Decifrando Pathways Axonal dos Grupos geneticamente definidos de neurônios no tubo Neural Utilizando Pintainho In ovo Eletroporação
2 de maio de 2010
Este vídeo demonstra como visualizar caminhos axonal de grupos geneticamente definido de neurônios na medula espinhal utilizando pinto embrionárias In ovo Eletroporação de genes repórter sob o controle de elementos específicos enhancer.
Olá, sou Ham, do laboratório do Dr.Review Klar no departamento de neurobiologia médica da Universidade Hebraica de Jerusalém. Olá, sou Sophie Esman e também sou de um laboratório de Lars. Hoje vamos mostrar um procedimento para Innovo, eletroporação e preparação de livro aberto da medula espinhal.
Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar trajetórias axonais de populações neuronais geneticamente definidas na medula espinhal embrionária. Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, transfira ovos de galinha leghorn brancos fertilizados da temperatura ambiente para uma incubadora umidificada, de preferência com bandejas de balanço a 37 a 38 graus Celsius.
É importante monitorar a temperatura e a umidade da incubadora para obter embriões viáveis e sincronizados. Os embriões de pintinhos são eletroporados quando atingem o estágio 18 a 20 de hambúrguer e Hamilton ou HH, que é um estágio ideal para a expressão específica da dependência do intensificador. Nesta fase, a cabeça fica perpendicular ao tronco.
Também no estágio HH 18 a 20, um vasto conjunto de vasos sanguíneos embrionários extras, como vasos da linha vital anterior, posterior direita e esquerda, também deve ser visto. Os embriões de pintinhos atingem o estágio HH 19 a 20 após 66 horas de incubação e, nesse momento, retiram os ovos da incubadora Após a remoção dos ovos, coloque-os horizontalmente e aguarde de cinco a 10 minutos. O embrião agora está localizado no pólo superior do óvulo.
Antes da eletropering, os embriões preparam a solução de Hank com 100 unidades por mililitro de penicilina e 0,1 miligramas por mililitro de estreptomicina. Prepare uma mistura desejada de DNA de dois a cinco microgramas por microlitro e adicione alguns grãos do corante verde rápido para facilitar a visualização do DNA injetado. Tenha uma pipeta bucal, uma agulha de seringa estéril, uma tesoura pequena e uma fita adesiva pronta também.
Prepare microcapilares puxando capilares de vidro de 0,5 milímetro de diâmetro com um extrator de pipeta. Coloque os eletrodos de tungstênio nos micro manipuladores e conecte os eletrodos ao gerador de pulsos. Defina a tensão no gerador de pulsos para menos 30 volts, o comprimento de cada pulso para 50 milissegundos e o número de pulsos para três.
Proceda à eletroporação antes de expor e manusear os embriões. Insira uma seringa no pólo estreito do ovo e remova de cinco a seis mililitros de albumina de cada ovo. A albumina é removida para evitar que derrame.
Ao cortar o na próxima etapa, use a tesoura pequena para cortar. Abra uma janela oval na parte superior do ovo depois de revelar o embrião de pintinho, umedeça-o com 0,5 a um mililitro de meada e solução de estreptomicina de penicilina. Em seguida, use um perpet de boca para carregar o microcapilar de vidro.
Com uma mistura de corante de DNA, um microcapilar do diâmetro correto deve ser carregado facilmente com DNA. Sob uma posição binocular, o embrião para injetar o DNA no tubo neural. Coloque o embrião com a cauda voltada para você.
Nesse estágio de desenvolvimento, a medula espinhal é claramente visível e, portanto, nenhuma técnica contrastante é necessária. A medula espinhal é selada na cabeça e na extremidade da cauda. No entanto, com o micro capilar perfura mais orifícios no tubo neural e penetra-o em um ângulo raso, um micro capilar que é fino o suficiente e com o diâmetro correto deve penetrar no tubo sem danificá-lo.
Injete o DNA usando um perpet na boca. Um microcapilar do diâmetro correto deve liberar o DNA com uma expiração regular. O corante verde deve se espalhar da ponta da cauda até as vesículas do cérebro em desenvolvimento.
Injete até que o tubo neural esteja cheio de DNA, a eletroporação é necessária para que o DNA injetado entre nas células primeiro. Coloque os eletrodos em paralelo ao tubo neural e o mais próximo possível sem tocar no próprio tubo. Certifique-se de que os eletrodos estejam cobertos com líquido para permitir a condutividade elétrica durante o pulso.
Normalmente, a solução de Hank adicionada imediatamente após a exposição do embrião é suficiente. Mas se não houver uma gota da solução de Hank pouco antes do pulso com os eletrodos posicionados e submersos em pulso líquido para eletrooperar, remova cuidadosamente os eletrodos e sele a janela e o ovo com fita adesiva. É importante selar totalmente o ovo para evitar o ressecamento do embrião durante o período de incubação seguinte.
Coloque o ovo de volta na incubadora e incube até que o embrião do pintinho atinja o embrião de desenvolvimento. Dia seis ou E seis, quando é hora de obter imagens quando o embrião eletroporado atingiu o embrião de desenvolvimento. Dia seis, E seis três dias após a eletroporação, remova-o do ovo e coloque-o em uma placa de Petri revestida de silicone contendo PBS usando uma tesoura fina.
Corte as membranas e estique o embrião em seu lado ventral usando pinos empurrados para dentro do silicone para mantê-lo no lugar. Usando um micro capilar de tungstênio afiado. Faça uma incisão longitudal ao longo da placa do teto, do cérebro posterior até a cauda.
Faça duas incisões longitudinais adicionais em ambos os lados da medula espinhal, destacando os gânglios da raiz dorsal ou DRGs da medula espinhal. Separe a placa do piso do tecido começando da cauda até o cérebro posterior, deixando a medula espinhal intacta. Finalmente, use uma tesoura fina para cortar a medula espinhal em uma seção transversal no cérebro posterior e separar a medula espinhal do corpo.
Agora que a medula espinhal foi isolada, espalhe-a em uma nova placa de Petri revestida de silicone contendo PBS usando pinos para segurá-la do cérebro posterior até a cauda, produzindo uma preparação de montagem plana. Fixe a medula espinhal em 4% de paraldeído em PBS por uma hora em imunocoloração à temperatura ambiente seguindo o procedimento de imuno-histoquímica, protocolo escrito detalhado e acompanhante para montar a medula espinhal aberta. Preparação de livros para imagens.
Espalhe graxa ou silicone em forma de retângulo em uma lâmina e pingue PBS dentro do retângulo. Use uma pinça para colocar a medula espinhal, estique o meio do retângulo e retire o líquido ao seu redor. Com uma massa por animal, coloque uma a duas gotas de mídia de montagem na medula espinhal e cubra com uma lamínula.
Aplique pressão na lamínula. Para evitar bolhas de ar. Mantenha os slides no escuro em quatro graus Celsius.
Inspecione a medula espinhal usando microscopia confocal. Aqui estão alguns resultados representativos de rejeições axonais de interneurônios espinhais de pintinhos em experimentos de controle onde a RFP é expressa em todos os neurônios utilizando um elemento intensificador onipresente do CMV, a maioria dos neurônios e seus axônios são rotulados. É impossível decifrar a trajetória axonal das subpopulações neuronais.
No entanto, ao aplicar elementos de aprimoramento específicos, uma via axonal definida de uma subpopulação específica DI dois neurônios neste exemplo é revelada. Então, acabamos de mostrar como eletrooperar um tubo neural da bochecha com um intensificador neuronal específico em E três e como preparar uma medula espinhal de livro aberto em E seis. Ao fazer este procedimento, lembre-se de ser cuidadoso e paciente.
Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos. Boa sorte.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra um procedimento para visualizar vias axonais de neurônios geneticamente definidos na medula espinhal embrionária de galinha usando eletroporação in ovo. O método permite que os pesquisadores estudem trajetórias axonais de forma eficaz.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Eletrofisiologia
Fundo
- Entender as vias axonais é crucial para a pesquisa em neurociência.
- A eletroporação in ovo é uma técnica usada para introduzir genes reporter.
- A medula espinhal embrionária de galinha serve como um modelo para estudar o desenvolvimento neuronal.
- Populações neuronais geneticamente definidas podem fornecer insights sobre circuitos neurais específicos.
Objetivo do Estudo
- Visualizar vias axonais na medula espinhal embrionária.
- Utilizar eletroporação in ovo para estudos de expressão gênica.
- Aprimoramento da compreensão do desenvolvimento e conectividade neuronal.
Métodos Utilizados
- Transferir ovos de galinha fertilizados para uma incubadora umidificada.
- Manter a incubação a 37 a 38 graus Celsius.
- Realizar eletroporação in ovo para introduzir genes reporter.
- Preparar preparações de livro aberto da medula espinhal para visualização.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida de vias axonais na medula espinhal.
- Demonstração da eficácia da eletroporação in ovo.
- Insights sobre as trajetórias de populações neuronais geneticamente definidas.
- Estabelecimento de um método confiável para estudar o desenvolvimento neuronal.
Conclusões
- O método fornece uma ferramenta valiosa para pesquisas em neurociência.
- A eletroporação in ovo é eficaz para entrega de genes em modelos embrionários.
- Entender as vias axonais pode informar estudos sobre a formação de circuitos neurais.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This method enables precise visualization of axonal trajectories in genetically defined neuronal populations, addressing a key challenge in target validation where bilateral labeling obscures ipsilateral versus contralateral projections. By restricting reporter expression to one side of the neural tube via unilateral in ovo electroporation, researchers achieve mechanistic de-risking of neuronal circuit hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by clarifying pathway-specific connectivity patterns relevant to neurodevelopmental disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal projections of specific neuronal subpopulations defined by enhancer-driven reporters.
- Operational Value: Provides unilateral labeling to distinguish ipsi- and contra-laterally projecting axons, reducing ambiguity in circuit mapping.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of targets by clarifying whether a neuronal population engages excitatory or inhibitory pathways critical for disease mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable axonal trajectory data as a phenotypic readout for screening genetic or pharmacological modulators of neuronal guidance.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible whole-mount preparations compatible with high-resolution confocal imaging and automated analysis pipelines.
- Scalability Value: Utilizes chick embryo model amenable to scale for multi-condition testing of enhancer activity or electroporation efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maps disease-relevant axonal pathways in vertebrate spinal cord models, enabling alignment with human neurodevelopmental disorder biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical assessment of circuit-level drug effects on axonal growth or guidance.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether a target modulates specific projection patterns linked to functional recovery or pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing mechanistic insights that precede functional assay development and support translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-specific gene expression in defining neuronal subpopulations and their axonal trajectories.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized, unilateral reporter expression for evaluating compound effects on axon guidance.
- Analytics: Delivers quantitative spatial readouts of axonal projection patterns, facilitating comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing disease-relevant axonal pathway models for biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs, enhancer elements, or electroporation parameters across multiple neuronal targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving axonal projection directionality, a critical factor in assessing circuit-specific drug effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined electroporation parameters (voltage, pulse length, number) and staged embryo handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose axonal pathways are misaligned with desired therapeutic mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets that modulate specific projection patterns relevant to clinical endpoints in neurodevelopmental indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological techniques, including embryo staging, microinjection, and electroporation parameter optimization.
- Depends on instrumentation such as pulse generators, micro manipulators, tungsten electrodes, and confocal microscopy for imaging.
- Necessitates standardization of DNA concentration, enhancer element selection, and electrode placement across users and labs for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the model to other vertebrate systems or neuronal types beyond spinal interneurons.
- Practical limitations include embryo viability sensitivity to incubation conditions and the technical challenge of achieving uniform unilateral electroporation without tube damage.
