchida com a solução constituída por poli l ornitina e laminina um-para-um. Suplementado com soro bovino fetal 20%, colocou a placa de cultura dentro de uma placa maior de 10 centímetros para facilitar sua transferência e, em seguida, incubou durante a noite a 37 graus Celsius. Finalmente, esterilize por calor as ferramentas de seção em uma incubadora de 150 graus Celsius durante a noite.

Esterilize a capa de dissecção de fluxo positivo ligando a luz UV por 20 minutos antes do início da dissecção. Esterilize o espaço de trabalho dentro da coifa pulverizando todas as superfícies com etanol 70%. Coloque a cabeça de um filhote de rato decapitado em uma placa de Petri contendo 70% de etanol e, em seguida, remova a epiderme usando uma lâmina de bisturi.

Abra o crânio ao longo da sutura sagital usando uma lâmina de bisturi e, em seguida, corte o cérebro ao meio. Guarde o prosencéfalo para dissecação adicional. Remova o prosencéfalo, cerebelo e tronco encefálico usando dissecção romba.

Observe a localização do osso temporal em forma de parametal no lado lateral inferior do crânio. Transfira os ossos TAL para um prato de três milímetros contendo solução estéril de sal de bola de meada. A dissecção restante deve ser conduzida sob um microscópio de dissecação.

Remova qualquer tecido circundante do osso temporal. Localize a cóclea em forma de concha e remova-a do sistema vestibular usando uma pinça. Nesse estágio de desenvolvimento, o labirinto ósseo não é completamente calcificado e é facilmente dissecado.

Remova o labirinto ósseo da cóclea por separação cuidadosa, começando na extremidade basal e movendo-se apicalmente. Usando uma pinça, remova cuidadosamente o ligamento espiral e o epitélio sensorial anexado do modis, prendendo-o na região do gancho da base usando uma pinça e desenrolando-o. À medida que você se move aply Começando na base, remova o ligamento espiral do epitélio sensorial usando uma pinça fina número 55.

Em alguns de nossos experimentos, a remoção do limbo espiral do epitélio sensorial é desejada. Neste procedimento de micro ol isolado, o órgão de cordi é isolado do limbo espiral usando duas seringas de insulina de meio cc como fórceps. Primeiro, a região do gancho do cordo do órgão é removida usando as seringas de insulina.

Em seguida, o limbo espiral é separado da fileira de células ciliadas internas começando no ápice e procedendo basalmente ou todo o órgão de Corte com limbo espiral anexado. O epitélio sensorial micro-isolado ou o limbo espiral micro-isolado podem ser cultivados da seguinte forma, remova a solução de revestimento dos poços de cultura e substitua-a por 130 microlitros de meios de cultura contendo 10% de transferência de soro, o órgão dissecado do corde para a lamínula de vidro revestida na cultura. Bem, descobrimos que as técnicas a seguir ajudam a garantir que o órgão de corti não flutue no meio de cultura, mas permaneça afixado na lamínula.

Primeira camada, a tampa de vidro desliza conforme descrito. Em segundo lugar, remova a mídia para afixar a explicação no prato revestido. Isso garantirá o contato entre a placa de cultura e a explicação X.

Terceiro, oriente o explane de forma que os cílios das células ciliadas fiquem voltados para cima. Essa orientação facilitará a aderência do explan ao prato cultivado. Por fim, adicione 130 microlitros de meio de cultura de soro usando uma pipeta de 200 microlitros, pingando cuidadosamente duas gotas na superfície do acordo do órgão e, em seguida, adicionando lentamente o volume restante ao lado do poço, mova cuidadosamente a explicação para uma incubadora e, em seguida, incube a 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono.

Essas culturas podem ser mantidas por sete a 10 dias. Existem inúmeras aplicações para o órgão isolado do núcleo T. Alguns exemplos incluem a análise da expressão gênica usando R-T-P-C-R ou NC duas hibridização, órgão de cultura de cortico com células ganglionares espirais ou células-tronco exógenas ou a análise in vitro da morte de células ciliadas. Para demonstrar a utilidade deste procedimento, mostraremos uma técnica comumente usada em nosso laboratório para expressar genes exógenos nas culturas explan.

Para esta demonstração, o órgão isolado de corti será eletroparado com um vetor de expressão que expressa constitutivamente o gene repórter vermelho DS. Após a eletroporação, as culturas serão incubadas com alguns reagentes de transfecção do gene seis por 24 horas para aprimorar o procedimento de transfecção. Usando este sistema, as células transfectadas exibirão uma fluorescência vermelha citoplasmática dentro de 24 horas.

Primeiro, prepare uma proporção de três para dois do reagente de transfecção do gene FU seis para direcionar o DNA em um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de três mililitros. Em uma capela de fluxo laminar, remova os meios de cultura do órgão de horticultura. Adicione 130 microlitros de água por um minuto e depois remova usando uma pipeta com capacidade de 200 microlitros.

Em seguida, adicione 30 microlitros de plasmídeo repórter vermelho DS, que é armazenado em uma solução estoque de dois miligramas de DNA de plasmídeo por mililitro de água. Para eletroporação, usamos um Pulser Excel do gene BioRad para gerar o pulso elétrico. Os eletrodos foram personalizados por nossa oficina mecânica para atender aos nossos propósitos, os eletrodos consistem em arame desencapado dobrado em um ângulo de 90 graus e foram cravados em forma de pá.

Avance os eletrodos do eletro usando um micromanipulador para que o ânodo e o cátodo fiquem em ambos os lados da cultura. Gere 10 trens de pulso consistindo em 27 volts e 30 milissegundos de duração para eletropurar o gene repórter na cultura explan de acordo com o órgão. Em seguida, aguarde cinco minutos.

Em seguida, adicione 130 microlitros da solução de DNA do gene FU seis ao explan, e então incube a 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, adicione dois mililitros de soro à cultura, meio em cada placa. As culturas explan podem ser mantidas por seis ou mais dias após 24 horas.

As células transfectadas podem ser visualizadas usando um filtro SI três em um microscópio epifluorescente. Acabamos de mostrar um método para o isolamento e cultura primária do órgão Corte. Este método funciona com camundongos tão jovens quanto o dia embrionário 16 até o dia pós-natal, momento em que a cóclea se torna suficientemente calcificada para tornar a dissecção complicada.

Além disso, demonstramos um método para a expressão de genes exógenos no órgão cultivado de corde. Este é um exemplo de um tipo de experimento que pode ser conduzido no explan cultivado. Sem dúvida, há uma infinidade de usos para esta técnica.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.