Name: Isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda o isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) para estudos de angiogênese e biologia vascular. Este protocolo demonstra a extração eficiente usando colagenase e meio de cultura suplementado.

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Procedimento <ol><li> Lay cabo na almofada limpa e dab off excesso de sangue. Fazer cortes frescos em ambas as extremidades do cabo. </li><li> Inserir 21 1 / 2 G agulha com a bainha da agulha de plástico ON, na veia. (A veia é a maior abertura; os 2 menores são artérias) </li><li> Fixar a agulha no lugar com uma pinça hemostática e anexar a seringa 20cc de Hanks para a agulha. </li><li> Empurre a Hanks através da veia com pressão moderada. Recolher os resíduos no recipiente com água sanitária. (Segurando a agulha e cordão com uma mão enquanto empurrando impediria a agulha pulando para fora da veia.) Se há um monte de sangue na veia, lave pela segunda vez. </li><li> Lay cabo na almofada e prenda a outra extremidade da veia. Preencher com alguns ml de Hanks para verificar vazamentos ao longo da medula. Retirar a 5 mL e desconecte o grampo inferior. </li><li> Desconectar a seringa de 20cc. Retire o êmbolo da seringa 10cc. Anexar seringa 10cc a agulha, despeje 10ml colagenase e substituir êmbolo. Empurre colagenase na veia até ver o primeiro montante sair da extremidade aberta. Re-fixação da extremidade aberta e encha com colagenase até que haja distensão moderada da veia. Demais resultados distensão na contaminação do músculo liso. </li><li> Massagem suavemente o cabo. </li><li> Cabo de incubar (com hemostats agulha e seringa em anexo) em DPBS a 37 ° C por 15 min. </li><li> Durante a incubação, continue os passos 1-8 com 2 nd cabo. </li><li> Após a incubação, tomar cabo de fora do copo e, segurando o cabo de cima do tubo de 50 mL corte a extremidade acima do grampo inferior. Certifique-se de coletar tudo no tubo. Empurre a colagenase restantes através do cordão, em seguida, anexar a seringa 20cc e empurre Hanks completamente com pressão moderada. </li><li> Se não houver células musculares lisas são necessários, descartar o cabo neste momento. Caso contrário, o cabo do mesmo em um tubo de 50 mL em segundo lugar com 5ml ~ colagenase e incubar a 37 ° C por 30-60 min. </li><li> Manter o tubo até que todos os cabos são feitos. </li><li> Girar tubos em ~ 1200 rpm por 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante (exceto para ~ mL 1-2). Ressuspender o sedimento em 5mls PHEC + e placa em um T25. </li><li> Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante a noite. </li><li> No dia seguinte remova o sobrenadante e substituir com a mídia fresco. Se houver muitas hemácias, lave uma vez com M199, em seguida, adicione + PHEC. Continue incubação, como de costume até que a placa é confluente (1-4 dias). Dividida em uma T75 gelatinizado. </li><li> Uma vez T75 é confluente, dividida em três T75s. Congelar dois frascos por frasco. </li></ol> Nota: As células endoteliais (unactivated) têm uma aparência de paralelepípedo. Células endoteliais são ativados por vezes (longo e pontudo), logo após o isolamento, depois de alguns passes que eles geralmente voltam para um estado unactive. Limpeza <ol><li> Com muito cuidado, descarte de agulhas em recipiente adequado. </li><li> Dispor de seringas em recipiente biohazard grande. </li><li> Colocar todo o tecido em saco biohazard pequeno. Saco de fechar e congelar a -20 ° até a incineração. </li><li> Mergulhe todos os instrumentos em virucide por pelo menos 10 min. </li><li> Adicionar meio de incubação para resíduos copo / água sanitária. Deixe descansar por pelo menos 10 min. </li><li> Descarte as pastilhas de bancada para resíduos de risco biológico. </li><li> Spray para baixo o interior eo exterior de copos, bancada de trabalho e do banho de água com tampa vircide. Deixe descansar 10 min, em seguida, limpe. </li><li> Enxágüe copos e instrumentos com água morna e pendurar na cremalheira para secar (blot fora os instrumentos para que eles não ferrugem). </li><li> Descarte de resíduos descontaminados na pia. </li><li> Retorno de mídia não utilizados para geladeira. </li><li> Dispor de luvas em resíduos de risco biológico. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Colagenase 0,1% </td><td></td><td></td><td>10 mL por cordão, aquecido a 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Frascos para cultura de tecidos</td><td></td><td></td><td>T75, um por cordão.</td></tr><tr><td>Meio Hanks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tesoura</td><td></td><td></td><td>esterilizada</td></tr><tr><td>béquer</td><td></td><td></td><td>esterilizado</td></tr><tr><td>tubos de 50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (huvec)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

A angiogênese é um processo de várias etapas complexas, onde, em resposta a estímulos angiogênicos, novos vasos são criados a partir da vasculatura existente. Estes passos incluem: degradação da membrana basal a proliferação e migração (sprouting) das células endoteliais (CE) na matriz extracelular, o alinhamento da CE em cordas, formação de lúmen, a anastomose, e formação de uma nova membrana basal. Muitos ensaios in vitro têm sido desenvolvidos para estudar este processo, mas a maioria apenas imitar determinadas fases da angiogênese, e morfologicamente os vasos muitas vezes não se assemelham a vasos in vivo. Aqui demonstramos um otimizado ensaio in vitro que utiliza a angiogênese umbilical humano veia CE e fibroblastos. Este modelo recapitula todas as etapas chave no início da angiogênese, e mais importante dos vasos mostrar lumens patente intercelular cercado por CE polarizada. Vasos podem ser facilmente observados por contraste de fase e microscopia de lapso de tempo, e recuperados em forma pura para aplicações a jusante.

Este protocolo de vídeo ilustra o isolamento e cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) de cordão umbilical humano. Uma vez isolados essas células podem ser usadas em ensaios de angiogênese in vitro como o Gel de fibrina Optimized Bead Assay também demonstrada pelo laboratório Hughes.

Isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)

A angiogênese é um processo complexo de múltiplas etapas, no qual, em resposta a estímulos angiogênicos, novos vasos são criados a partir da vasculatura existente. Essas etapas ...

Olá, meu nome é Jager Davis e hoje vou mostrar como isolar células endoteliais de veia umbilical humana, também conhecidas como ic. Usaremos uma variedade de meios, começando com solução salina balanceada de Hank, que será utilizada para limpar nossas células de quaisquer hemácias ou outros contaminantes que possam estar na veia. Em segundo lugar, usaremos colagenase ressuspendida em DPBS, e essa solução será empregada para destacar nossas ubic da veia, e faremos o plaqueamento em meio 20%effect, que é M1 99 com FBS ativado pelo calor e solução pen stripp.Também vamos suplementar nossa suspensão de Resus com suplemento de crescimento para células endoteliais da BD Biosciences. Pronto, tenho um par de tesouras de dissecação. Vou fazer um corte reto através do cordão assim.Em seguida, vou prosseguir com a limpeza do cordão. Então, o que farei é identificar as artérias e a veia. Há duas artérias e uma veia.Normalmente identifico as artérias aos pares. Elas estão saindo em sua direção. Então temos uma bem aqui e outra artéria bem aqui.E como você pode ver, a veia está realmente entrando no cordão, e é aí que vamos colocar nossa agulha tipo borboleta. Estamos usando uma agulha tipo borboleta Accutane de calibre 21 e três quartos de polegada. Então, abra-a.Vou apenas inserir assim mesmo. Novamente, vou identificar as artérias. Temos uma artéria e a segunda artéria, e então temos nossa veia.Então, vou pegar a agulha tipo borboleta e inseri-la na veia de forma muito suave, mas você pode encontrar alguma resistência. Gosto de girar um pouco o cordão enquanto empurro a agulha ao mesmo tempo, com um movimento como este, e continuar até que as asas da agulha borboleta fiquem alinhadas com o cordão, assim. E está pronto; prossiga e feche a pinça.O que vou fazer agora é encher duas seringas de 20 ml com 20 ml de tintas. Em seguida, vou encher um tubo cônico de 50 ml com cinco ml de efeito 20%. E depois vou pipetar 10 ml de DPBS para um desses tubos cônicos de 15 ml.Então, nesses 15 mL de DPBS, vou adicionar 10 miligramas do nosso pó de colagenase, que medirei em uma balança. E vou ressuspender a colagenase apenas invertendo o tubo algumas vezes até que o pó se solte das paredes do tubo. Após cerca de cinco ou seis inversões, vou filtrar esterilmente a colagenase usando uma seringa de 10 mL para adicionar ao filtro.E agora estamos prontos para passar esses meios através do cordão. O que fiz foi despejar o DPPS restante neste balão de um litro e vou colocá-lo no banho-maria a 37 graus para aquecê-lo. Esse meio será usado para incubar nosso cordão por cerca de 15 minutos.Esta é a nossa solução de colagenase filtrada. Vou colocar este tubo cônico no banho-maria a 37 graus, permitindo que aqueça, e usarei isso posteriormente no procedimento para desprender a úvea do interior de nossa veia. Então, o que farei em seguida é prender o cordão no ponto da agulha tipo borboleta e passarei 20 mL de Hanks pelo cordão para remover quaisquer células sanguíneas.Após fixar a agulha tipo borboleta, vou injetar 20 mililitros do nosso hanks. Vou fazer isso muito lentamente para evitar qualquer rompimento da veia. Esta é mais ou menos a velocidade com que você deseja que o hanks saia, mas não deve haver um fluxo contínuo do hanks.Isso significa que você está forçando demais. Então eu geralmente faço, sabe, gota a gota. E novamente, estou empurrando os maços para limpar a veia.E você expõe nossas células terminais. Então, depois disso, passamos por todas as nossas suspensões. Vou prosseguir e estender o cordão, e após isso vou prender a extremidade inferior do cordão e remover a seringa, fixando-a em um saco de resíduos biológicos.Em seguida, vou acoplar uma nova seringa de 10 mil. Ok, agora vou injetar colagenase através do cordão, o que serve para remover quaisquer resíduos remanescentes que possam estar presentes em nossa veia. Vou injetar a colagenase apenas na quantidade necessária.Então, quando sair pela extremidade aqui, veremos uma cor aproximadamente igual à da seringa. Depois disso, vou prender a extremidade inferior do cordão. O próximo passo será injetar um pouco mais de colagenase, apenas o suficiente para que possamos ver o cordão se expandir.Depois que o cordão se expandir um pouco, vou começar a massagear o cordão, partindo da esquerda para a direita. Normalmente uso três dedos com uma pressão moderadamente firme. É quase como enrolar massa de macarrão.Você não quer empurrar o cordão com muita força, nem com pouca força. Se empurrar com muita força, corre o risco de contaminação por músculo liso. Mas se fizer muito suavemente, não irá soltar nenhum dos Q de volta.Então, cerca de cinco a seis segundos em um mesmo local, avançando gradualmente para baixo. Vou, então, transferir o cordão da mesa para o banho-maria a 37 graus, e deixarei em incubação por 15 minutos. Assim, um lote pode precisar ser incubado por 15 minutos.Outro lote pode ser de 20 minutos, e um terceiro lote pode ser de 10 minutos. Portanto, é importante otimizar o tempo de incubação para o nosso lote específico. Aqui é de 15 minutos.Vamos seguir em frente e remover nossos cabos do banho DPVS. Vamos colocá-lo aqui por um momento. Removemos a tampa do nosso tubo cônico de 15 ml contendo nossos 5 ml de feck 20%.O 20%feck possui um inibidor de tripsina, portanto, interromperá a ação de nossa colagenase. Então, vou segurar o cordão acima do tubo com nossa tesoura. E o que vou fazer agora é cortar ao longo da linha de nossa pinça.Você move a seção inferior para cá. Ok, agora temos um corte fresco na extremidade do nosso cordão. E o que vou fazer em seguida é injetar a nossa colagenase.E novamente, assim como com os hanks, você não quer empurrar muito rápido. E essa é mais ou menos a velocidade com que você deve empurrar o meio imediato. E isso será tudo para a nossa colagenase.Às vezes, você perceberá que a seringa está presa um pouco apertada demais. Nesses casos, o que farei é usar o grampo que tínhamos no nosso cordão umbilical e, basicamente, segurá-lo bem aqui e girar suavemente, apenas o suficiente para afrouxar, permitindo que eu a remova com a mão ou que ela se solte sozinha. Em seguida, pegarei nossa seringa restante de 20 mil de hangs e a conectarei à nossa agulha, empurrando todo o volume de hangs.Mais uma vez, vou empurrar muito lentamente, assim como fiz com a colagenase e a outra seringa de Hanks, aqui vai gota a gota. Essa é mais ou menos a velocidade com que você deve injetar o meio. Esta solução contém 20% de efeito são Hanks e nossa solução de colagenase.O que vou fazer agora é colocá-lo em uma centrífuga e centrifugar por cinco minutos a 1200 RPM. Vou verificar novamente para garantir que a tampa está segura. Dois, e vou colocá-lo em nossa centrífuga.Centrifugamos por cinco minutos a 1200 RPM. Portanto, centrifugamos nosso tubo cônico de 50 ml por cinco minutos a 1200 RPM. O que obtemos é um pequeno pellet no fundo do tubo. Esse pellet é composto por algumas hemácias remanescentes e nossas células endoteliais.O que farei em seguida será aspirar o Bernet e o reus, suspender nosso pellet e adicionar cinco mililitros de 20% fed pipe, pipetando suavemente para cima e para baixo algumas vezes até que pareça haver pouca matéria particulada na suspensão. Vou pipetar os cinco mililitros inteiros e placa-los em um frasco T25. Tentarei ter cuidado para não gerar bolhas.E vou adicionar meu ECPS. Vou adicionar 50 microlitros e, em seguida, agitar suavemente o frasco para garantir que todo o ECPS se distribua dentro do frasco. É isso.Prossiga. O frasco e incubado a 37 graus.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Os cordões umbilicais são usados ​​para isolar as células do músculo liso por caminhos diferentes. Neste trabalho utilizou-se o tratamento enzimático de células musculares lisas isoladas.

Isolamento da Human Umbilical células musculares arteriais (HUASMC)

Nós fornecemos um método para isolar e populações de cultura pura de células endoteliais válvula cardíaca (VEC). VEC pode ser isolado de ambos os lados da cúspide ou folheto e imediatamente a seguir, a célula intersticial subjacente isolamento (VIC) é simples.

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Um método de quantificação da aderência de neutrófilos é relatado. Este método cria um ambiente dinâmico de fluxo semelhante ao encontrado em um vaso sanguíneo. Ele permite a investigação de adesão de neutrófilos, quer moléculas de adesão purificadas (ligando) ou substrato de células endoteliais (HUVEC) num contexto semelhante ao ambiente in vivo com tensão de cisalhamento.

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

Este protocolo está preparado para compartilhar nosso método de isolamento de células endoteliais coronárias de camundongos para fins de imagem ou para conduzir experimentos biológicos moleculares.

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Protocolos para cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), transfecção transitória de marcadores marcados com fluorescência de crescimento de microtúbulos, imagens de células vivas e análise automatizada da dinâmica de crescimento de microtúbulos interfásicos são detalhados.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

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