Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

Hi.C é um método para identificar interações de cromatina de longo alcance de forma imparcial em todo o genoma. Primeiro, as células são fixadas com formaldeído, as células são lisadas e o DNA é posteriormente fragmentado com uma enzima de restrição. Em seguida, um resíduo biotinilado é incorporado enquanto os cinco salientes principais são preenchidos em romba e a ligadura é realizada sob condições diluídas que favorecem eventos de ligação entre cruzamentos e fragmentos de DNA.

A biblioteca é cortada e as junções são puxadas para baixo com contas de estreptococo havein. As junções purificadas podem ser posteriormente analisadas usando um sequenciador de alta produtividade, resultando em um catálogo de fragmentos interagindo. Esses resultados nos fornecem insights sobre o dobramento da cromatina, revelando a presença de territórios cromossômicos, a compartimentalização com do genoma em cromatina aberta e fechada e evidências para a organização Fractal Glo na escala Megabase.

Olá, eu sou Nka Van Bergham do Laboratório Field Decker, no programa de função e expressão gênica da Faculdade de Medicina da Universidade de Massachusetts. Olá, eu sou Ez Lieberman Aiden, do laboratório de Eric Lander no Broad Institute de Harvard e no Massachusetts Institute of Technology. Sou Louis Williams, do grupo de pesquisa e desenvolvimento de biologia molecular do Broad Institute, e depois Maxima Mackay, do laboratório de Len Muni, do Instituto de Tecnologia de Massachusetts.

Hoje vamos mostrar a você um procedimento para captura de confirmação cromossômica em todo o genoma chamado alto C. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para explorar experimentalmente a arquitetura do genoma humano. A primeira parte do procedimento que mostraremos acontecerá na Faculdade de Medicina da UMass e a segunda parte será realizada no Instituto Prude. Também mostraremos como usamos os resultados do experimento de alto C para simular a dinâmica do genoma no MIT.

Então vamos começar. Então, vamos, vamos começar. O Hi C começa com a reticulação de células, que é um método comum na captura de confirmação cromossômica.

Para começar, crescer entre duas vezes 10 até sete e 2,5 vezes 10 para sete células de mamíferos, seja uma Durant ou em suspensão e reticulação, as células estão em 550 microlitros de tampão de lise usando homogeneizador. Gire a cromatina a 5.000 RPM e lave o pellet duas vezes com 500 microlitros de buffer NEB dois qu em cinco tubos numerados e adicione qualquer buffer B. Dois para um volume final de 362 microlitros.

Adicione 38 microlitros de 1% de SDS, misture cuidadosamente e incube a 65 graus Celsius por 10 minutos. Coloque os tubos novamente no gelo imediatamente e tempere o SDS adicionando 44 microlitros de Triton X 100 misturados cuidadosamente em 400 unidades de Hindi 3 e incubando a 37 graus Celsius durante a noite durante a rotação. Os próximos passos são específicos de alta densidade C e incluem marcar as extremidades do DNA com biotina e realizar a ligação das extremidades rombas de fragmentos reticulados.

Essa etapa permitirá que as junções de ligação sejam purificadas posteriormente no tubo. Não se deve passar pela etapa de euforia por biotina e, em vez disso, deve servir como um controle de três C, para garantir que as condições de digestão e ligação sejam ideais para preencher os avanços dos fragmentos de restrição e marcar as extremidades do DNA com biotina nos quatro tubos restantes. Adicione D-A-T-P-D-G-T-P e DTTP aos tubos dois a cinco.

Também adicione biotina elated DCTP e Klino. Misture cuidadosamente e incube por 45 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, coloque os tubos no gelo e depois adicione 86 microlitros de SDS a 10% em todos os tubos para inativar as enzimas.

Incube os tubos a 65 graus Celsius por exatamente 30 minutos e coloque-os no gelo imediatamente em seguida. Para favorecer eventos de ligação entre fragmentos reticulados, a ligação é realizada sob condições extremamente diluídas. Trabalhando no gelo, adicione 7,61 mililitros de mistura de ligadura a cada um dos cinco tubos de 15 mililitros.

Depois, transfira cada mistura de cromatina digerida para o tubo correspondente. Adicione 10 microlitros de ligase de DNA T 4 ao tubo um para realizar uma ligadura regular de três C. Depois, adicione 50 microlitros de ligase de DNA T 4 aos tubos dois a cinco para realizar a ligadura C alta na extremidade romba.

Misture os tubos invertendo-os e incube por quatro horas a 16 graus Celsius. Após a incubação, a proteína degrada e reverte a reticulação cruzada da CNA, adicionando 50 microlitros de proteinase K por tubo e incubando os tubos durante a noite a 65 graus Celsius. Adicione mais 50 microlitros de proteinase K por tubo no dia seguinte e continue incubando a 65 graus Celsius por mais duas horas.

Chame as misturas de reação e transfira-as para cinco tubos cônicos de 50 mililitros. Purifique o DNA desses tubos realizando uma extração de fenol. Adicione 10 mililitros de fenol e faça vórtice por dois minutos.

Gire os tubos por 10 minutos a 3.500 RPM e transfira cuidadosamente o máximo possível da fase aquosa para um novo tubo de 50 mililitros. Repetir a extração usando fenol clorofórmio e precipitar o DNA com etanol após a centrifugação do DNA precipitado por etanol; cada pellet de DNA é dissolvido em 450 microlitros de um tampão XTE e transferido para um tubo centrífuga de 1,7 mililitros. Outra rodada de purificação é realizada com duas extrações de fenol clorofórmio a 500 microlitros de fenol, clorofórmio e vórtice para uma centrífuga de um minuto para os tubos por cinco minutos a 14.000 RPM e transferência da fase aquosa para um novo tubo após a segunda extração.

O DNA é precipitado por etanol após a centrifugação do DNA precipitado; cada pellet de DNA é lavado uma vez com etanol de 70% e depois ressuspenso em 25 microlitros de um tampão XT, degradando qualquer RNA presente adicionando um micrólitro de RNAs por tubo e incubando os tubos por 30 minutos. A 37 graus Celsius. Retirar o alto teor de C dos tubos dois a cinco, mantendo o tubo um separado como controle de três C.

Agora é um bom momento para examinar a quantidade e a qualidade das bibliotecas, rodando uma alíquota em um gel AASE 0,8% marcando a eficiência de ligação do HI C, que deve ser avaliada com um ensaio de digestão por PCR. A criação das extremidades rombas e a ligadura realizadas no procedimento HI C criarão sítios de restrição para a endonuclease em HE 1; fragmentos amplificados das três bibliotecas C e C alto podem ser digeridos com Hindi três e NHE 1 para determinar quão bem as extremidades rombas foram geradas, e alguns fragmentos não terão sido ligados. Remova a biotina dessas extremidades não ligadas usando a atividade de nuclease exon da DNA polimerase T4, conforme descrito no protocolo escrito.

Purifique novamente o DNA usando extração de fenol clorofórmio e precipitação de etanol, e ressuspenda os pellets de DNA em um volume total de 100 microlitros de água. Se a amostra passou pelos ensaios de controle de qualidade, o protocolo continua com o bio timple down e sequenciamento. Obrigado.

Para tornar o DNA BIOTINILADO adequado para sequenciamento de alta potência, o DNA deve ser compartilhado em um tamanho de 300 a 500 pares de bases com um instrumento CAVAS S de dois pontos. As DNS de SheS. são reparadas adicionando 10 x tampão de lation, DN TPS T quatro DNA polimerase T 4 POLINUCLEOTÍDEO quinase transparente agora DNA polimerase e água incubando as amostras por 30 minutos em temperatura ambiente após a incubação, usando uma coluna Kaya Gym MinLu para purificar o DNA conforme as recomendações do fabricante. Após carregar o DNA na coluna e lavar a coluna, elude o DNA com 50 microlitros de um buffer XTLE duas vezes, depois anexe o DATP aos três promen do DNA reparado final adicionando 10 XNEB buffer, dois fragmentos de DATP em água e exonucleases.

Incube a reação por 30 minutos a 37 graus Celsius para inativar o fragmento de cile. Incube as reações por 20 minutos a 65 graus Celsius e, em seguida, chame as reações no gelo usando um speed vac, reduzindo os volumes da reação para 20 microlitros. Em seguida, coloque o DNA em um gel de Aris 1,5% com um XTAE e funcione por 3,5 horas a 80 a 90.

Os Vols excisam fragmentos de DNA entre 300 e 500 pares de bases e os purificam com um kit de extração de gel Qiagen usando de duas a quatro colunas, dependendo do peso do gel. Combine os oito amarelos das colunas rápidas do caiaque e leve o volume final para 300 microlitros com um buffer XTLE. Por fim, determine a concentração de DNA com o ensaio QU usando o qubit e calcule a quantidade total de DNA nesta seção do protocolo.

As junções de ligação são purificadas do pool de DNA, permitindo a identificação eficiente de fragmentos de cromatina interagindo por sequenciamento de extremidades pareadas. Realize todas as etapas subsequentes nos tubos de baixa ligação do DNA. Prepare as contas para biotina.

Puxe para baixo lavando 150 microlitros de estreptococo magnético A resuspenso em esferas duas vezes com 400 microlitros de um tampão x tween. Essas etapas, em lavagens futuras, consistem em cinco etapas: adicionar tampão às esferas, transferir a mistura para um novo tubo e girar a amostra por três minutos em temperatura ambiente. Recuperando as esferas usando um concentrador de partículas magnéticas.

Estou removendo o supinado reus. Dobre as esferas em 300 microlitros de dois x no tween buffer e combine com 300 microlitros de CDNA alto. Deixe que a biotina marcada como alto CDNA se ligue às esferas de strep din incubando a mistura em temperatura ambiente por 15 minutos com rotação.

Recupere a estréscia ligada ao DNA A em esferas com um concentrador de partículas magnéticas e remova o sobrenadante. Lave as esferas com 400 microlitros de um tampão x no tween, seguido por 100 microlitros de uma ligadura x. Amortecedor. Ressuspenda as esferas em 50 microlitros de um tampão de ligadura x e transfira a mistura para um novo tubo.

Para preparar o DNA para o Illumina pareado no sequenciamento, pegue a quantidade total de entrada do usuário de DNA para a coleta de biotina para baixo, que foi calculada anteriormente usando o ensaio quant, e divida-a por 20 para estimar a quantidade de CDNA alto que foi puxada para baixo e está disponível para ligação. Adicione seis OLs P de Illumina pareados e adaptadores por micrograma de alto CDNA disponíveis para ligadura. Use 1.200 unidades de ligase de DNA T quatro para ligar os adaptadores ao DNA.

Incube as duas horas em temperatura ambiente. Remova adaptadores pareados não ligados recuperando as esferas com alta ligação a CDNA e lavando as esferas duas vezes com 400 microlitros de um buffer x tween. Lave as esferas com 200 microlitros de um x, sem tween buffer, seguido por 200 microlitros e depois 50 microlitros de um buffer XNEB.

Duas depois da última lavagem. Ressuspenda as esferas em 50 microlitros de um buffer NEB dois e transfira para um novo tubo. Determinar o número de ciclos necessários para gerar produto de PCR suficiente para sequenciamento.

Configure quatro reações de teste por PCR com 6, 9, 12 ou 15 ciclos. Determinar o número ótimo do ciclo rodando as reações de PCR em um gel de poliacrilamida de 5 cents e tingindo com cyber green, garantindo a ausência de bandas espúrias e a presença de uma mancha entre 400 pares de 600 bases, que é o comprimento dos produtos compartilhados após a ligação aos adaptadores, amplificando o restante da rodada da biblioteca de alta C desmontada, ter em esferas em uma PCR em grande escala com o número ótimo de ciclos de PCR. Retire os produtos de PCR dos poços separados e recupere as contas.

Mantenha 1% dos produtos de PCR em grande escala separados para rodar em gel e purifique o restante do produto com 1,8 vezes o volume e esferas puras, conforme recomendações do fabricante. Elude o DNA com 50 microlitros de um buffer XTLE e compare 1% do produto de PCR purificado com esferas de PU com o 1% do produto original de PCR em um gel de acrilamida de 5%. Garantindo a remoção bem-sucedida da sequência de primers de PCR, a biblioteca de alto C com sequenciamento de extremidades pareadas Illumina alinham cada extremidade independentemente usando MAC para identificar fragmentos de cromatina interagindo.

Os seguintes resultados são esperados quando o protocolo de alta C é executado tecnicamente bem e pode ser considerado padrão de controle de qualidade. Os passos de controle de qualidade devem revelar que tanto três bibliotecas C quanto C alto funcionam como faixas bastante apertadas maiores que bases de 10 quilos. Um exame de DNA indica baixa eficiência na ligadura.

Normalmente, a eficiência da ligação é ligeiramente menor em uma biblioteca de alta C em comparação com um template de três C. Alta marcação C e eficiência de ligação podem ser estimadas pela digestão de um produto de três CPCR. Três entroncamentos C são cortados pelo Hindi Three e não pelo NHE 1.

O contrário vale para junções em C alto. Este ensaio de digestão PCR mostra que 70% dos amplicons de alto C são cortados pelo NHE 1 e não pelo HI Hindi. Three. Confirmando a marcação eficiente das junções de ligação, a análise das leituras sequenciadas deve mostrar que as leituras tanto das interações intracromossômicas quanto intercromossômicas indicadas pelas linhas azul e vermelha se alinham significativamente mais perto dos três locais de restrição do Hindi, em comparação com as leituras geradas aleatoriamente mostradas em verde.

Em um experimento bem-sucedido, 55% dos pares de leitura alinháveis representam interações entre cromossômicos. 15% representam interações intracromossômicas entre fragmentos separados por menos de 20 kilobases, e 30% são pares de leitura intracromossômicos com mais de 20 kilobases de distância. Essa distribuição pode ser amostrada antes do sequenciamento de alto rendimento como uma forma de controle de qualidade.

Clonagem e sequenciamento Sanger de cerca de 100 clones geralmente é suficiente. As interações da cromatina podem ser visualizadas como um mapa de calor onde os eixos x e Y representam a ordem genômica de sinal baixo e cada pixel representa o número de interações observadas entre eles. Normalmente, fragmentos de DNA muito próximos entre si no genoma linear tendem a interagir frequentemente entre si.

Isso é visto nos mapas intracromossomos ou de calor como uma diagonal proeminente. Os resultados a seguir mostram diferentes formas de analisar os dados para revelar vários níveis de genoma. A organização que plota a probabilidade de contato versus a distância genômica mostra que a probabilidade de contato diminui em função da distância genômica, eventualmente atingindo um platô a cada distância.

As interações intracromossômicas mostradas na linha sólida são enriquecidas em relação às interações cromossômicas inter-interch representadas pelas linhas traçadas. Isso implica diretamente que a presença de territórios cromossômicos calculando o número observado versus esperado de contexto intercromossômico entre todos os pares de cromossomos revela associação preferencial entre pares particulares de cromossômicos. Pequenos cromossomos ricos em genes interagem preferencialmente entre si, indicado pela cor vermelha brilhante.

Cromossomos individuais também podem ser examinados. O mapa de calor bruto pode ser ajustado usando um mapa de calor esperado para considerar a distância genômica entre pares de loci, resultando em um mapa de calor observado acima do esperado. Então, uma matriz de correlação pode ser produzida correlacionando as linhas e colunas dos mapas de calor observados sobre os esperados.

Usando análise de correlação, demonstrou que o genoma humano se segrega em dois compartimentos. Isso é ilustrado pelo padrão xadrez. Nos mapas de calor de correlação usando dados de alto grau de carbono, novos insights foram obtidos sobre o dobramento da cromatina na escala de megabase.

Um modelo polimérico comum de empacotamento de cromatina sugeriria que o pacote de cromatina entra em um GLO de equilíbrio. Plotar a probabilidade de contato é uma função da distância ilustra que a probabilidade de contato escala como uma lei de potência com distância genômica cuja inclinação é aproximadamente menos um. Isso não é consistente com o comportamento de um Glo de equilíbrio, mas corresponde às expectativas para uma estrutura alternativa conhecida como glo fractal. Aqui são mostradas duas estruturas gulares.

A coloração corresponde à distância a partir de um dos extremos, variando do azul ao verde-ciano, amarelo, laranja e vermelho. E, assim como os glóbulos de equilíbrio, glóbulos fractais não possuem emaranhamentos em um Glo fractal. Loci próximos ao longo do contorno tendem a estar próximos em 3D, levando à presença de blocos monocromáticos.

Tais blocos não são encontrados no equilíbrio Glo. A ausência de emaranhamentos também pode ser demonstrada removendo a força que restringe os glóbulos e permitindo que os glóbulos se expandam, o glo fractal condensa rapidamente. Enquanto o Glo de equilíbrio não tem porque é muito embaraçado.

Acabamos de mostrar como transformar um analisador em uma biblioteca de alta C. Ao realizar esse procedimento, é importante lembrar de fazer os controles adequados para garantir uma ligadura e purificação eficientes em alta C. O número de leituras determinará, em última instância, a resolução dos mapas de interação.

Usamos cerca de 30 milhões de leituras para gerar mapas de interação do genoma humano com uma resolução de aproximadamente uma megabase. Para aumentar a resolução por um fator de N, o número de leituras precisa ser aumentado por um fator de n ao quadrado. Espero que você goste de aprender sobre a estrutura do genoma humano.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.