Desenvolvimento de imagem automatizada e análise química para as telas de zebrafish.
June 24th, 2010
Relata-se o desenvolvimento de um sistema automatizado para geração de imagens e análise de zebrafish embriões transgênicos em placas de vários poços. Isso demonstra a capacidade de medir os efeitos dose-dependente de uma pequena molécula, BCI, na expressão do gene Fator de Crescimento de Fibroblastos repórter e fornecer tecnologia para o estabelecimento de high-throughput telas química zebrafish.
Neste vídeo, a triagem de alto conteúdo baseada em imagens é realizada para avaliar a modulação baseada em pequenas moléculas da via do fator de crescimento de fibroblastos Rasm map quinase Em embriões de peixe-zebra, o peixe-zebra macho transgênico e a fêmea do tipo selvagem são acasalados em uma gaiola de reprodução. Os ovos fertilizados caem no fundo e são coletados e transferidos para uma placa de Petri. Os embriões são incubados durante a noite e, em seguida, colocados em poços individuais de uma placa inferior redonda de 96 poços.
A pequena molécula BCI é adicionada para hiperativar a sinalização FGF e a placa é incubada por seis horas. As imagens de cada testamento são capturadas com um leitor de placas confocais e analisadas usando um algoritmo autoprojetado que relata intensidades fluorescentes em estruturas embrionárias específicas. Olá, sou Hiba Kado do laboratório do Dr. Michael Chang no Departamento de Microbiologia e Genética Molecular da Universidade de Pittsburgh.
Olá, sou Andrea Spock, do Instituto de Descoberta de Drogas da Universidade de Pittsburgh. Hoje mostraremos o procedimento de criação, seleção e disposição de embriões de peixe-zebra para tratamento químico. Em uma placa de 96 poços, usaremos embriões transgênicos que relatam as atividades do fator de crescimento da fibra de vidro e tratados com uma molécula que hiperativa esse branco passado.
Mostraremos como usamos a metodologia de triagem de alto conteúdo para adquirir, analisar e quantificar automaticamente a atividade do fator de crescimento de fibroblastos em embriões transgênicos de peixe-zebra. Este procedimento destacará a tecnologia de plataforma para utilizar peixes-zebra transgênicos e telas químicas de alto rendimento. Então vamos começar.
Dois dias antes do tratamento, identifique o peixe-zebra transgênico macho homozigoto e coloque-o em tanques de acasalamento individuais. Adicione separadores aos tanques, depois adicione uma fêmea selvagem a cada tanque e deixe os peixes nas gaiolas de acasalamento durante a noite a 28 graus Celsius. Na manhã seguinte, remova o separador Após uma hora, mova o peixe para um novo tanque e despeje os embriões em uma peneira de plástico.
Transfira os embriões para placas de 100 milímetros com solução E três e incube a 28 graus Celsius por seis a oito horas. Após a incubação, examine os embriões sob um microscópio estéreo. Embriões adequados para experimentos serão submetidos a gases.
Neste momento, remova todos os embriões não fertilizados, que permanecerão no estágio de célula única. Além disso, remova embriões não viáveis que pareçam opacos ou malformados. Em seguida, adicione a solução E três fresca e incube durante a noite a 28 graus Celsius.
No dia seguinte, coloque os embriões sob um microscópio estéreo fluorescente para classificar os embriões transgênicos para estágio semelhante e uniforme. Expressão de GFP 24 embriões HPF mostram um limite visível do cérebro posterior médio com intensa expressão de GFP e olhos bem formados com retinas dorsais positivas para GFP. Esses embriões são ativos e se movem e se mexem em seu córion usando uma pipeta de pastagem de plástico.
Transfira os 24 embriões HPF, um de cada vez, para poços individuais de uma placa de 96 poços. Usando uma micropipeta, remova qualquer excesso de solução de E três dos poços. Em seguida, usando um pipetador multicanal, adicione 200 microlitros de solução E três a cada poço.
Em seguida, adicione dois microlitros de DMSO a todos os poços nas colunas um e 12. Em seguida, adicione dois microlitros de BCL preparados em DMSO da seguinte forma, um, micromolar nas colunas dois e sete. Cinco micromolares para três e oito, 10 micromolares para quatro e nove 20.
Micromolar para as colunas cinco e 10. E, finalmente, 25 micromolares para a coluna seis e 11. Agora cubra a placa com papel alumínio e incube-a por seis horas a 28 graus Celsius.
Adicione 10 microlitros de trica a cada poço para anestesiar os 30 embriões HPF. Em seguida, carregue a placa no software meta express ultra open de dispositivos moleculares. Escolha uma configuração com um objetivo Forex e diâmetro máximo do orifício.
Configure o foco automático do laser para detectar o fundo da placa e use um deslocamento Z ideal predeterminado. Para detectar as regiões de interesse, defina a área de varredura como um único local de 2000 por 2000 pixels sem benning. Selecione o tipo de placa apropriado e o laser de argônio de 488 nanômetros em excitação em comprimentos de onda de emissão de 488 em 525 nanômetros.
Em seguida, selecione um poço contendo um embrião tratado com veículo e clique em encontrar amostra. O instrumento realizará uma varredura de foco automático e adquirirá uma única imagem para confirmar a aquisição adequada da imagem. Selecione aleatoriamente um veículo bem tratado e adquira uma imagem.
Se a imagem estiver em foco e mostrar expressão GFP na cabeça. Posicione o cursor sobre as áreas mais brilhantes e verifique se a intensidade da fluorescência está dentro do intervalo da câmera de 16 bits. Menos de 65.000 unidades.
Repita essas etapas com outro controle de veículo e alguns poços tratados com composto. Se necessário, ajuste a potência e o ganho do laser de modo que as regiões mais brilhantes nas imagens de controle positivo não saturem. Em seguida, na janela de aquisição e controle de placas, escolha adquirir placa para iniciar a varredura de placas.
O instrumento adquirirá automaticamente uma imagem por poço para toda a microplaca e as arquivará em um banco de dados SQL Server. Assim que a digitalização terminar, carregue as imagens na definição D. Desenvolvedor abrindo o desenvolvedor com a opção de lançador ativada.
Crie um novo espaço de trabalho. Em seguida, no menu de arquivo, selecione importação personalizada. Em seguida, navegue até a pasta que contém as imagens e abra um arquivo de amostra.
Escolha um filtro de importação que reconheça o formato da imagem e a estrutura do arquivo gerada pela plataforma image express ultra da Molecular Devices. Agora, para processar as imagens, abra uma imagem de controle e carregue a tecnologia de rede de cognição desejada ou o algoritmo CNT ou o conjunto de regras. O algoritmo personalizado usado aqui é projetado para identificar automaticamente embrião, gema e cabeça e quantificar o brilho e a área das estruturas de cabeça que expressam GFP, executar o conjunto de regras para o estágio de detecção de cabeça e gema.
Para garantir a atribuição adequada do saco vitelino e da cabeça, modifique o conjunto de regras para ajustar o limite de detecção de gema se a gema for muito grande ou muito pequena. Em seguida, execute o conjunto de regras para o estágio de detecção de estruturas de cabeça brilhante. Para garantir a atribuição adequada de áreas que expressam GFP na cabeça, modifique o conjunto de regras para ajustar o limite de detecção de estruturas de cabeça como múltiplos de intensidade servil até que a detecção de estruturas de cabeça brilhantes corresponda à observação visual.
Em seguida, execute todo o conjunto de regras manualmente em várias imagens escolhidas aleatoriamente geradas a partir de embriões tratados com veículo e imagens de controle positivo de embriões tratados com PCI. Para executar o algoritmo em todas as imagens de placa, selecione as placas a serem analisadas e escolha. Analise, navegue até o conjunto de regras otimizado e analise todos os poços.
Usando o agendador de trabalho integrado, poços vazios ou imagens ambíguas serão automaticamente excluídos da análise durante a varredura. Um mapa de manutenção em atualização contínua é mostrado. Tanto os dados quanto as imagens são acessíveis durante a execução para inspeção visual.
Os dados numéricos e as imagens processadas são salvos automaticamente. Depois que todas as imagens forem analisadas, os dados podem ser exportados para software de terceiros, como Excel, GraphPad ou prisma. Esta figura mostra imagens de varredura arquivadas de um veículo tratado e A BCI bem tratado com e sem análise CNT.
A proteína fluorescente verde aplicada ou GFP é detectada no olho, no limite do cérebro posterior médio e nos gânglios trigêmeos de embriões transgênicos. Observe que tanto a intensidade da GFP quanto os domínios de expressão são expandidos. Em embriões tratados com BCI aqui, é observado um efeito dependente da dose de BCI na expressão do gene repórter GFP em embriões transgênicos.
A concentração necessária para provocar uma resposta máxima ou EC 50 foi de aproximadamente 12 micromolares. Acabamos de mostrar como criar, coletar e organizar embriões de peixe-zebra transgênicos em placas de 96 poços. Adicionamos concentração crescente de PCI no próprio ativador da via de sinalização.
Também mostramos como automatizar a imagem de embriões transgênicos e analisamos as imagens com um algoritmo personalizado baseado na tecnologia de rede de cognição. Com essa abordagem, fomos capazes de medir quantitativamente de forma gradual os efeitos de uma pequena molécula ativadora da sinalização do fator de crescimento de fibroblastos. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de escolher cuidadosamente os embriões para minimizar a variabilidade entre os espécimes.
É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este estudo apresenta um sistema para a obtenção automatizada de imagens e análise de embriões transgênicos de peixe-zebra em placas de múltiplos poços. Demonstra a capacidade de medir efeitos dose-dependentes da molécula pequena BCI na expressão do gene reporter do Fator de Crescimento de Fibroblastos, facilitando triagens químicas de peixe-zebra de alto rendimento.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Trianagem de Alto Rendimento
Fundamentos
- Peixes-zebra são comumente usados como organismos modelo na biologia do desenvolvimento.
- Peixes-zebra transgênicos podem expressar proteínas fluorescentes, permitindo a visualização da expressão gênica.
- A triagem de alto conteúdo permite a análise de múltiplas amostras simultaneamente.
- A sinalização do Fator de Crescimento de Fibroblastos (FGF) é crucial para vários processos de desenvolvimento.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um sistema de obtenção de imagens de alto rendimento para embriões de peixe-zebra.
- Avaliar os efeitos de moléculas pequenas na sinalização do FGF.
- Automatizar a análise da expressão gênica em peixes-zebra transgênicos.
Métodos Utilizados
- Criação de peixes-zebra transgênicos e coleta de embriões.
- Incubação de embriões em placas de múltiplos poços com concentrações variadas de BCI.
- Obtenção automatizada de imagens usando um leitor de placas confocal.
- Análise de intensidades fluorescentes usando um algoritmo personalizado.
Principais Resultados
- Obtenção bem-sucedida de imagens e análise de embriões de peixe-zebra em formato de alto rendimento.
- Demonstração de efeitos dose-dependentes de BCI na sinalização do FGF.
- Análise automatizada forneceu quantificação confiável da expressão gênica.
- Estabelecimento de uma plataforma para futuras triagens químicas em peixe-zebra.
Conclusões
- O sistema desenvolvido aumenta a eficiência das triagens químicas de peixe-zebra.
- Fornece uma ferramenta valiosa para o estudo da sinalização do FGF no desenvolvimento.
- Esta metodologia pode ser aplicada a outras moléculas pequenas e vias de sinalização.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Automated imaging and analysis of zebrafish embryos enables scalable, in vivo assessment of signaling pathway modulation, supporting early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The approach provides quantitative, dose-dependent readouts that improve predictive confidence in compound effects on FGF/RAS/MAPK pathway activity. This positions the method as a translational bridge between phenotypic screening and lead identification in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modulating FGF signaling in a disease-relevant vertebrate system.
- Operational Value: Supports biological de-risking through automated quantification of GFP reporter expression in embryonic head structures.
- Predictive Value: Generates EC50 data (approximately 12 micromolar for BCI) to inform structure-activity relationships and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible fluorescent intensity readouts from 96-well plate formats compatible with high-throughput workflows.
- Scalability: Facilitates arraying of transgenic embryos at 24 hpf for compound treatment and automated imaging on confocal HCS readers.
- Algorithm Utility: The custom Cognition Network Technology algorithm detects and quantifies GFP expression in defined embryonic regions, enabling reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses zebrafish embryos at 24-48 hpf, a developmental stage with formed organs and tissue transparency, supporting in vivo-to-preclinical extrapolation.
- Mechanistic De-risking: Measures pathway-specific responses (FGF activation) to distinguish on-target from off-target compound effects.
- Biomarker Alignment: GFP reporter expression serves as a translational biomarker for FGF pathway modulation, detectable via automated image analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows, supporting hypothesis testing in target validation and enabling scalable assay development for lead identification campaigns.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and target confidence building through dose-response analysis of FGF signaling modulation.
- Screening: Delivers assay readiness via automated image acquisition and analysis, ensuring reproducibility across compound concentrations.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (GFP intensity and area) that allow comparison of compound potency and efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using vertebrate embryos with conserved signaling pathways and visible organogenesis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening multiple small molecules and signaling pathways using interchangeable transgenic reporters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation and reduces mechanistic ambiguity in early-stage screening.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through automated imaging and algorithm-based analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering quantitative, dose-dependent data on pathway activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on EC50 and maximal response metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, transgenic embryo handling, and fluorescence microscopy.
- Dependent on confocal high-content screening instrumentation (e.g., Molecular Devices ImageXpress Ultra) and image analysis software (Definiens Developer).
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging, compound preparation, and image acquisition parameters.
- Involves adaptation considerations when applying the algorithm to different transgenic reporters or embryonic structures.
- Practical limitations include embryo variability and the need for careful specimen selection to minimize noise, as noted in the protocol.
