Name: Mismatch Repair imagem e respostas celulares a danos no DNA em Bacillus subtilis /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a visualizar reparação de DNA em Bacillus subtilis usando fusões proteicas com GFP. Este método permite observar em tempo real a formação de complexos de reparação de erros de pareamento em células vivas.

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Os autores gostariam de agradecer as Dras. Philina S. Lee e Alan D. Grossman para a formação inicialmente LAS em microscopia de fluorescência. Os autores também agradecer as Dras. Melanie Berkmen e Hajime Kobayashi para a ajuda e dicas para a imagem latente. Este trabalho foi financiado por fundos start-up da Faculdade de Literatura, Ciência e Artes e do Departamento de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento na Universidade de Michigan.

Culturas em crescimento de células para microscopia 1. Um ou dois dias antes da imagem, prepare o B. subtilis cepa contendo a proteína de fusão traducional você deseja visualizar. Rounds julgamento de passos 1A e 1B será necessário determinar qual condição de crescimento fornece as melhores imagens da sua estirpe. Na maioria dos casos, as células devem ser trabalhada durante a fase de crescimento exponencial. <ol class="ualpha"><li> Para alguns B. subtilis cepas (em particular, cepas que crescem pouco devido à integração da fusão de translação entre o gene de interesse e GFP em seu lócus endógeno), o crescimento inicial de dois dias antes da imagem é necessário para imagens de alta qualidade. No primeiro dia raia, o B. subtilis estirpe a ser trabalhada em ágar LB com antibiótico seletivo (s) e incubar durante a 30 ° C. No segundo dia, inocular 100 ml de solução salina a 0,85%, com uma única colônia e realizar três de 10 diluições em placas de agar LB (com antibióticos seletiva), chapeamento de 100 L de cada diluição, seguido de incubação durante a noite a 30 ° C. No terceiro dia, selecione a placa de diluição com crescimento confluente luz de células. Crescimento confluente luz sobre uma placa irá fornecer o meio de crescimento com uma alimentação saudável, em crescimento exponencial de inóculo inicial para, potencialmente, produzir resultados excelentes imagens (veja o passo 4). Esta etapa é particularmente útil para a maior qualidade de imagem de membrana com a mancha FM4-64. </li><li> B. Outros cepas subtilis pode simplesmente ser aplicada a meio seletivo agar LB para colônias único com uma vara estéril do dia anterior à imagem e incubar durante a 30 ° C. No dia seguinte, as células nesta placa será suficiente para usar como um inóculo para geração de imagens (veja o passo 4). NOTA: Para B. subtilis, culturas durante a noite em meio líquido não são apropriados devido a uma combinação de formação de esporos e respostas quorum, o que irá causar um período prolongado de crescimento lag fase 1. </li></ol> 2. Na manhã de imagem, mL colocar 10 de média 50 S7 03/01 em um Erlenmeyer 125 mL estéril. 3. Ressuspender as células em até 2 mL de meio S7 50 da placa de ágar LB com colónias individuais ou as células confluentes luz para obter um inóculo. 4. Adicione o suficiente S7 50 inóculo médio célula para o Erlenmeyer contendo 10 mL 50 S7 meio de uma cultura com uma densidade óptica medida inicial em 600 nm (OD 600) de ~ ,08-,1. Nesta etapa é importante ter pelo menos o ar a 10 vezes a taxa média. Assim, usamos 10-12,5 mL de meio inoculado em 125 mL Erlenmeyer. 5. Crescer cada cultura a 30 ° C até a cultura atingir uma OD 600 ~ 0,5-0,8. Banhos de água balançando são preferidos com rotações por minuto 150-200. Culturas desafiados com agentes indutores danificar o DNA ou o desfasamento deve estar em uma fase inicial de crescimento exponencial OD 600 de tal forma que as células vão atingir a meta de OD 600 com o período adicional de crescimento que é necessário para o tratamento (ver Tabela 1) Por exemplo, 2-aminopurina requer uma hora de tratamento, e, portanto, uma cultura tratado com 2-aminopurina deve ser a ~ 0,3-0,4 OD 600, de modo que a uma hora de tratamento / crescimento resulta em uma OD 600 ~ 0,5-0,8, pelo qual as células estão prontos para a imagem. Preparação da Amostra 1. Pipetar 300 mL de células cultivadas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. 2. Se imagens das membranas celulares é desejada, adicione a diluição de 1:1000 FM4-64 membrana mancha (Invitrogen) para cada amostra a partir de uma solução estoque de 1 mg / mL. A titulação de FM4-64 pode ser necessária para atingir o desejado sinal de fluorescência. Uma gama de titulação típica é 1:100, 1:1000 e 1:10.000. 3. Deixe que as amostras à temperatura ambiente por até 10 minutos ou enquanto o slide está sendo preparada com agarose 1% em 1X médio Spizizens conforme descrito abaixo (veja o passo 1 de "preparação da lâmina"). 4. Se a concentração de células é necessário, nós preferimos células filtragem utilizando um filtro de 0,2 m com um aparelho de vácuo. Células podem então ser lavada suavemente a partir da superfície do filtro com PBS, outro tampão apropriado ou médio antes de visualização. Preparação de slides 1. Prepare agarose 1% com 1X Spizizens. Adicionar 5 mL de estoque Spizizens 10X a 45 ml ddH2O juntamente com 0,5 g de agarose, e microondas para derreter. Hot agarose fundida é difícil de pipeta, e solidificou agarose não vai entrar na ponta da pipeta. A agarose deve ser equilibrada em banho-maria a uma temperatura de ~ 55-65 ° C para que entre a ponta da pipeta sem se solidificar dentro do ponta. 2. Desenhe 20 l de Spizizens com 1% de agarose derretida na ponta da pipeta. Pipetar uma gota (cerca de 1-2 mL) da solução de agarose em cada slide bem (nós usamos 15 slides bem, ver Tabela 2) para formar blocos de agarose rasas. A agarose solidifica imediatamente. Slides também deve ser feita imediatamente antes da aplicação das células. Se as almofadas de agarose são deixados à temperatura ambiente por si só, podem desidratar em minutos e se tornar inutilizável. Almofadas de agarose deve ser centrado e preencha cada bem, mas tem altura mínima para evitar interromper as lamelas, se gotículas são muito altos (tipo bolha) ou se a amostra se espalha além do limite bem, passe simplesmente o limpa bem com um Kimwipe e aplicar um nova agarose pad. 3. Aplicar a amostra 300 mL inteira (consulte a etapa 6) para o slide, distribuídos na parte superior de cada bloco de agarose. Esta quantidade de células deve ser suficiente para cobrir cada bem no slide. 4. Permitir que o slide carregado com células a sentar-se à temperatura ambiente (23 ° C) por aproximadamente 10 minutos. Essa etapa permitirá que para as células a se estabelecer na almofada agarose tornando-se imóvel e pronto para geração de imagens. Para necessidades específicas esta temperatura pode ter de ser alterado, por exemplo, quando a realização de experimentos que requerem uma mudança de temperatura 4. 5. Aspirar o meio afastado o excesso de cada poço, sem retirar as almofadas si. 6. Aplicar a lamínula para o slide, pressionando com firmeza e de maneira uniforme, mas com cuidado, em toda a área do slide. Certifique-se que a lamínula é contra o slide e que a lamínula não é aumentado acima do slide. Visualização de células 1. Muitos diferentes microscópios de fluorescência vai funcionar bem. É fundamental ter uma lente de imersão em óleo de 100X. O Laboratório de Simmons usa: <ul><li> Olympus BX61 equipado com microscópio de 1,45 TIRFM 100X óleo NA lente objetiva de imersão </li><li> Hamamatsu ORCAR 2 CCD refrigerado câmera </li><li> Lumen arco metálico 200 (prévia) fonte de luz. </li><li> Para a detecção de GFP (FITC), excitação e emissão de filtro 460-500 510-560 </li><li> Para a detecção de FM4-64 (TRITC), filtro de excitação e emissão 510-560 572-648. </li><li> As imagens foram capturadas SlideBook 4.2 (Figura 1) </li></ul> 2. Trazer as células para o foco usando luz branca. 3. Capturar a imagem usando filtros adequados para cada fluoróforo. Resultados representante Imagens representativas são mostradas (Figura 1). GFP focos devem ser bem definidos, enquanto FM4-64 coloração deve ser brilhante e claro 4-7. Imagens GFP ou membrana pode ser pseudo-colorida com qualquer cor, para permitir a imagem da mais alta qualidade a serem apresentados sem perder quaisquer dados. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Imagens GFP Representante do B. subtilis proteínas de fusão de translação. proteínas GFP são mostrados em verde, enquanto a coloração FM4-64 membrana é mostrado em vermelho. A barra de escala branca indica 3 mm (A) mutS-GFP [genótipo relevantes: mutS - gfp (SPC), amyE:: Pspac mutL (cat)]. Na presença de 600 mcg / mL 2 aminopurina e 1 mM IPTG. FM4-64 do sinal não é apresentada, a fim de mostrar mais claramente os focos mutS-GFP (B) MutL-GFP [genótipo relevantes: mutL:: mutL-GFP (spc)].. Na presença de 2-aminopurina (C) DNAX-GFP [genótipo relevantes: DNAX:: DNAX-GFP (spc)]. (D) RecA-GFP [genótipo relevantes: recA:: recA-GFP (spc)] na presença de 20 ng / mL mitomicina C. (E) TAGC-GFP genótipo [relevantes: TAGC:: TAGC-GFP (spc) ] na presença de 1 mg / mL mitomicina C. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tratamento / concentração ou quantidade </td><td> Função </td><td> Tempo de incubação </td></tr><tr><td> Mitomicina C (MMC) [20 e 150 ng / mL] </td><td> DNA agente alquilante </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> 2 aminopurina-(2-AP) [600 mcg / ml] </td><td> indução de incompatibilidade </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> Hidroxiureia (HU) </td><td> esgota dNTPs </td><td> 3 horas </td></tr><tr><td> luz ultravioleta (UV) 20 J/m2 </td><td> Timina-timina dímeros e 6-4 fotoprodutos </td><td> varia dependendo da fonte, geralmente 20 segundo </td></tr><tr><td> grays (radiação ionizante) 5 a 100 Gy </td><td> Dupla vertente quebra, rupturas dos filamentos simples e sites dano base </td><td> varia dependendo da fonte </td></tr></tbody></table>"&gt; Tabela 1. Resumo de danificar o DNA e tratamentos de indução de incompatibilidade <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Multiteste slide, 15 bem </td><td> Biomedicals MP </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> Tampa de vidro de microscópio </td><td> Pescador </td><td> 12-544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Pescador </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomicina C </td><td> Sigma </td><td> M0503-2mg </td><td> mutagênico, usar luvas </td></tr><tr><td> 2-aminopurina </td><td> Sigma </td><td> A3509-250mg </td><td> luvas </td></tr><tr><td> Hidroxiuréia </td><td> Sigma </td><td> H8627-25G </td><td> luvas </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> sensível à luz </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Lista de reagentes e equipamentos específicos:

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

Tentativa e erro são necessários para encontrar as condições de exposição de imagens da mais alta qualidade para cada cepa, e supomos que 1 milissegundo é apropriado para imagens com luz branca, enquanto exposições de 100 a 2000 ms são apropriados para GFP (FITC) e FM4-64 (TRITC ) imagens. Tempo de exposição vai variar dependendo do equipamento de imagem utilizada. Recomendamos o uso de uma cepa por 15 bem-lâmina de microscópio para a imagem mais simples, como a qualidade pad e difusão de células da fronteira pad pode c...

Receitas específicas solução 1: 10x S7 50 sais 0,5 M MOPS 100 Sulfato de Amônio mM 50 mM fosfato de potássio monobásico Filtro de esterilizar, e enrole S7 50 media em folha antes do armazenamento Metais 100x 0,2 M MgCl 2 70 mM CaCl 2 5 mM MnCl 2 0,1 mM ZnCl 2 100 mcg / mL Tiamina HCl 2 mM HCl 0,5 mM FeCl 3 * dH 2 O para volume final * FeCl 3 deve ser adicionado por último, para evitar precipitação. Após a esterilização do filtro, embrulhe solução de metal em folha de 100x. S7 50 media 1x S7 50 sais 1x de Metal A glicose 1% O glutamato 0,1% 40 mcg / mL Triptofano 40 mcg / mL Fenilalanina H 2 O destilada para volume final Spizizens 10x (g / L) 151,4 mM Sulfato de Amônio (20g / L) 803,8 mM fosfato de potássio monobásico (140g / L) 440,9 mM de potássio dibásico (60g / L) 34,0 mM citrato de sódio (10g / L) 16,6 mM MgSO 4 (2g / L) dH 2 O para volume final Filtro de esterilizar

mismatch repair imagem e respostas celulares a danos no dna em bacillus subtilis</em

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Ambos os procariotas e eucariotas responder a danos no DNA através de um complexo conjunto de alterações fisiológicas. Alterações na expressão gênica, a redistribuição de proteínas existentes, ea montagem de complexos de proteínas novo pode ser estimulada por uma variedade de lesões de DNA e de pares de bases incompatíveis DNA. Microscopia de fluorescência tem sido utilizada como uma poderosa ferramenta experimental para visualizar e quantificar as respostas para essas e outras lesões de DNA e para monitorar o status de replicação de DNA dentro da complexa arquitetura subcelular de uma célula viva. Fusões de translação entre proteínas fluorescentes e componentes repórter da replicação do DNA e máquinas de reparação têm sido usados ​​para determinar as sugestões que visam as proteínas do reparo do DNA de suas lesões cognate<em&gt; In vivo</em&gt; E para entender como essas proteínas são organizados dentro das células bacterianas. Além disso, fusões de transcrição e translação ligadas a promotores de DNA induzida danos revelaram que as células dentro de uma população de ter activado as respostas ao estresse genotóxico. Nesta revisão, nós fornecemos um protocolo detalhado para o uso de microscopia de fluorescência para a imagem da montagem de reparo de DNA e complexos de DNA de replicação em single células bacterianas. Em particular, este trabalho se concentra em proteínas incompatibilidade imagem reparo, recombinação homóloga, a replicação de DNA e uma proteína induzível SOS-in<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt;. Todos os procedimentos aqui descritos são facilmente passíveis de complexos de proteínas de imagens em uma variedade de espécies bacterianas.

Um protocolo detalhado é descrito para a formação de imagem em tempo real de complexos de reparo de DNA em<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Células.

Mismatch Repair imagem e respostas celulares a danos no DNA em Bacillus subtilis</em

Tanto procariontes quanto eucariontes respondem a danos no DNA por meio de um conjunto complexo de alterações fisiológicas. Alterações na expressão gênica, a redistribuição...

Estirpes TLU de Baus contendo fusões translacionais de reparo de erros de pareamento. Proteínas fundidas à GFP são estriadas em meio seletivo. As células da estria são utilizadas como inóculo fresco para cultura líquida.As células são cultivadas até que a DO 600 atinja de 0,3 a 0,4, momento em que são aplicados os tratamentos indutores de erros, conforme desejado, e as células são cultivadas adicionalmente até atingirem uma DO 600 de 0,5 a 0,8, quando são removidas. O corante de membrana FM 4-64 é adicionado, se desejado, e as células são colocadas em lâminas com tampões de agarose preparados e deixadas assentar após a remoção do meio em excesso. Por aspiração.Aplica-se uma lamínula e as células são visualizadas por microscopia. Olá, sou o Dr. Andrew Kow do laboratório do Dr. Lyle Simmons do Departamento de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento da Universidade de Michigan Ann Arbor. Hoje vamos mostrar um procedimento utilizado para visualizar fusões traducionais de proteínas de reparo de erros de pareamento de DNA, bem como outras proteínas de reparo e ribossomais em Bacillus solus.Utilizamos este procedimento para estudar a interação entre as proteínas de reparo de erros de pareamento de DNA e as proteínas ribossômicas em células vivas de Bacillus subtilis. Vamos começar. Para iniciar este procedimento, prepare as cepas de B. subtilis contendo a proteína de fusão traducional que deseja visualizar para algumas cepas.É suficiente iniciar um dia antes da obtenção de imagens. Exemplos incluem cepas que crescem bem quando a fusão translacional entre GFP e o gene de interesse é incorporada ao locus endógeno do gene, como MU LGFP. Ao iniciar um dia antes da obtenção de imagens, utilize um palito estéril em condições estéreis para aplicar as bactérias em meio sólido LB seletivo em placas.Para obter colônias isoladas, incubar durante a noite a 30 graus Celsius; no dia seguinte, as colônias serão usadas como inóculo inicial. Algumas cepas de B. sublista exigem dois dias de crescimento antes da microscopia para imagens de alta qualidade. Cepas específicas que requerem crescimento de dois dias são aquelas que crescem mal devido à fusão translacional, como rec A GFP; no primeiro dia, semear as bactérias em LB AED seletivo e incubar durante a noite.No segundo dia, realize uma diluição seriada. Primeiro, escolha uma única colônia para inocular 100 microlitros de salina a 0,85%, em seguida, realize quatro diluições seriadas de fator dez e plaque 100 microlitros de cada diluição salina, bem como da colônia inicial e da salina, em ágar LB contendo antibióticos seletivos. Incube as placas durante a noite, geralmente a 30 graus Celsius, após a segunda incubação noturna. Selecione a placa de diluição que apresentar crescimento celular levemente confluente.Esses fornecem um inóculo inicial saudável e em crescimento exponencial, potencialmente gerando excelentes resultados de imagem. Isso é particularmente útil para a obtenção de imagens de máxima qualidade da marcação da membrana. Com FM 4-64, na manhã do experimento de imagem, coloque 10 mililitros de meio S750 em um frasco estéril de 125 mililitros.Assim mantendo uma proporção ar-meio de pelo menos dez vezes. Re-suspenda as células em até dois mililitros de meio S750 do lppl com colônias isoladas ou células com confluência semelhante para obter um inóculo. Adicione quantidade suficiente de inóculo celular de meio S750 ao frasco Erlenmeyer contendo 10 mililitros de meio S750 para que o cultivo tenha uma OD600 inicial de aproximadamente 0,08 a 0,1.Em seguida, cultive cada cultura na temperatura apropriada para a linhagem B da sublista a ser analisada. Banhos-maria agitados são preferenciais, com rotações por minuto entre 150 e 200. Continue o cultivo das culturas até que atinjam uma DO 600 de aproximadamente 0,5 a 0,8.Para culturas desafiadas com agentes que danificam o DNA ou induzem erros de pareamento, planeje o tratamento de modo que o fim do período de incubação com o agente modificador do DNA coincida com o momento de alcançar a OD 600 desejada. Por exemplo, a duas amino purina, um análogo de DNA, que imita uma base pareada incorretamente quando incorporada ao genoma, requer uma incubação de uma hora e leva à formação de focos de proteínas de reparo de erros de pareamento, como mut LGFP. No entanto, a formação de focos de REC A GFP requer uma incubação de uma hora com mitomicina C ou outro agente causador de danos ao DNA para induzir quebras na dupla fita do DNA; ambos, duas amino purina e mitomicina C, são adicionados.Quando as culturas atingirem uma DO 600 de aproximadamente 0,3 a 0,4 e após a hora necessária de crescimento com qualquer tratamento, as culturas provavelmente terão atingido uma DO 600 de 0,5 a 0,8 e estarão prontas para a aquisição de imagens. Comece pipetando 300 microlitros de células cultivadas em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Se a aquisição de imagens das membranas celulares for desejada com uma diluição de um para 1000 de uma solução corante de membrana FM 4 64 a um miligrama por mililitro para cada amostra, uma titulação do FM 4 64 pode ser necessária para obter o sinal de fluorescência desejado.Uma faixa típica de titulação é de um a 100, um a 1001 a 10.000. Deixe as amostras repousarem por até 10 minutos ou enquanto a lâmina está sendo preparada. Se for necessária a concentração das células, filtre as células utilizando um filtro de 0,2 micrômetros com um aparelho de vácuo.Em seguida, lave suavemente as células do filtro com tampão ou meio apropriado enquanto as amostras celulares estão em incubação com FM 4-64. Prepare 1% de agarose com um x zens adicionando cinco mililitros de estoque 10 x zens a 45 mililitros de água destilada, juntamente com 0,5 gramas de agarose, e aqueça em banho-maria para derreter.Deixe a temperatura dos aros se equilibrar em banho-maria a aproximadamente 65 graus Celsius e aspire 20 microlitros da espécie. Termine com 1% de aros fundido na ponta de uma pipeta. Aros muito quente é difícil de pipetar, e aros frio irá solidificar e não entrará na ponta da pipeta.Em seguida, utilize uma lâmina multiteste com 15 poços e pipete uma única gota de aproximadamente um a dois microlitros da solução de aros em cada poço da lâmina para formar camadas rasas de aros. O aros solidificará imediatamente.As lâminas são preparadas imediatamente antes da aplicação das células para evitar a desidratação, o que tornaria as lâminas inutilizáveis. Os discos de aros devem ser centralizados e preencher cada poço, mas com altura mínima para não perturbar a lamínula. Se as gotas forem muito altas, apresentarem aspecto bolhoso ou se a amostra se espalhar além dos limites do poço, basta limpar o poço com um lenço de papel descartável e aplicar um novo disco de aros.Agora que a lâmina está pronta, aplique toda a amostra de 300 microlitros que foi previamente reservada no tubo de microcentrífuga sobre a lâmina, distribuindo a amostra na parte superior de cada almofada de aerossol. Essa quantidade de células deve ser suficiente para cobrir cada poço da lâmina. Deixe a lâmina carregada com as células repousar à temperatura ambiente por aproximadamente 10 minutos.Esta etapa permitirá que as células sedimentem no suporte de agros e fiquem imóveis, estando assim prontas para a aquisição de imagens ao final da incubação de 10 minutos. Aspire o meio em excesso de cada poço sem remover os suportes. Aplique a lamínula sobre a lâmina, pressionando firmemente e de forma uniforme, mas com delicadeza, em toda a área da lâmina; verifique para garantir que a lamínula esteja bem aderida à lâmina e que não esteja elevada acima dela.Prossiga para a imagem; muitos microscópios de fluorescência diferentes funcionarão bem. É essencial possuir uma objetiva de imersão em óleo de 100 x. O laboratório Simmons utiliza um microscópio Olympus BX 61 equipado com uma objetiva de imersão em óleo de 100 x com abertura numérica de 1,45, adequada para microscopia de fluorescência por reflexão interna total ou turf m.O microscópio também é equipado com uma câmera CCD refrigerada e uma fonte de luz metálica LU 200 arch. Comece focalizando as células utilizando luz branca. Utilize o filtro apropriado para cada flora.Quatro para detecção de GFP. Utilize filtro de excitação de 460 a 500 e emissão de 510 a 560 para detecção de FM 4-64. Utilize filtro de excitação de 510 a 560 e emissão de 572 a 648.Capture a imagem utilizando os filtros apropriados para cada plano. Quatro com o software slide book 4.2. Abaixo estão alguns resultados representativos da imagem do reparo do DNA proteína de reparo de incompatibilidade MU L, que foi fundida translacionalmente à GFP.A cultura controle não tratada de MU LGFP mostra focos mínimos, com a maioria das células contendo apenas níveis citoplasmáticos da proteína de fusão mut LGFP. No entanto, a maioria das células cultivadas na presença de duas purinas amino, que imita uma base pareada incorretamente quando incorporada ao genoma, apresenta focos de GFP, indicando que a proteína mutal GFP está envolvida no reconhecimento e na reparação das bases de DNA pareadas incorretamente.Resultados semelhantes são obtidos com a linhagem REC A GFP cultivada na presença da droga indutora de danos ao DNA, mitomicina C. Aqui, a maioria das células contém um foco de rec A GFP após o tratamento com mitomicina C, indicando que o rec A GFP respondeu ao dano no DNA, iniciando o processo de reparo, semelhante ao observado com o tratamento de pho IR na ausência de mitomicina C. Acabamos de mostrar como visualizar proteínas de reparo em células vivas de facius subtlest. Ao realizar este procedimento.É importante lembrar de ter calma e colocar as células em um foco adequado, o que pode exigir alguma prática. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

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Biology

Biologia

Nós apresentamos um procedimento pelo qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar a estrutura de intermediários de replicação que ocorrer após a irradiação UV.

Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel

A imagem espectroscópica eletrônica pode gerar imagens e distinguir ácido nucléico de proteína em resolução nanométrica. Ele pode ser combinado com o sistema miniSOG, que é capaz de rotular especificamente proteínas marcadas em amostras de microscopia eletrônica de transmissão. Ilustramos o uso dessas tecnologias usando focos de reparo de quebra de fio duplo como exemplo.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

Fluorescência confocal laser e microscopia microirradiação oferta ferramentas para indução de dano do ADN e monitoramento da resposta das proteínas de reparo de DNA em áreas selecionadas do sub nucleares. Esta técnica tem significativamente nosso conhecimento avançado de detecção de danos, sinalização e recrutamento. Este manuscrito demonstra essas tecnologias para examinar reparação simples e dupla vertente.

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

A resposta de dano de DNA induzida por radiação ativada pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT) não foi totalmente estabelecida. Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para detectar focos induzidos por radiação (RIF) de proteínas de reparação por manchas de imunofluorescência em linhas de células cancerígenas de cólon humano após a irradiação com o feixe misturado de nêutrons.

Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Este artigo introduz passos essenciais de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina. Esses protocolos são comumente usados para estudar processos celulares relacionados ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA.

Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

Este protocolo descreve um método para a visualização de um DNA double-strand proteína quebra de sinalização activada em resposta a danos no ADN, bem como sua localização durante a mitose.

Duas e três dimensões imagens de células vivas de Proteínas de DNA resposta a danos

Beacons bimoleculares proporcional (RBMBs) pode ser usado para imagens simples transcrições de RNA projetados em células vivas. Aqui, nós descrevemos a preparação e purificação de RBMBs, entrega de RBMBs em células de formação de microporos e de imagem fluorescente de transcritos de ARN em tempo real.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

Aprenda a visualizar reparação de DNA em Bacillus subtilis usando fusões proteicas com GFP. Este método permite observar em tempo real a formação de complexos de reparação de erros de pareamento em células vivas.

Mismatch Repair imagem e respostas celulares a danos no DNA em Bacillus subtilis

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