Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

O objetivo geral deste procedimento é utilizar a eletroporação para introduzir siRNAs em células difíceis de transfectar, a fim de estudar a expressão gênica. Isso é realizado primeiramente determinando a quantidade necessária de suspensão celular utilizando o contador automático de células TC 10. Em seguida, o irna é adicionado à suspensão celular e as células são eletroporadas.

Utilizando o sistema de eletroporação MXL, as células são incubadas por 24 horas após a eletroporação. Em seguida, a IL-4 é adicionada para induzir a transcrição gênica nas células experimentais. Por fim, o RNA é extraído e a PCR em tempo real é utilizada para medir os níveis de expressão gênica.

No final, podem ser obtidos resultados que demonstram o efeito de siRNAs específicos sobre vias de expressão gênica. Olá, sou Adam McCoy, cientista sênior da divisão de expressão gênica da Bio Rad Laboratories. Hoje vamos mostrar o procedimento para introduzir RNAs em linhagens celulares de difícil transfeção por eletroporação e, em seguida, analisar os efeitos sobre a expressão gênica.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para analisar a expressão gênica de genes individuais ou estudar vias gênicas por meio da eliminação de um gene e da busca por efeitos downstream. Então, vamos começar. Trabalhando sob uma capela de cultura celular, remova as células de um frasco de cultura.

As células utilizadas neste protocolo são células em suspensão. Se você estiver usando células aderentes, será necessário tratar com tripsina antes de removê-las. Centrifugue as células para formar o pellet.

Após as células terem sido centrifugadas, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em PBS. Para determinar o número de células viáveis, retire uma alíquota da suspensão celular e adicione o corante azul de tripano na proporção de um para um para corar as células mortas. O azul de tripano é necessário para a avaliação de viabilidade celular, mas não para a contagem total de células.

Coloque apenas o líquido da mistura na abertura de uma lâmina descartável para contagem e insira-a no contador automático de células TC 10. O TC 10 primeiro fará o foco automático para garantir a contagem mais precisa e, em seguida, iniciará a contagem das células. O número de células vivas e o número total de células por mililitro na amostra são exibidos.

Selecione a imagem de visualização para exibir as células na tela de visualização. Em seguida, utilize as setas para cima ou para baixo. Aproxime ou afaste o zoom conforme necessário para calcular a quantidade de suspensão celular necessária para os experimentos; selecione a calculadora de diluição.

Digite a concentração desejada e os valores de volume final para este experimento. Serão preparadas 16 amostras no total, incluindo duplicatas para cada tratamento. Assim, será necessário um volume total de 3,6 mililitros de uma suspensão de cinco vezes 10 à sexta células por mililitro.

O contador de células informará então o volume de suspensão celular necessário com base na contagem de células viáveis e nos valores-alvo inseridos. Se o azul TRIAM foi utilizado, o contador ajustará automaticamente a diluição um para um empregada. Agora, sob uma capela, transfira o volume calculado de suspensão celular para um novo tubo.

Em seguida, centrifugue as misturas celulares para sedimentar as células enquanto elas estão sendo centrifugadas. Prepare tubos de microcentrífuga para a eletroporação adicionando SIR A a cada tubo. Para este experimento, um controle irna, dois stat seis siRNAs específicos e controles não tratados serão preparados. Após a centrifugação, remova o PBS e ressuspenda as células em 3,6 mililitros de tampão de eletroporação Gene Pulser, transferindo alíquotas de 800 microlitros para tubos contendo o IRNA apropriado e misturando suavemente.

As células estão agora prontas para eletroporação, para tratar todas as amostras simultaneamente. Usando o sistema de eletroporação MXL, transfira 150 microlitros de cada suspensão celular para os poços apropriados de uma placa de eletroporação de 96 poços. Em seguida, coloque a placa na câmara da placa do sistema de eletroporação MXL e feche a tampa.

Selecione o protocolo de eletroporação desejado e pressione o pulso para ate as células após a conclusão da eletroporação, remova a placa do instrumento e transfira as células para uma nova placa de cultura de tecidos contendo meio pré-aquecido. Em seguida, transfira 150 microlitros de células controle não tratadas para cada amostra para a nova placa. Então, coloque as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono durante a noite.

Após 24 horas, utilize IL-4 para induzir a transcrição gênica em um conjunto de células e adicione somente meio ao segundo conjunto. Uma quantidade de IL-4 é adicionada às células. Incube por mais 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, após um total de 48 horas de crescimento.

Pode haver grandes diferenças na densidade celular se o tratamento experimental afetar a divisão celular. Portanto, é recomendável usar o contador automático de células TC 10 para quantificar rapidamente as células novamente com base nas contagens. Transfira uma alíquota de cada poço para um tubo microfuga para extração de RNA e congele.

Uma segunda alíquota para western blot ou outra análise proteica. Hoje será mostrado apenas o fluxo de trabalho de RNA. Centrifugue as amostras para sedimentar as células.

Em seguida, remova e descarte o SUP natin de cada tubo. Prossiga com a extração de RNA utilizando o kit orum de RNA total. Uma vez que o RNA tenha sido extraído, prossiga imediatamente com a análise, mantendo as amostras sobre gelo.

Para verificar a qualidade e quantidade de RNA em um único passo, utilize a estação automatizada de eletroforese Experian para desnaturar as amostras a calor e o marcador de RNA Experian, e coloque-as no gelo. Adicione uma mistura preparada de gel e corante ao poço de escorva em um chip de RNA e configure o código de escorva na estação de escorva.

Coloque o chip na estação automatizada de escorva e pressione iniciar. Remova o chip da estação de escorva e carregue o chip. Vortexe o chip para misturar as amostras com o tampão de carga.

Coloque o chip na estação de eletroforese e inicie a corrida. O software Experian exibirá automaticamente os resultados na forma de um eletroferograma, uma tabela de resultados que mostra a concentração de RNA, a razão ribossomal e o número indicador de qualidade de RNA, além de um gel virtual, semelhante a um gel de RNA tradicional. Amostras de RNA total de alta qualidade geralmente apresentam um RQI entre oito e dez.

Após verificar a qualidade do RNA, prepare aqui as reações de CDNA. O mix IScript ONEstep R-T-P-C-R é usado para combinar a síntese de CDNA e a PCR em tempo real. Em uma única reação, prepare uma mistura-mestra contendo todos os componentes da reação, exceto os modelos de RNA, para cada conjunto de primers.

Em seguida, distribua a mistura nos poços de uma placa de PCR. Após diluir o RNA para uma concentração uniforme, adicione as amostras aos poços apropriados em triplicata. Selle a placa, coloque-a na máquina de PCR em tempo real e, em seguida, selecione o protocolo apropriado e inicie a corrida. Uma vez concluída a corrida, utilize os traços em tempo real para determinar os níveis de expressão.

O software calcula a expressão gênica normalizada a partir dos dados com base na expressão relativa de genes experimentais e de referência em células tratadas e controladas. Esta figura mostra uma visão geral da via de sinalização da IL-4, com a ligação da IL-4 ao seu receptor. Isso leva à dimerização e ativação da STAT6, que transloca para o núcleo e ativa a transcrição de seus genes-alvo.

Genes como CCL 17 sem indução por IL quatro, a transcrição de CCL 17 permanecerá em níveis constitutivos baixos após o silenciamento mediado por irna do gene STAT seis. O tratamento com IL quatro deve levar a um aumento pequeno ou nulo na expressão de CCL 17. A indução de CCL 17 por IL quatro foi medida em diferentes condições por PCR quantitativa em tempo real.

As amostras de PCR cultivadas sem IL-4 apresentaram um baixo nível constitutivo de expressão. Independentemente do sir, A, entregue conforme mostrado nas amostras-controle verdes e azuis, respondeu normalmente ao tratamento com IL-4, com uma indução de oito a dez vezes do CCL17. No entanto, células transfectadas com siRNAs direcionados à STAT6, mostradas em vermelho e rosa, apresentaram expressão reduzida do CCL17 em resposta à IL-4, o que apoia a ideia de que a STAT6 desempenha um papel na expressão induzida por IL-4 do CCL17.

Acabamos de mostrar como introduzir siRNAs em uma linhagem celular em suspensão de difícil transfeção e como acompanhar a expressão gênica nessas células. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as condições tão consistentes quanto possível em todas as amostras. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.