Baseados em DNA Peixe Protocolo Identificação de Espécies

O Sistema de Identificação de Espécies de Peixes é um método simples, rápido e preciso baseado em DNA para identificar as espécies de peixes presentes em uma determinada amostra. As amostras de peixe são tratadas com proteinase K para liberar ácidos nucléicos em solução. O DNA genômico do peixe é então isolado e amplificado por PCR usando primers que se ligam a sequências encontradas em todos os genomas de peixes.

Os produtos de PCR são então digeridos com três enzimas de restrição diferentes e resolvidos no bioanalisador Agilent 2100. Os comprimentos dos fragmentos produzidos nas reações de digestão podem ser usados para determinar as espécies de peixes usando polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição ou software de correspondência de padrões RFLP. Olá, sou Rachel Formosa, da Agilent Technologies.

Hoje mostraremos um procedimento para identificação de espécies de peixes baseado em DNA. Este procedimento é um método de triagem que permite identificar as espécies de peixes presentes em amostras frescas, congeladas, picadas, cozidas, secas ou processadas de outra forma. E isso pode ser feito em menos de um dia de trabalho.

Usamos esse procedimento para estudar a autenticidade dos frutos do mar, o que é muito importante para a indústria de frutos do mar, pois a substituição e a rotulagem incorreta podem ter consequências econômicas, ambientais e de segurança alimentar significativas. Além disso, pode ser especialmente difícil determinar as espécies de peixes por identificação visual e outros métodos tradicionais. Depois que um peixe é processado, o teste de DNA fornece um resultado muito mais preciso e confiável.

Então vamos começar. Comece a preparar amostras para extração de DNA colocando de 10 a 1000 miligramas de cada amostra de tecido de peixe cru ou cozido em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada peixe. Amostra de 220 microlitros de solução de caixa de proteinase recém-preparada e pipeta para cima e para baixo.

Incubar os tubos a 65 graus Celsius por 10 minutos após a centrífuga de incubação por três a cinco minutos a 14.000 Gs para peletar quaisquer tecidos não digeridos. Em seguida, transfira cuidadosamente 150 microlitros de cada sobrenadante para um tubo novo de 1,5 mililitro, evitando qualquer material não digerido na parte inferior e material oleoso presente na parte superior. O sobrenadante agora será usado para extração de DNA genômico.

Comece a extração de DNA genômico adicionando 500 microlitros do tampão de ligação de ácido nucleico a cada amostra. Isso elevará o volume total da amostra para 650 microlitros. Vortex a amostra até homogeneizar.

Em seguida, transfira cada amostra para um copo de rotação de ligação de DNA que foi colocado em um dos dois tubos de receptáculo de mililitros fornecidos no kit. Encaixe a tampa do tubo na parte superior do copo giratório. Gire as amostras por um minuto a 14.000 Gs para carregar o DNA na matriz do copo de rotação.

Após a centrifugação, remova os copos de centrifugação, descarte o filtrado e coloque os copos de volta nos tubos do recipiente. Adicione 500 microlitros de um tampão de lavagem com alto teor de sal. Tampe os tubos e centrifugue novamente após a centrifugação.

Rejeitar o filtrado e voltar a colocar os copos de centrifugação nos tubos dos recipientes. Agora adicione 500 microlitros de etanol a 80%. Tampe o tubo e gire a 14.000 Gs por um minuto.

Repita a lavagem com etanol mais duas vezes após a terceira lavagem em etanol a 80% novamente, descarte os filtrados. Recoloque os copos de centrifugação nos tubos do receptáculo e, desta vez, gire por dois minutos para secar a matriz de fibra. Agora transfira os copos giratórios para tubos coletores de 1,5 mililitro.

Adicione 100 microlitros de buffer de evolução a cada copo de centrifugação diretamente na matriz de fibra dentro do copo. Em seguida, encaixe as tampas dos tubos coletores nos copos giratórios e incube-os em temperatura ambiente por um minuto. Após a incubação, centrifugar as amostras à velocidade máxima durante um minuto.

Em seguida, descarte o copo de centrifugação e tampe os tubos. Se as concentrações de DNA forem medidas, esperam-se concentrações que variam de cinco nanogramas por microlitro a 500 nanogramas por microlitro. O DNA agora pode ser armazenado a quatro graus Celsius por até um mês para armazenamento de longo prazo, coloque o DNA em menos 20 ou menos 80 graus Celsius.

Realize a PCR usando os primers e reagentes fornecidos no kit de reagentes P-C-R-R-F-L-P. De acordo com o protocolo escrito que o acompanha, recomenda-se executar cada amostra, incluindo o controle anti não modelo positivo em duplicata enquanto o PCR está em execução. Prepare misturas mestras de enzimas de restrição para as digestões com DTE E um HAE três e NL três combinando os seguintes componentes em ordem, 1,5 microlitros de água destilada estéril, 0,5 microlitros de 10 x tampão enzimático e 0,5 microlitros de 10 x enzima.

Preparar o suficiente para todas as amostras mais um volume de reacção, excesso de mistura de três reagentes. Em seguida, distribua 2,5 microlitros para cada tubo de reação rotulado com a amostra e o nome da enzima. Quando a PCR estiver concluída, remova as amostras do termociclador e coloque-as no gelo.

Adicione 2,5 microlitros de cada produto de PCR a cada um dos três tubos de digestão de restrição para essa reação. DDE um HAE três e NLA três. Próximo vórtice.

Centrifugue e incube brevemente as digestões a 37 graus Celsius por duas horas. Se for mais conveniente, as digestões também podem ser incubadas durante a noite. Após a digestão, incube as reações a 65 graus Celsius por 15 minutos.

Em seguida, adicione um microlitro de EDTA 60 milimolar a cada tubo para encerrar a reação e o vórtice. Usando o kit de reagentes do bioanalisador Agilent, prepare e carregue o resumo de restrição nos poços do chip de DNA A de acordo com o guia do kit. Para cada amostra, todos os três resumos devem ser carregados no mesmo chip.

Em seguida, vórtice o chip e carregue-o na máquina. Após o término da execução, vá para o contexto do ensaio e selecione a guia de resumo do chip. No campo de nome da amostra, insira um nome de amostra para todos os 12 poços do chip para identificar as espécies de peixes para as amostras de DNA de teste.

Inicie o programa decodificador RFLP clicando em arquivo. Em seguida, abra o arquivo XAD. A caixa de diálogo aberta será aberta.

Agora selecione o arquivo XAD para o chip de DNA usado. E clique em abrir para ver uma lista das amostras carregadas no chip. Selecione os três resumos correspondentes à primeira amostra de DNA.

Na coluna de enzimas, especifique as enzimas de restrição que foram usadas no campo rotulado como altura mínima do pico como porcentagem do marcador inferior. O valor padrão é 10%se necessário. Este valor pode ser reduzido para identificar pequenos picos que foram perdidos ou elevados para descartar picos resultantes de ruído não específico no eletroferograma.

Depois de fazer ajustes no valor mínimo da altura de pico, clique em reintegrar. Agora clique em calc na parte inferior da caixa de diálogo. Os dados de comprimento do fragmento obtidos na execução do bioanalisador preencherão os campos do software.

Em seguida, na lista suspensa de pontuação no canto superior esquerdo da tela, selecione dados. Se a amostra de peixe consistir em uma única espécie ou mistura de peixes, se a amostra puder consistir em uma mistura, a tabela na parte inferior da tela rotulada como lista de pontuação combinada. As melhores espécies combinam com base nos resultados de todas as três reações de digestão.

Combinações perfeitas com pontuação de um são destacadas em verde. As correspondências próximas são destacadas em amarelo na parte superior da tela. O valor de corte inferior designa o tamanho mínimo do fragmento usado na análise e o valor de tolerância de correspondência determina o quão próximo em comprimento um fragmento deve estar do fragmento previsto para ser considerado uma correspondência.

Os valores mostrados são as configurações padrão e podem ser ajustados. Repita essas etapas para análise das amostras de DNA restantes na ponta. Amostras de DNA de quatro espécies diferentes de peixes foram isoladas, amplificadas e digeridas usando o método descrito neste vídeo.

Um gel bioanalisador mostrando as amostras de digestão de restrição é mostrado aqui usando o Agilent Bioanalyzer e o decodificador RFLP. Padrões de dobra de software são usados para identificar os peixes aqui. A primeira amostra é corretamente identificada como truta, a segunda como atum, a terceira como solo rochoso.

E a última amostra como bacalhau específico. Acabamos de mostrar como realizar a identificação de espécies de peixes com base em DNA usando o método P-C-R-R-F-L-P da agilent. Ao fazer este procedimento, é importante evitar a contaminação cruzada de amostras, pois o método é muito sensível.

Então é isso. Agora você sabe como identificar com rapidez, facilidade e precisão as espécies de peixes presentes em suas amostras. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.