Desenvolvimento de imagem automatizada e análise química para as telas de zebrafish.

Neste vídeo, é realizada uma triagem de alto conteúdo baseada em imagens para avaliar a modulação por moléculas pequenas da via de sinalização do fibroblasto fator de crescimento Rasm map quinase em embriões de peixe-zebra. Machos transgênicos e fêmeas selvagens de peixe-zebra são cruzados em uma gaiola de reprodução. Os ovos fertilizados caem no fundo e são coletados e transferidos para uma placa de Petri. Os embriões são incubados durante a noite e, em seguida, colocados em poços individuais de uma placa de fundo redondo com 96 poços.

O pequeno molécula BCI é adicionado para hiperativar a sinalização de FGF e a placa é incubada por seis horas. Imagens de cada poço são capturadas com um leitor de placas confocal e analisadas usando um algoritmo desenvolvido por nós, que informa as intensidades fluorescentes em estruturas embrionárias específicas. Olá, sou Hiba Kado do laboratório do Dr. Michael Chang do Departamento de Microbiologia e Genética Molecular da Universidade de Pittsburgh.

Olá, sou Andrea Spock do Instituto de Descoberta de Fármacos da Universidade de Pittsburgh. Hoje vamos mostrar o procedimento para criação, seleção e arranjo de embriões de peixe-zebra para tratamento químico. Em uma placa de 96 poços, utilizaremos embriões transgênicos que indicam atividades do fator de crescimento de fibroblastos e que serão tratados com uma molécula que hiperativa essa via.

Vamos mostrar como utilizamos a metodologia de triagem de alto conteúdo para adquirir, analisar e quantificar automaticamente a atividade do fator de crescimento de fibroblastos em embriões de peixe-zebra transgênicos. Este procedimento destacará a tecnologia da plataforma para utilizar peixes-zebra transgênicos e triagens químicas de alto rendimento. Então, vamos começar.

Dois dias antes do tratamento, identifique peixes-zebra transgênicos machos homozigotos e coloque-os em tanques de acasalamento individuais. Adicione divisórias aos tanques, em seguida, adicione um peixe fêmea selvagem a cada tanque e deixe os peixes nas gaiolas de acasalamento durante a noite a 28 graus Celsius. Na manhã seguinte, remova a divisória. Após uma hora, transfira os peixes para um novo tanque e despeje os embriões em uma peneira de plástico.

Transfira os embriões para placas de 100 milímetros com solução E3 e incube a 28 graus Celsius por seis a oito horas. Após a incubação, examine os embriões em um microscópio estereoscópico. Os embriões adequados para experimentos estarão passando pela gastrulação.

Neste momento, remova todos os embriões não fertilizados, que permanecerão no estágio de célula única. Além disso, remova os embriões não viáveis, que parecem opacos ou malformados. Em seguida, adicione solução E três fresca e incube durante a noite a 28 graus Celsius.

No dia seguinte, coloque os embriões sob um microscópio estereoscópico fluorescente para separar os embriões transgênicos por estágio semelhante e expressão uniforme de GFP. Embriões em 24 HPF apresentam uma fronteira visível entre o mesencéfalo e o rombencéfalo, com intensa expressão de GFP e olhos bem formados com retinas dorsais positivas para GFP. Esses embriões são ativos e se movimentarão e contorcerão dentro de seus coriões usando uma pipeta plástica de Pasteur.

Transfira os embriões de 24 HPF um a um para poços individuais de uma placa de 96 poços. Usando uma micropipeta, remova qualquer solução E três em excesso dos poços. Em seguida, utilizando uma pipeta multicanal, adicione 200 microlitros de solução E três a cada poço.

Em seguida, adicione dois microlitros de DMSO a todas as cavidades das colunas um e 12. Depois, adicione dois microlitros de BCL preparado em DMSO da seguinte forma: um micromolar às colunas dois e sete, cinco micromolar às colunas três e oito, 10 micromolar às colunas quatro e nove, 20.

De micromolar até as colunas cinco e 10. E, finalmente, 25 micromolar até a coluna seis e 11. Agora, cubra a placa com folha de alumínio e incube-a por seis horas a 28 graus Celsius.

Adicione 10 microlitros de trica a cada poço para anestesiar os embriões de 30 HPF. Em seguida, carregue a placa no software molecular devices image express ultra open meta express. Escolha uma configuração com uma objetiva Forex e diâmetro máximo de pinhole.

Configure o foco automático a laser para detectar o fundo da placa e utilize um deslocamento Z predeterminado ideal. Para detectar as regiões de interesse, defina a área de varredura como um único local de 2000 por 2000 pixels sem sobreposição. Selecione o tipo apropriado de placa e o laser de argônio de 488 nanômetros com excitação sobre comprimentos de onda de emissão de 488 sobre 525 nanômetros.

Em seguida, selecione um poço contendo um embrião tratado com veículo e clique em encontrar amostra. O instrumento realizará uma varredura de auto-foco e adquirirá uma única imagem para confirmar a aquisição adequada da imagem. Selecione aleatoriamente um poço tratado com veículo e adquira uma imagem.

Se a imagem estiver em foco e mostrar expressão de GFP na cabeça. Posicione o cursor sobre as áreas mais brilhantes e verifique se a intensidade da fluorescência está dentro da faixa da câmera de 16 bits. Menos de 65.000 unidades.

Repita esses passos com outro controle de veículo e alguns poços tratados com o composto. Se necessário, ajuste a potência do laser e o ganho de modo que as regiões mais brilhantes nas imagens do controle positivo não saturem. Em seguida, na janela de aquisição da placa e controle, escolha adquirir placa para iniciar a varredura da placa.

O instrumento adquirirá automaticamente uma imagem por poço para toda a microplaca e as arquivará em um banco de dados SQL. Após a conclusão da varredura, carregue as imagens no D definition's Developer abrindo o Developer com a opção slinger habilitada.

Crie um novo espaço de trabalho. Em seguida, no menu de arquivo, selecione importação personalizada. Depois, navegue até a pasta que contém as imagens e abra um arquivo de exemplo.

Escolha um filtro de importação que reconheça o formato de imagem e a estrutura de arquivo gerados pela plataforma molecular Devices Image Express Ultra. Para processar as imagens, abra uma imagem de controle e carregue a tecnologia de rede de cognição desejada, ou algoritmo CNT, ou conjunto de regras. O algoritmo personalizado utilizado aqui foi projetado para identificar automaticamente embrião, vitelo e cabeça, e para quantificar o brilho e a área das estruturas da cabeça que expressam GFP; execute o conjunto de regras até a etapa de detecção da cabeça e do vitelo.

Para garantir a atribuição correta da bolsa vitelínica e da cabeça, modifique o conjunto de regras para ajustar o limiar de detecção da bolsa vitelínica caso esta esteja muito grande ou muito pequena. Em seguida, execute o conjunto de regras até a etapa de detecção das estruturas brilhantes da cabeça. Para garantir a atribuição correta das áreas que expressam GFP na cabeça, modifique o conjunto de regras para ajustar o limiar de detecção das estruturas da cabeça em múltiplos da intensidade mediana até que a detecção das estruturas brilhantes da cabeça corresponda à observação visual.

Em seguida, execute manualmente todo o conjunto de regras em várias imagens escolhidas aleatoriamente geradas a partir de embriões tratados com veículo e imagens de controle positivo provenientes de embriões tratados com PCI. Para executar o algoritmo em todas as imagens da placa, selecione as placas a serem analisadas e escolha. Analisar, depois navegue até o conjunto de regras otimizado e analise todos os poços.

Usando o agendador de tarefas integrado, poços vazios ou imagens ambíguas serão automaticamente excluídos da análise durante a varredura. Um mapa de manutenção continuamente atualizado é exibido. Tanto os dados quanto as imagens estão acessíveis durante a execução para inspeção visual.

Os dados numéricos e as imagens processadas são salvos automaticamente. Após todas as imagens terem sido analisadas, os dados podem ser exportados para softwares de terceiros, como Excel, GraphPad ou prism. Esta figura mostra imagens de varredura arquivadas de um poço tratado com veículo e outro tratado com BCI, com e sem análise de CNT.

A proteína verde fluorescente aplicada, ou GFP, é detectada no olho, na fronteira entre o mesencéfalo e o rombencéfalo e nos gânglios trigêmeos de embriões transgênicos. Observe que tanto a intensidade da GFP quanto os domínios de expressão estão ampliados. Nos embriões tratados com BCI aqui apresentados, observa-se um efeito dependente da dose de BCI sobre a expressão do gene repórter GFP em embriões transgênicos.

A concentração necessária para provocar uma resposta máxima pela metade ou EC 50 foi de aproximadamente 12 micromolar. Acabamos de mostrar como criar, coletar e distribuir embriões transgênicos de peixe-zebra em placas de 96 poços. Adicionamos concentrações crescentes de PCI no ativador próprio da via de sinalização.

Também demonstramos como automatizar a aquisição de imagens de embriões transgênicos e analisamos as imagens com um algoritmo personalizado baseado em tecnologia de rede cognitiva. Com esta abordagem, conseguimos medir quantitativamente, de maneira graduada, os efeitos de um ativador de pequena molécula da sinalização do fator de crescimento de fibroblastos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de escolher cuidadosamente os embriões para minimizar a variabilidade entre os espécimes.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.