Name: Decifrando Pathways Axonal dos Grupos geneticamente definidos de neurônios no tubo Neural Utilizando Pintainho In ovo Eletroporação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-02T20:17:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprenda a visualizar trajetórias axonais de neurônios geneticamente definidos na medula espinhal embrionária de pintainho usando eletroporação in ovo. Este método permite estudar o desenvolvimento neural e a formação de circuitos.

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Este trabalho foi suportado por concessões para AK da Ciência Israel Foundation, Israel O ministério da saúde, e DFG (Fundação Alemã de Pesquisa).

I. Eletroporação Manipulação de ovos <ol><li> Coloque os ovos em um conjunto de incubadora umidificada a 37-38 ° C, de preferência uma incubadora com um bandejas de balanço. </li><li> Embrião são electroporated após cerca de 66 horas de incubação, quando atingiram Hamburger &amp; Hamilton estágio (HH) 18-20. Nesta fase, a cabeça encontra-se em ângulos retos com o tronco (condição chamada de flexão cervical) e um vasto conjunto de vasos extra-embrionárias do sangue, como o anterior, posterior, direita e esquerda veias vitelina deve ser visto. Esta é uma fase ótima para enhancer-dependente expressão específica 1,3,4. É importante monitorar a temperatura e umidade da incubadora, a fim de obter embriões viáveis ​​e sincronizados. </li><li> Após 66 horas de incubação, retirar os ovos da incubadora. Coloque os ovos na horizontal. Espere 5-10 minutos. O embrião agora está localizada no pólo superior do ovo. </li></ol> Preparativos <ol><li> Preparar a solução de Hank com penicilina estreptomicina / (P / S) (1:100). </li><li> Puxe capilares de vidro (0,5 mm de diâmetro) para microcapilar. </li><li> Coloque os eletrodos (tungstênio) em micromanipulador e conectar eletrodos ao gerador de pulsos (ECM 830). </li><li> Ajustar o gerador de pulsos com os seguintes parâmetros: 30V de tensão, número de pulsos - 3, comprimento do pulso de 50 ms. </li><li> Prepare uma pipeta na boca, uma agulha de seringa e uma fita. </li><li> Prepare uma mistura de DNA desejado (2-5μg/μl) e adicionar um corante Fast Green. </li></ol> Janelas e eletroporação <ol><li> Usando uma seringa, remova 5-6 ml de albumina de cada ovo. </li><li> Com uma tesoura pequena e aberta uma janela oval na parte superior do ovo. </li><li> Embrião úmido com 0,5-1ml de Hank + solução de P / S. </li><li> Use uma pipeta de boca, para carregar o vidro microcapilar com a mistura de DNA. </li><li> Coloque o embrião com sua cauda em sua direção. Nesta fase, a medula espinhal de embriões é claramente visto. Assim, não técnicas de contraste são necessários. A medula espinhal é selado em ambas as extremidades, a cabeça ea cauda, ​​mas se o seu microcapilar é fina o suficiente, você será capaz de furar um buraco pequeno e penetrar no tubo neural em um ângulo raso. A microcapilar de diâmetro direito deve ser carregado facilmente com DNA, penetrar no tubo sem danificá-lo e liberar o DNA com uma exalação regular. </li><li> Injetar o DNA com uma pipeta de boca. O corante verde deve se espalhar a partir da ponta da cauda até as vesículas do cérebro em desenvolvimento. </li><li> Colocar os eletrodos em paralelo ao tubo neural, tão perto quanto você pode, sem tocar o próprio tubo e pulso. No momento do pulso, os eletrodos devem ser cobertos com o líquido para permitir condutividade elétrica. Normalmente, a quantidade de Hank é adicionado na mendicidade é suficiente. Se não adicionar uma gota de apenas de Hank antes do pulso. </li><li> Remova cuidadosamente os eletrodos e selar a janela com uma fita. É importante para selar o ovo inteiramente para evitar a secagem do embrião durante o período de incubação seguinte. </li><li> Coloque o ovo de volta na incubadora. </li></ol> II. Preparação medula espinhal livro aberto Descolamento da medula espinhal do embrião <ol><li> Remover o embrião eletroporated, em E6, do ovo e coloque-o em um prato de Petri revestidas com silicone contendo PBS. </li><li> Cortar as membranas e esticar o embrião do seu lado ventral utilizando pinos para prendê-lo. </li><li> Usando um tungstênio afiadas microcapilar fazer uma incisão longitudinal ao longo da placa do telhado, do rombencéfalo até a cauda. </li><li> Faça um adicional de duas incisões longitudinais em ambos os lados da medula espinhal, destacando-se os gânglios da raiz dorsal (DRGs) de distância da medula espinhal. </li><li> Destacar a placa de fundo a partir do tecido a partir da cauda para o rombencéfalo, deixando a medula espinhal intacta. </li><li> Corte da medula espinhal em uma seção transversal na parte posterior do cérebro usando uma tesoura fina e separá-lo do corpo. </li></ol> Fixação <ol><li> Espalhe o cordão espinhal isolado numa placa de Petri novo revestido com silicone contendo PBS, utilizando os pinos para prendê-lo, a partir do cérebro posterior à cauda produzir uma preparação flat-mount. </li><li> Despeje o PBS do prato e substituí-lo com paraformaldeído 4% em tampão fosfato. </li><li> Incubar a temperatura ambiente por 1 hora. </li></ol> Imuno-histoquímica <ol><li> Transferir o cabo fixo da coluna vertebral em um frasco contendo anticorpo primário em PBS. </li><li> Incube com agitações suave durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar o anticorpo X5 vezes com PBS, cada lavagem durante 1 hora com agitação suave. </li><li> Adicionar anticorpo secundário e incubar com agitações suave durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar o anticorpo X5 vezes com PBS, cadalavar por 1 hora com agitação suave. </li></ol> Montagem de livro aberto para imagens <ol><li> Esfregaço graxa ou silicone em forma de retângulo sobre uma lâmina e gotejar PBS dentro. </li><li> Coloque a medula espinhal esticada no meio do retângulo, usando uma pinça e extrair o líquido em torno dele com uma pipeta Pasteur. </li><li> Coloque 1-2 gotas de meios de montagem sobre a medula espinhal e cobrir com lamínula. Esmagá-lo para evitar bolhas de ar. </li><li> Manter os slides no escuro em 4 ° C. </li><li> Inspecionar a medula espinhal através de microscopia confocal. </li></ol>

<ol><li>Zisman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+membrane+capture+of+F-spondin+generates+combinatorial+guidance+cues+from+a+single+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and membrane capture of F-spondin generates combinatorial guidance cues from a single molecule.</a> J Cell Biol. 178 (7), 1237-1249 (2007).</li>
<li>Arakawa, T., Iwashita, M., Matsuzaki, F., Suzuki, T., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths%2C+elongation%2C+and+projections+of+ascending+chick+embryonic+spinal+commissural+neurons+after+crossing+the+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Paths, elongation, and projections of ascending chick embryonic spinal commissural neurons after crossing the floor plate.</a> Brain Res. 1223, 25-33 (2008).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22+Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4 (1), 21(2009).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29 (3), 123-132 (2001).</li>
<li>Reeber, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+Robo+expression+in+vivo+perturbs+commissural+axon+pathfinding+in+the+chick+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Manipulating Robo expression in vivo perturbs commissural axon pathfinding in the chick spinal cord.</a> J Neurosci. 28 (35), 8698-8708 (2008).</li>
</ol>

Eletroporação de DNA plasmídeo no embrião de galinha evolui como uma poderosa técnica para na expressão ectópica vivo. A combinação de enhancers específico, e eletroporação pinto fornece uma ferramenta rápida e eficiente para decifrar caminhos axonal de um grupo geneticamente definido de neurônios 1,3,5. Utilizando o Cre / LoxP e os sistemas de amplificação Gal4/UAS pode aumentar a intensidade e duração da expressão. A imagem que surge é de uma divergência complexo de pistas axonal que surge a partir subpopul...

decifrando pathways axonal dos grupos geneticamente definidos de neurônios no tubo neural utilizando pintainho in ovo eletroporação

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Emprego de elementos enhancer para dirigir a expressão de genes repórter em neurônios é um paradigma amplamente utilizado para rastreamento de projeção axonal. Para rastreamento de projeção axonal de interneurônios da coluna vertebral nos vertebrados, os genes de células germinativas alvo repórter rendimento rotulagem bilateralmente simétrica. Portanto, é difícil distinguir entre o ipsi-e contra-lateralmente axônios de projeção. Eletroporação unilateral dentro do tubo neural pinto fornece um meio útil para restringir a expressão de um gene repórter para um lado do sistema nervoso central, e seguir a projeção axonal em ambos os lados<sup&gt; 1 ,2-5</sup&gt;. Este vídeo demonstra primeiro como lidar com os ovos antes da injeção. No estágio HH 18-20, DNA é injetado no nível sacral do tubo neural, então, eletrodos de tungstênio são colocados em paralelo ao embrião e curta pulsos elétricos são administrados com um gerador de pulsos. O ovo é selada com fita adesiva e colocados de volta para uma incubadora para o desenvolvimento. Três dias depois (E6) a medula espinhal é removido como uma preparação de livro aberto de embrião, fixa, e processados ​​para a coloração de toda anticorpo de montagem. O cordão espinhal manchada é montado na corrediça e visualizados através de microscopia confocal.

Este vídeo demonstra como visualizar caminhos axonal de grupos geneticamente definido de neurônios na medula espinhal utilizando pinto embrionárias<em&gt; In ovo</em&gt; Eletroporação de genes repórter sob o controle de elementos específicos enhancer.

Decifrando Pathways Axonal dos Grupos geneticamente definidos de neurônios no tubo Neural Utilizando Pintainho In ovo Eletroporação

O emprego de elementos intensificadores para impulsionar a expressão de genes repórteres em neurônios é um paradigma amplamente utilizado para o rastreamento de projeções axonais. Para o rastreamento...

Olá, sou Ham do laboratório da Dra. Review Klar do departamento de neurobiologia médica da Universidade Hebraica de Jerusalém. Olá, sou Sophie Esman e também sou do laboratório Lars. Hoje vamos mostrar um procedimento para Innovo, eletroporação e preparação da medula espinhal em livro aberto.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as trajetórias axonais de populações neuronais geneticamente definidas na medula espinhal embrionária. Vamos começar. Para iniciar este procedimento, transfira ovos de galinha brancos Leghorn fertilizados da temperatura ambiente para uma incubadora umidificada, preferencialmente com bandejas oscilantes, a 37-38 °C.É importante monitorar a temperatura e a umidade da incubadora para obter embriões viáveis e sincronizados. Os embriões de pintinho são eletroporados quando atingem o estágio de Hamburger e Hamilton (HH) 18 a 20, que é um estágio ideal para a expressão específica dependente de enhancer. Neste estágio, a cabeça encontra-se em ângulo reto em relação ao tronco.Também no estágio HH 18 a 20, um amplo conjunto de vasos sanguíneos extra-embrionários, como os vasos das linhas vitelinas anterior, posterior, direita e esquerda, também deve ser visível. Os embriões de pintinho atingem o estágio HH 19 a 20 após 66 horas de incubação, e nesse momento remova os ovos do incubador. Após remover os ovos, coloque-os na posição horizontal e aguarde de cinco a dez minutos. O embrião encontra-se agora no polo superior do ovo.Antes da eletroporação, prepare os embriões com solução de Hank contendo 100 unidades por mililitro de penicilina e 0,1 miligramas por mililitro de estreptomicina. Prepare uma mistura desejada de DNA a duas a cinco microgramas por microlitro e adicione alguns grânulos do corante verde rápido para facilitar a visualização do DNA injetado. Tenha também prontos um pipetador bucal, uma agulha de seringa estéril, tesoura pequena e uma fita.Prepare microcapilares puxando capilares de vidro com diâmetro de 0,5 milímetro utilizando um puxador de pipetas. Coloque os eletrodos de tungstênio nos micromanipuladores e conecte os eletrodos ao gerador de pulsos. Ajuste a voltagem no gerador de pulsos para menos 30 volts, a duração de cada pulso para 50 milissegundos e o número de pulsos para três.Prossiga para a eletroporação antes de expor e manipular os embriões. Insira uma seringa no polo estreito do ovo e remova de cinco a seis mililitros de albúmina de cada ovo. A albúmina é removida para evitar que entorne.Ao cortar na próxima etapa, use a tesoura pequena para cortar. Abra uma janela oval no lado superior do ovo após expor o embrião de pintinho e umedeça-a com 0,5 a um mililitro de solução de Hanks e penicilina-estreptomicina. Em seguida, use um pipetador de boca para carregar a micropipeta de vidro.Com uma mistura de corante de DNA, uma microcapilar de diâmetro adequado deve ser facilmente carregada com DNA. Sob uma posição binocular, posicione o embrião para injetar o DNA no tubo neural. Coloque o embrião com a cauda voltada para você.Nesta fase de desenvolvimento, a medula espinhal é claramente visível e, portanto, nenhuma técnica de contraste é necessária. A medula espinhal está fechada tanto na extremidade cefálica quanto na caudal. No entanto, com as punções de microcapilares, mais um orifício no tubo neural e penetrando-o em um ângulo raso, um microcapilar suficientemente fino e com o diâmetro correto deve penetrar no tubo sem danificá-lo.Injete o DNA utilizando um micropipetador de boca. Uma micropipeta com o diâmetro correto deve liberar o DNA com uma expiração regular. A coloração verde deve se espalhar desde a ponta da cauda até as vesículas do cérebro em desenvolvimento.Injete até que o tubo neural esteja cheio com DNA. A eletroporação é necessária para que o DNA injetado entre nas células primeiro. Posicione os eletrodos paralelamente ao tubo neural e o mais próximo possível dele, sem tocá-lo diretamente. Certifique-se de que os eletrodos estejam cobertos com líquido para permitir a condutividade elétrica durante o pulso.Normalmente, a solução de Hank adicionada imediatamente após a exposição do embrião é suficiente. Porém, se necessário, adicione uma gota da solução de Hank logo antes do pulso, com os eletrodos posicionados e submersos no líquido, para realizar a eletroporação. Em seguida, remova cuidadosamente os eletrodos e feche a janela e o ovo com fita adesiva. É importante selar completamente o ovo para evitar a dessecação do embrião durante o período subsequente de incubação.Coloque o ovo de volta no incubador e incube até que o embrião de pintinho atinja o estágio embrionário seis, ou E seis, quando for o momento da aquisição de imagens. Quando o embrião eletroporado atingir o estágio embrionário seis (E seis), três dias após a eletroporação, remova-o do ovo e coloque-o em uma placa de Petri revestida com silicone contendo PBS, utilizando uma tesoura fina.Retire as membranas e estique o embrião em seu lado ventral usando alfinetes fixados na silicone para mantê-lo no lugar. Usando uma microcapilar de tungstênio afiada, faça uma incisão longitudinal ao longo da placa do teto, desde o cérebro posterior até a cauda.Realize mais duas incisões longitudinais em ambos os lados da medula espinhal, destacando os gânglios da raiz dorsal ou DRGs da medula espinhal. Desprenda a lâmina basal do tecido começando pela cauda até o cérebro posterior, mantendo a medula espinhal intacta. Por fim, use tesoura fina para cortar a medula espinhal em secção transversal no cérebro posterior e separe a medula espinhal do corpo.Agora que a medula espinhal foi isolada, espalhe-a em um novo recipiente de Petri revestido com silicone contendo PBS, utilizando pinos para fixá-la desde o cérebro posterior até a cauda, produzindo uma preparação em montagem plana. Fixe a medula espinhal em paraformaldeído 4% em PBS por uma hora à temperatura ambiente, seguido de coloração imunológica conforme o procedimento de imunohistoquímica, detalhado no protocolo escrito acompanhante, para montar a medula espinhal aberta. Prepare o espécime para aquisição de imagens.Espalhe graxa ou silicone em formato retangular sobre uma lâmina e coloque uma gota de PBS dentro do retângulo. Use pinças para posicionar a medula espinhal, esticando-a no centro do retângulo, e remova o líquido ao redor. Com um bastão de aplicação, coloque uma a duas gotas de meio de montagem sobre a medula espinhal e cubra com uma lamínula.Aplicar pressão sobre a lamínula. Para evitar bolhas de ar. Manter as lâminas no escuro a quatro graus Celsius.Inspecione a medula espinhal utilizando microscopia confocal. Abaixo estão alguns resultados representativos de rejeições axonais de interneurônios espinhais de pintinho em experimentos controle, nos quais RFP é expressado em todos os neurônios por meio de um elemento potenciador ubíquo do CMV; a maioria dos neurônios e seus axônios está marcada. É impossível decifrar o trajeto axonal de subpopulações neuronais.No entanto, ao aplicar elementos potencializadores específicos, é revelado um trajeto axonal definido de uma subpopulação específica de dois neurônios neste exemplo. Assim, acabamos de mostrar como eletroporar um tubo neural de face com um potenciador neuronal específico no estágio E três e como preparar uma medula aberta em formato de livro no estágio E seis. Ao realizar este procedimento, você deve lembrar-se de ser cuidadoso e paciente.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos. Boa sorte.

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