Name: Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: Aprenda a isolar neutrófilos do sangue humano e induzir a formação de NETs usando estímulos químicos ou biológicos. Visualize as estruturas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de varredura para estudar respostas imunes.

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1. PMN de isolamento do sangue humano Use cerca de 24 ml de sangue humano com EDTA ou heparina (10 U / ml) como anticoagulante. <ol><li> Adicionar 6 ml Histopaque 1119 a um tubo de Falcon 15 ml e cuidadosamente camada ml de sangue 5-7 todo em cima. </li><li> Centrifugar por 20 minutos a 800 xg sem travões. </li><li> Aspirar e descartar amarelada e clara camada superior e inferior de transferência de fase avermelhada contendo granulócitos em tubos Falcon fresco. </li><li> Lave as células através do preenchimento de tubos Falcon com PBS e centrifugar por 10 minutos a 300 x g. </li><li> Nesse meio tempo preparar uma solução Percoll 100% através da mistura de 18 ml Percoll com 2 ml de PBS 10x. Com PBS 1x preparar quatro soluções ml de 85%, 80%, 75%, 70% e Percoll 65%. </li><li> Prepare 2 tubos Falcon com um gradiente de Percoll por camadas de 2 ml de cada porcentagem em cima uns dos outros em ordem decrescente. </li><li> Após a centrifugação remover o sobrenadante, combine pelotas e ressuspender as células sedimentadas em 4 ml de PBS. </li><li> Cuidadosamente camada 2 ml da ressuspensão em cada um dos gradientes. </li><li> Centrifugar por 20 minutos a 800 xg sem travões. </li><li> Após a centrifugação remover camada superior ea maioria dos 65% da camada de PBMCs e recolher com interfase branco restante até 85% da camada em tubos Falcon nova. </li><li> Lave as células por encher os tubos Falcon com PBS e centrifugar por 10 minutos a 300 x g. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as células sedimentadas (geralmente&gt; 95% são PMN) em 2 ml de PBS. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitômetro. </li></ol> 2. PMNs ativando <ol><li> Prepare uma placa de 24 poços de cultura de células, colocando uma estéril 13 milímetros rodada lamínula de vidro (# 1,5) em cada poço </li><li> Semente de 2 x 10 5 células em 500μl RPMI (contendo 2% de soro humano de albumina) por poço e incubar por 1h em incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Enquanto isso, prepare a 600 nM solução PMA em RPMI e adicionar 100μl de células por poço. Incubar de 15 min até 4 h em incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Fix células em 4% (concentração final) paraformaldeído dissolvido em PBS. </li></ol> PMA serve como um controle positivo e é até agora o agente mais potente para induzir a formação de NET. Alternativamente, outros estímulos ou co-cultivo com patógenos podem ser utilizados para a indução NET. Do respectivo estatuto de formação NET pode ser verificado quando o curso do tempo é de continuar, se forem complementares amostras paralelas estão preparados. Se um corante de DNA não-permeante como Sytox Green (Invitrogen) é adicionada às células não-fixa, apenas DNA extracelular será detectado. Desde a formação de novas redes é de alguma forma prejudicada na presença de Sytox, para cada ponto do tempo uma amostra paralela tem que ser usado. 3. NET detecção por imunomarcação NET são muito frágeis, mesmo após a fixação e tem que ser manipulado com muito cuidado, caso contrário, a maioria vai ficar perdido durante a preparação. <ol><li> Remova cuidadosamente lamínulas de vidro com células anexado a partir de 24 poços placa de cultura, levantando-a na borda com uma agulha curva e aproveitá-la com uma pinça fina. Coloque a lamínula de cabeça para baixo em uma gota de PBS. Isto pode ser feito em uma folha Parafilm cobrindo uma posição tubo de ensaio. Lavar 3 vezes como esta por 5 min. </li><li> Incubar lamínulas da mesma maneira em uma queda de 0,5% Triton X-100 por 1 min em temperatura ambiente para permeabilizar as células. Lavar 3 vezes em PBS por 1 min. </li><li> Prepare uma câmara úmida com Parafilm e um tecido molhado. Lay a tampa desliza de cabeça para baixo em uma gota de tampão de bloqueio (5% burro soro) e incubar por 30 min a 37 ° C. </li><li> Diluir anticorpos primários, por exemplo, ms anti Histon rb e anti elastase neutrofílica, em tampão de bloqueio. </li><li> Transferência de capa desliza na câmara úmida diretamente do tampão de bloqueio em uma gota de anticorpo primário e incubar por 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar 3 vezes por 5 minutos com PBS. </li><li> Diluir anticorpos secundários, por exemplo dk anti ms Cy2 e dk anti rb Cy3, em tampão de bloqueio. </li><li> Transferência de capa desliza para dentro da câmara úmida em uma gota de anticorpo secundário e incubar por 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar 3 vezes por 5 minutos com PBS. Dependendo das suas opções de microscopia de fluorescência, o DNA da mancha por 5 min ou com Hoechst 33342 (1 mg / ml), que vai precisar de excitação UV ou com DRAQ5 para excitação muito vermelho e lavar duas vezes com dist. água. </li><li> Definir uma gota de 20μl Mowiol numa lâmina de vidro e montar lamínulas com as células de cabeça para baixo. As células têm que ser entre a lamínula ea lâmina. A queda de Mowiol formará uma fina camada de espessura homogênea quando a lamínula é posicionado sobre a queda. Normalmente, não há necessidade de pressionar a amostra. Se você quiser usar lentes não-imersão, a amostra está pronta para a inspeção.Para análise microscópica com lentes de imersão, deixe a amostra secar por cerca de uma hora até que o Mowiol solidificou na borda da amostra. </li></ol> 4. NET preparando para Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) <ol><li> Pós corrigir células na tampa de vidro desliza em 24 poços da placa com glutaraldeído 2,5%. </li><li> Remova folhas tampa de vidro contendo células de 24 poços placa de cultura e colocar de cabeça para baixo em uma gota de água. Lavar 3 vezes como esta por 5 min. </li><li> Transferência de lamínulas de volta para 24 poços da placa de cultura de células contendo 0,5% OsO4 e incubar por 30 min. </li><li> Remova folhas tampa de vidro contendo células de 24 poços placa de cultura e colocar de cabeça para baixo em uma gota de água. Lavar 3 vezes como esta por 5 min. </li><li> Transferência de lamínulas de volta para 24 poços da placa de cultura de células contendo 1% de ácido tânico e incubar por 30 min. </li><li> Repita os passos de 4,2-4,4 </li><li> Desidratar através do seguinte esquema (5min cada): <ul><li> Etanol 30% </li><li> Etanol a 50% </li><li> Etanol 70% </li><li> Etanol 80% </li><li> Etanol 90% </li><li> Etanol 100% </li><li> Etanol 100% </li><li> Etanol 100% </li></ul></li><li> Transferência de capa desliza em secador de ponto crítico e amostras secas. </li><li> Superfície da camada de amostra com camada de platina / carbono 5nm usando evaporador camada fina </li></ol> 5. Resultados representativos: O método de isolamento geralmente produz unstimulated neutrófilos viável com uma pureza superior a 95%. Quando fixado em diferentes momentos após a estimulação, o protocolo imunocoloração mostra a seqüência de alterações morfológicas durante o celular NETosis achatamento, perda de lóbulos nuclear, perda de grânulos e integridade núcleo que conduz a uma crescente sobreposição de armas nucleares (ou seja, histona) e granular (ie A elastase neutrofílica coloração). Este protocolo pode servir como ponto de partida para analisar as interações específicas de patógenos com neutrófilos. Essa interação pode ser dissecada em maior detalhe utilizando o protocolo de preparação para microscopia eletrônica de varredura. Fluorescência NET Amostra de neutrófilos estimulados manchada para componentes de NET (azul = DNA, histona vermelho = verde = elastase neutrofílica). As imagens mostram, além da localização NET, a localização nuclear do DNA e as histonas eo padrão granular para a elastase neutrofílica. SEM estimulação PMA Micrografia eletrônica de varredura mostrando neutrófilos não estimulados e PMA-estimulado. Após a estimulação, os neutrófilos achatar e produzir NETs. SEM NET e Shigella Maior resolução de imagem SEM de bactérias Shigella presos em redes.

<ol><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.</li>
<li>Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+capture+and+kill+Candida+albicans+yeast+and+hyphal+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.</a> Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).</li>
<li>M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+amazonensis+promastigotes+induce+and+are+killed+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps.</a> PNAS. 106, 6748-6753 (2009).</li>
<li>Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+expression+allows+the+pathogen+group+A+Streptococcus+to+escape+killing+in+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps.</a> Curr Biol. 14, 396-400 (2006).</li>
<li>Fuchs, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).</li>
<li>Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+spontaneous+apoptosis+of+neutrophil+granulocytes+by+the+intracellular+parasite+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major.</a> J Immunol. , 169-898 (2002).</li>
</ol>

O protocolo permitirá que desde o isolamento de neutrófilos não estimulados a pureza considerável, a indução da formação de NET e da análise das alterações morfológicas durante NETosis. Ao manusear as amostras com cuidado, ou seja, evitando duras condições de lavagem, que resultará na perda da maioria dos NETs frouxamente ligados, a quantidade de formação NET em condições diferentes de estimulação (duração, de estímulo) podem ser comparados. A este respeito, os protocolos fornecidos podem servir como ponto de partida para estabelecer métodos para analisar cenários mais sofisticados: interações de neutrófilos / patógeno, a seqüência de estímulos, interação com outras células do sistema imunológico.

neutrófilos traps extracelular: como gerar e visualizá-los

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Granulócitos neutrófilos são o grupo mais abundante de leucócitos no sangue periférico. Como fagócitos profissionais, eles bactérias engolir e matá-los intracelularmente quando seu fusível grânulos antimicrobiana com o fagossomo. Descobrimos que os neutrófilos têm uma maneira adicional de matar microorganismos: após a ativação, liberam proteínas granulares e cromatina que juntos formam as fibras extracelulares que se ligam patógenos. Estas novas estruturas, ou neutrófilos Traps Extracelular (NET), degradam fatores de virulência e matar as bactérias 1, fungos e parasitas 2 3. A espinha dorsal estrutural da NET é o DNA, e eles são rapidamente degradados na presença de DNases. Assim, as bactérias expressando DNases são mais virulentas 4. Usando a microscopia correlativos combinando TEM, SEM, técnicas de imagem de imunofluorescência e de células vivas, poderíamos mostrar que com a estimulação, os núcleos de neutrófilos perdem sua forma e eu e heterocromatina homogeneizar. Mais tarde, o envelope nuclear e as membranas grânulos desintegrar permitindo a mistura de componentes NET. Finalmente, as redes são lançadas como as quebras de membrana celular. Este programa de morte celular (NETosis) é distinta da apoptose e necrose e depende da geração de espécies reativas de oxigênio pela NADPH oxidase 5. Neutrófilos armadilhas extracelular são abundantes nos locais de inflamação aguda. NET parecem ser uma forma de resposta imune inata que os microorganismos se ligam, evitar a sua disseminação, e garantir uma alta concentração local de agentes antimicrobianos para degradar fatores de virulência e matar agentes patogênicos, permitindo assim neutrófilos para cumprir sua função antimicrobiana, mesmo para além do seu tempo de vida. Há crescentes evidências, no entanto, que as redes também estão envolvidos em doenças que vão desde auto-imune síndromes à infertilidade 6. Descrevemos métodos para isolar Granulócitos neutrófilos de sangue periférico humano 7 e estimulá-los a formar redes. Também incluímos protocolos para visualizar a NET em microscopia óptica e eletrônica.

Neutrófilos Traps Extracelular (NET) são um mecanismo inato importante imunológico para combater as bactérias patogênicas, fungos e parasitas. Aqui nós descrevemos métodos para isolar granulócitos neutrófilos do sangue humano e para ativá-las para formar redes. Nós apresentamos técnicas de preparação para visualizar NETs em microscopia óptica e eletrônica.

Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Os granulócitos neutrófilos são o grupo mais abundante de leucócitos no sangue periférico. Como fagócitos profissionais, eles englobam bactérias e as eliminam...

Armadilhas extracelulares de neutrófilos ou redes são um mecanismo recentemente identificado para a eliminação de patógenos mediada por neutrófilos, que liberam uma combinação de proteínas citoplasmáticas e de grânulos, além de cromatina, formando fibras extracelulares que aprisionam patógenos. Neste vídeo, granulócitos são isolados de sangue total humano por centrifugação em gradiente de densidade histopatológico. Neutrófilos são isolados da preparação de granulócitos por gradiente Percoll.Após a centrifugação, as células são semeadas em lamínulas e estimuladas a formar redes utilizando estímulos químicos ou biológicos; em seguida, são processadas para imunomarcação ou ME para visualização das redes. Olá, sou Christian Gosman da unidade de microscopia do Instituto Max Plank de Biologia da Infecção. Hoje vamos mostrar um procedimento para purificar granulócitos neutrófilos a partir de sangue humano e estimulá-los a gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos ou redes.Em seguida, visualizaremos as redes por imunofluorescência e microscopia eletrônica de varredura. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os mecanismos que levam à formação das redes e para analisar as propriedades antimicrobianas das redes. Então, vamos começar.Inicie este protocolo em uma cabine de fluxo laminar preparando seis mililitros de histo 1119 em cada um dos quatro tubos Falcon de 15 mililitros. Sobreponha cuidadosamente cinco a sete mililitros de sangue total sobre o histo em cada tubo, centrifugue os tubos por 20 minutos a aproximadamente 800 vezes G, garantindo que a frenagem esteja desativada assim que a centrifugação for concluída. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga.O tubo conterá quatro camadas claramente separadas de cima para baixo. São elas: uma camada vermelho-escura contendo eritrócitos, uma camada vermelho-claro contendo granulócitos neutrófilos com alguns eritrócitos, uma camada esbranquiçada-amarelada contendo leucócitos e soro, e uma camada amarelo-claro de soro.Novamente, trabalhando na cabine de fluxo laminar. Use o perpet acoplado a um sistema de vácuo para aspirar cuidadosamente a camada amarela superior. Em seguida, utilizando uma pipeta, transfira a fase avermelhada contendo granulócitos de cada tubo para um novo tubo tipo falcon.Em seguida, encha os tubos com PBS para lavar os granulócitos. Em seguida, pelletize-os por centrifugação durante 10 minutos a cerca de 300 vezes G enquanto as células estão girando. Prepare uma solução de per coll a 100% misturando 18 mililitros de per co com dois mililitros de PBS 10 vezes. Em seguida, utilize a solução 100% per coll e PBS uma vez para preparar quatro mililitros de cada uma das concentrações 65, 70, 75, 80 e 85% per call. Use essas soluções para preparar gradientes per core, adicionando cuidadosamente dois mililitros de cada solução em cada um de dois tubos. Comece colocando dois mililitros da solução 85% em cada tubo.Em seguida, sobre a camada de 85% per coll, sobreponha cuidadosamente dois mililitros da solução de 80% per co. Continue sobrepondo dois mililitros de cada solução em ordem decrescente, de modo que a solução de 65% seja colocada na camada superior. Remova os leucócitos sedimentados do centrífugo sob a capela.Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de PBS. Em seguida, combine as células ressuspendidas em um tubo novo. Deite cuidadosamente dois mililitros das granulócitos ressuspendidos sobre cada um dos gradientes de perol.Em seguida, centrifugue por 20 minutos a cerca de 800 × g, garantindo que a desaceleração esteja desativada após a centrifugação. As interfaces devem ser claramente visíveis devido à maior densidade celular. Descarte a camada superior e a maior parte da camada de 65%, que contêm células mononucleares do sangue periférico ou pBMCs.Coletar a interface 65%-70%, juntamente com as interfaces 70%-75% e 80%-85% de cada gradiente, e transferi-las para novos tubos cónicos. Lavar as células preenchendo o tubo com PBS e centrifugar por 10 minutos a aproximadamente 300 × g para formar o pellet celular após a centrifugação. Remover o sobrenadante e ressuspender os leucócitos polimorfonucleares ou neutrófilos sedimentados em dois mililitros de PBS.Neste ponto, 95% ou mais das células no preparo serão MNs. Utilizando um hemocitômetro, determine a contagem de células e, em seguida, plaque 200.000 células em 500 microlitros de RPMI sobre lamínulas redondas estéreis colocadas em placas de cultura com poços de 15 milímetros de diâmetro. Incube por uma hora em uma estufa com 5% de CO2 a 37 graus Celsius para permitir que as células adiram às lamínulas após uma hora.Adicione 100 microlitros de RPMI contendo o estimulante desejado. Para um experimento de curso temporal, adicione o estimulante sequencialmente, começando com o tempo de estimulação mais longo para cada ponto temporal condicional. Certifique-se de preparar um controle positivo adicionando 600 nano molares de PMA em RPMI.Além disso, para cada condição ou ponto temporal, prepare um controle negativo adicionando apenas RPMI, incube por até quatro horas em um incubador de CO2 a 37 graus Celsius. Durante a estimulação, a formação de redes pode ser monitorada usando microscopia de campo claro. Logo após a estimulação, os núcleos mudam drasticamente de forma. Eles perdem seus LOEs, ficam arredondados e, em seguida, expandem-se no ponto temporal desejado com 600 microlitros de solução de paraformaldeído a 8% em temperatura ambiente em cada poço.Para atingir uma concentração final de 4%, incubar por duas a quatro horas para marcação imunológica. Coloque uma folha de paraforma sobre um suporte para tubos de ensaio com três vezes oito orifícios de aproximadamente 15 milímetros de diâmetro. Para formar poços, encha os poços com PBS.Use uma agulha curva para levantar cada lamínula do paraldeído na placa de cultura. Em seguida, com pinça, segure a lamínula e inverta-a sobre a superfície de uma gota de PBS no paraforma. Neste momento, as armadilhas extracelulares de neutrófilos são muito frágeis e deve-se ter muito cuidado durante a manipulação para evitar perda celular.Após cinco minutos, repita a lavagem transferindo as lamínulas para novas gotas de PBS. Repita por um total de três lavagens. Em seguida, transfira as lamínulas para uma gota de Triton X-100 0,5% à temperatura ambiente por um minuto para permeabilizar as células.Em seguida, lave três vezes em PBS por um minuto cada, após a lavagem. Prossiga com a coloração de acordo com o protocolo escrito fornecido. Realize cada uma das incubações e etapas de lavagem invertendo a lamínula sobre o paraforma.Uma vez que as células tenham sido coradas, coloque uma gota de 20 microlitros de MO sobre uma lâmina de vidro e monte as lamínulas com a face voltada para baixo, deixando as células entre a lamínula e a lâmina. Após uma hora, o MOY deverá ter solidificado e as células estarão prontas para análise microscópica. Com lentes de imersão, prepare as células para microscopia eletrônica de varredura sob uma capela de exaustão química.Pós-fixe as células nos lamínulas de vidro em uma placa de 24 poços com 2,5% de glutaraldeído em PBS por 30 minutos. Durante a incubação, coloque uma folha de paraform sobre um tubo de ensaio. Posicione com três fileiras de oito orifícios de aproximadamente 15 milímetros de diâmetro.Para formar poços. Preencha os poços com água destilada. Use uma agulha curva para levantar cada uma das lamínulas da solução de glutaraldeído.Em seguida, utilizando pin&ccedil;as, segure a lam&iacute;nula e transfira-a para uma gota de &aacute;gua destilada no Paraform, transferindo as lam&iacute;nulas para gotas de &aacute;gua destilada no Paraform. Repita por um total de tr&ecirc;s lavagens, cinco minutos cada, transfira as lam&iacute;nulas de volta para os po&ccedil;os da placa de cultura celular contendo tetr&oacute;xido de &oacute;smio 0,5% em &aacute;gua destilada e incube por 30 minutos &agrave; temperatura ambiente. Remova as lam&iacute;nulas da placa e lave tr&ecirc;s vezes em &aacute;gua destilada como anteriormente.Em seguida, devolva-os à placa de 24 poços com 0,5 mililitros de ácido tânico 1% em cada poço e incube por 30 minutos. A seguir, lave as lamínulas três vezes, cinco minutos cada. Então, repita a fixação com tetróxido de ósmio e a lavagem.Em seguida, cubra o tubo de ensaio. Coloque sobre uma nova peça de parafina. Desidrate as células por meio de uma série de incubações nas seguintes soluções de etanol por cinco minutos cada: 30, 50, 70, 80, 9100, 100.E finalmente, mais uma vez em etanol a 100%. Mergulhe o suporte em um recipiente para espécimes cheio de etanol. Coloque rapidamente as lamínulas no suporte metálico, certificando-se de que os espécimes não sequem.Em seguida, transfira o barquinho do espécime para um secador de ponto crítico resfriado ou CPD. Encha a câmara do CPD com CO₂ líquido. Mantenha a válvula de entrada totalmente aberta para manter o nível do líquido e, assim que uma fase de etanol se tornar visível sob a fase de CO₂ na parte inferior da câmara, abra a válvula de drenagem na base.Para remover a maior parte do etanol. Deixe a câmara ser lavada por cerca de 30 minutos. Após a lavagem, feche a válvula de entrada e reduza o nível do líquido para logo abaixo do topo do barquinho.Passe água quente através do casaco do CPD. Quando a temperatura atingir de 36 a 38 graus Celsius e a pressão aumentar para 1.200 libras por polegada quadrada, a linha de separação entre o líquido e o gás desaparecerá e as amostras estarão acima do ponto crítico. Uma vez atingido o ponto crítico, libere o gás lentamente durante um período de cinco minutos.Para evitar condensação, a temperatura deve permanecer em torno de 40 graus Celsius. Durante esse período, abra a porta e remova o barquinho. Confirme que o solvente desidratante evaporou.Coloque as lamínulas com o lado certo para cima sobre o adesivo do suporte de espécime de alumínio e transfira-as para o sistema de revestimento de alta resolução. Evacue o cilindro de revestimento até duas vezes 10 à potência de menos cinco milibares. Em seguida, ajuste o instrumento para 1,8 quilovolts e 70 miliampères, e monitore a espessura da camada de carbono platon com um cristal de quartzo até que a camada atinja cinco nanômetros.Vente o cilindro de revestimento do sistema de revestimento de alta resolução. Em seguida, utilizando pinças, remova as amostras do coter. Restaure a câmara do MEV à pressão normal.Abra a porta. Em seguida, insira as amostras no porta-espécimes e evacue a câmara. Para análise por MEV.Quando fixados em diferentes momentos após a estimulação, as alterações morfológicas durante a NETose podem ser observadas por microscopia de imunofluorescência. Nesta figura, o DNA é mostrado em azul, o complexo de DNA em vermelho e a elastase de neutrófilos.Um marcador de grânulos é mostrado em verde durante a primeira fase da NETose, apenas na periferia nuclear de núcleos condensados. Posteriormente, quando a cromatina está mais descondensada, a maior parte do núcleo é corada nas redes descondensadas. A coloração é homogênea.Este conjunto de imagens detalha a sobreposição de coloração nuclear e granular que ocorre com a NETose. Esta micrografia eletrônica de varredura mostra neutrófilos não estimulados após estimulação com a bactéria Ella; os neutrófilos achatam-se e produzem armadilhas extracelulares de neutrófilos. Armadilhas. Aqui, uma bactéria do gênero Gel foi aprisionada nas redes.Bactérias como o gel são imobilizadas e mortas pelas enzimas presentes nas redes. Acabamos de mostrar como isolar granulócitos neutrófilos do sangue humano e estimulá-los para induzir a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos. Estas podem então ser analisadas posteriormente por imunofluorescência ou microscopia eletrônica de varredura.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as redes são muito frágeis mesmo após a fixação. Para minimizar a perda das redes, retiramos as lamínulas com os neutrófilos estimulados das cavidades da placa e realizamos a maior parte do procedimento sobre a superfície de gotas de tampão. Mesmo assim, é importante movimentar as amostras com cuidado e lentamente.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra a coloração fluorescente de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), os componentes do DNA extracelular expelidos pelos neutrófilos. Esta técnica permite a visualização da interação adesiva entre células cancerígenas e TNEs.

Microscopia de fluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs: uma técnica para observar a interação adesiva entre células cancerígenas e NETs

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para gerar e isolar armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs). Os neutrófilos são isolados do sangue periférico e estimulados com acetato de miristato de forbol (PMA) para produzir TNEs. Durante a incubação, os neutrófilos passam por um processo de morte celular (NETosis) para liberar NETs compreendendo cromatina descondensada misturada com proteínas citoplasmáticas granulares.

Uma técnica in vitro para gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos

Este vídeo demonstra a indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou TNEs em neutrófilos pré-marcados usando soro de paciente contendo anticorpos anticitoplasma de neutrófilos. Além disso, o uso de um corante de DNA impermeável e microscopia de fluorescência permite a visualização de NETs.

Indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em neutrófilos pré-marcados

Macrófago extracelulares armadilhas são uma entidade recentemente descrita. Este artigo se concentrará em métodos de microscopia confocal e como eles são visualizadas in vitro e em vivo de amostras do pulmão.

Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

Aqui, apresentamos um método no qual neutrófilos baixa densidade humanos (LDN), recuperados do líquido de lavagem peritoneal pós-operatórias, produzem maciço dos neutrófilos extracelulares armadilhas (redes) em armadilha eficientemente as células do tumor gratuito que crescem posteriormente.

Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e a operação NETQUANT, uma opção de software totalmente automática para quantificação de NETs em imagens de imunofluorescência.

Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

Este protocolo descreve um ensaio de neutrófilos armadilha extracelular (NET) altamente sensível e alta taxa de transferência para a quantificação semi-automático de ex vivo NET formação pela microscopia confocal tridimensional de imunofluorescência. Este protocolo pode ser usado para avaliar a formação de líquido e degradação após estímulos diferentes e pode ser usado para estudar terapias NET-alvo potenciais.

Um ensaio de alta produtividade para avaliar e quantificar a formação de neutrófilos extracelular armadilha

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas tridimensionais geradas por granulócitos estimulados de neutrófilos. Tornou-se claro nos últimos anos que as redes estão envolvidas em uma grande variedade de doenças. A detecção de redes no tecido pode ter relevância diagnóstica, sendo necessários protocolos padronizados para a rotulagem de componentes NET.

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) estão associadas a várias doenças, e a imunofluorescência é frequentemente usada para sua visualização. No entanto, existem vários protocolos de coloração e, em muitos casos, apenas um tipo de tecido é examinado. Aqui, estabelecemos um protocolo geralmente aplicável para coloração de NETs em tecido humano e de camundongo.

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Aprenda a isolar neutrófilos do sangue humano e induzir a formação de NETs usando estímulos químicos ou biológicos. Visualize as estruturas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de varredura para estudar respostas imunes.

Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

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