Name: Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda a quantificar focos de γH2AX em células humanas expostas à radiação ionizante usando ensaio de imunofluorescência. Este método permite avaliar danos ao DNA e reparo celular em biologia da radiação.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

O apoio do Instituto Australiano de Ciência Nuclear e Engenharia é reconhecido. TCK foi o ganhador de prêmios AINSE. Lab Medicine epigenômico é suportado pelo National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM é apoiada por Melbourne Research (University of Melbourne) e Biomedical Imaging bolsas complementares CRC. O apoio de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody e ISKA Carmichael) foi inestimável para este trabalho.

Preparação de células <ol><li> Queratinócitos humanos (FEP-1811) foram cultivadas em queratinócitos-Serum Médio gratuito (K-SFM; Invitrogen) suplementado com fator de crescimento epidérmico, o extrato de hipófise de bovinos e 20 mcg / ml de gentamicina, a 37 ° CO C e 5% 2. </li><li> A suspensão única célula foi preparado por destacando com tripsina-EDTA (0,05% v / v) </li><li> Células foram semeadas em oito bem-Lab Tek slides II MicroChamber (10.000 células / poço) e as lâminas foram incubadas por 3 dias a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> Irradiação <ol><li> As células foram irradiadas no gelo com 2 Gy usando uma fonte de 137 Cs (Gammacell irradiador 1000 Elite; Nordion International, ON, Canadá, 20,6 segundos / Gy) </li><li> Controle não irradiado e 2 Gy células irradiadas foram incubadas por 1 hora a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> Imunofluorescência <ol><li> Mídia foi derrubado fora e as células foram lavadas com 300 ul de PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +) por poço e foram rodados em um misturador orbital por 5 minutos. </li><li> O buffer foi derrubado fora e 100μl de recém-preparados 4% (v / v) paraformaldeído foi adicionado a cada poço e as lâminas foram incubadas em temperatura ambiente por 10 minutos. Todas as incubações foram realizadas em um cocho de coloração umidificado </li><li> As células foram então lavadas com PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +). Lâminas foram colocadas em um frasco Coplin e rodado em um misturador orbital por 5 minutos. Esta etapa de lavagem foi repetido mais duas vezes. </li><li> O buffer foi derrubado fora e excesso de PBS foi gentilmente apagados. </li><li> Células foram permeabilizadas com 100ml Triton X-100 (0,1% v / v) por poço e uma incubação de 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Células foram lavadas com PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +), conforme descrito nos passos 3 e 4 acima. </li><li> Ligação não específica de proteínas foi bloqueada com 100 ml de BSA (1% v / v) por poço e 20 minutos de incubação à temperatura ambiente. </li><li> BSA excesso foi derrubado fora e 100μl do ensino primário monoclonal anti-anticorpo fosfo-histona H2AX (diluído 1:500 em BSA 1%; Millipore), foi adicionado a cada poço para a incubação de uma hora à temperatura ambiente. </li><li> Células foram lavadas com PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +) conforme descrito nas etapas 3 e 4 acima e incubadas com 100μl de anticorpo secundário (Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG diluído 1:500 em BSA 1% ; Invitrogen) por poço por 45 minutos em temperatura ambiente no escuro. (Anticorpo diluído foi mantido no escuro durante todo o procedimento) </li><li> Células foram lavadas com PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +), conforme descrito nos passos 3 e 4 acima. No entanto, a exposição à luz foi minimizado usando papel alumínio. </li><li> Contracoloração nuclear foi realizado com 100 ml TOPRO3 (diluído 1:500; Invitrogen) por poço e incubação de 10 minutos em temperatura ambiente </li><li> Células foram lavadas com PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +) como descrito na etapa 10 acima. </li><li> As câmaras foram cuidadosamente removido os slides, o excesso de umidade foi apagado e as lâminas foram secas ao ar. </li><li> Uma gota de solução anti Prolongar-fade GOLD (Invitrogen) foi adicionado por poço e lâminas foram montadas (22x50 milímetros lamela) e qualquer excesso de líquido ao redor das bordas do slide foi apagado. </li><li> As lâminas foram mantidas no escuro por mais 30 minutos em temperatura ambiente antes de selar com unha polonês. </li><li> As lâminas foram armazenadas durante a noite a 4 ° C no escuro antes da análise. </li></ol> Microscopia / Análise <ol><li> Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscpe utilizados para adquirir imagens utilizando a GFP padrão (para γH2AX - Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de rato) e lasers vermelho distante (para TOPRO-3). Tipicamente, um óleo de 63 x lente objetiva de imersão é usado. Imagens são adquiridas em um padrão Z-série com um tamanho de passo de 0,5 micron. A tamanho do passo de 0,5 m foi escolhida para minimizar a perda de apresentar focos em diferentes planos no núcleo. Durante a análise, planos individuais são deconvoluídos e empilhados para produzir uma imagem máxima projetada para minimizar a sobreposição de focos (Top hat-filtro aplicado). </li><li> Metamorph (dispositivos Molecular, EUA) foi utilizado para analisar o número de focos. O programa quantitates o número de focos em cada célula após o limite tem sido aplicado para excluir fundo. As informações são registradas em uma planilha do Microsoft Excel para análise posterior. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Visualização de imunofluorescência γH2AX focos (verde) em queratinócitos humanos não tratados e em células irradiadas com 2 Gy e incubados por uma hora mais 1 a 37 ° C, 5% CO 2. O DNA foi corado com TOPRO-3 (azul). Imagens foram adquiridas utilizando um microscópio Zeiss LSM 510 Meta Confocal. Bar = 10 mM. e_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Visualização de imunofluorescência γH2AX focos (verde) em queratinócitos humanos e em células irradiadas com 2 Gy e incubados por uma hora mais 1 a 37 ° C, 5% CO 2. Imagens foram adquiridas utilizando um microscópio Zeiss LSM 510 Meta Confocal utilizando 0,5 m de corte Z-(1-9) para garantir que todos os focos foram adquiridas. As imagens foi então empilhados para quantificação usando Metamorph. O DNA foi corado com TOPRO-3 (azul). O γH2AX empilhados e imagens azuis foram empilhadas para visualização. Bar = 10 mM.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Dynamic+%5Bgamma%5D-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li>
<li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li>
<li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5D-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li>
<li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li>
<li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li>
<li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li>
<li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Após a exposição à radiação ionizante (raios-γ), forma γH2AX focos rapidamente e os números de focos atingir um máximo entre 30-60 minutos 2. Portanto, nosso ponto de uma hora o tempo pós-irradiação reflete DSB formação inicial. Temos usado a dose de radiação clinicamente relevantes de 2 Gy para nosso experimento. No entanto, o método pode ser usado para as doses de radiação até 4 Gy para a detecção da formação inicial DSB; sobreposição significativa de focos impede a quantificação exata em doses elevadas. Do...

<table><tbody><tr><td>Meio Livre de Soro para Células Epidérmicas (K-SFM)</td><td>Meio</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Meio para queratinócitos suplementado com Fator de Crescimento Epidérmico recombinante humano 1-53 (EGF 1-53) e Extrato de Hipófise Bovina (BPE).</td></tr><tr><td>Lâminas com Câmara Lab Tek II (8 poços)</td><td>Lâminas com Câmara</td><td>Nalge Nunc international</td><td>NUN154534</td><td></td></tr><tr><td>Cobrimentos (22x50 mm)</td><td>Cobrimentos</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Sérica Bovina (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA (1%) é usado para bloquear ligações não específicas de anticorpos. Os anticorpos primários e secundários são diluídos em BSA.</td></tr><tr><td>PBS (sem Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; e Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,5% x10</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Tripsina-EDTA (0,05%) utilizada para destacar as células dos frascos de cultura.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0,1%) utilizado para permeabilizar as células.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>Paraformaldeído (4%) utilizado para fixar as células.</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de camundongo anti-histona fosfo-H2AX</td><td>Anticorpo Primário</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>Diluição do anticorpo primário (1:500) em BSA 1%.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugado com anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo (H+L)</td><td>Anticorpo Secundário</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>Diluição do anticorpo secundário (1:500) em BSA 1%.</td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>Corante de DNA</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>Corante de DNA comumente usado: cloreto de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Pode ser usado apenas com microscópios que possuam laser de excitação apropriado.</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Solução antidesbotamento</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Índice de refração de 1,42 a 20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Frascos de Cultura de Tecidos, com Tampa Ventilada</td><td>Frascos de Cultura</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos (150x25 mm)</td><td>Placa de Petri</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Pote Coplin, de vidro</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Bacia de Coloração</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Irradiador Gammacell 1000 Elite</td><td>Irradiador de Raios Gama</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal Zeiss LSM 510 Meta</td><td>Microscópio Confocal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Software para Análise de Imagens</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de γh2ax focos em resposta à radiação ionizante

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA dupla fita-breaks (LAP), que são induzidos por qualquer processos metabólicos endógenos ou por fontes exógenas, são uma das lesões DNA mais críticos com relação à sobrevivência e preservação da integridade genômica. Uma resposta rápida à indução de LAP é fosforilação da variante histona H2A, H2AX, na serina-139 resíduos, na altamente conservada motivo SQEY C-terminal, formando γH2AX<sup&gt; 1</sup&gt;. Após a indução de LAP, H2AX é rapidamente fosforilada pela fosfatidil-inosito 3-quinase (Pikk) família de proteínas, ataxia telangiectasia mutantes (ATM), subunidade proteína-quinase DNA catalítico e ATM e Rad3 relacionados (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Tipicamente, apenas alguns pares-base (pb) estão implicados em uma DSB, no entanto, não há amplificação de sinal significativo, dada a importância das modificações da cromatina na sinalização de danos ao DNA e reparo. Fosforilação de H2AX mediada predominantemente por ATM espalha para áreas adjacentes da cromatina, afetando aproximadamente 0,03% do total celulares H2AX por DSB<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Isso corresponde a fosforilação de aproximadamente 2000 moléculas H2AX abrangendo ~ 2 Mbp regiões da cromatina em torno do local do DSB e resulta na formação de discretos focos γH2AX que podem ser facilmente visualizados e quantificados por microscopia de imunofluorescência<sup&gt; 2</sup&gt;. A perda de γH2AX no DSB reflete reparação, no entanto, há alguma controvérsia quanto ao que define o reparo completo da LAP, tem sido proposto que a recombinação de dois filamentos de DNA é adequada no entanto, também tem sido sugerido que restabelecimento do estado de compactação da cromatina originais é necessário<sup&gt; 08/04</sup&gt;. O desaparecimento de γH2AX envolve pelo menos em parte, pela desfosforilação fosfatases, fosfatase e fosfatase 2A 4C<sup&gt; 5,6</sup&gt;. Além disso, a remoção de γH2AX pela redistribuição envolvendo troca de histonas com H2A.Z tem sido implicado<sup&gt; 7,8</sup&gt;. Importante, a análise quantitativa de γH2AX focos levou a uma ampla gama de aplicações na pesquisa médica e nuclear. Aqui, nós demonstrar o método mais comumente usado de imunofluorescência para avaliação de danos no DNA inicial de detecção e quantificação de γH2AX focos em γ-irradiados aderente queratinócitos humanos<sup&gt; 9</sup&gt;.

Quantificação de DNA dupla fita-estrias usando formação γH2AX como um marcador molecular tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para a quantificação dos focos γH2AX após a exposição das células à radiação.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

As quebras de fita dupla (DSBs) do DNA, que são induzidas por processos metabólicos endógenos ou por fontes exógenas, representam um dos danos mais críticos ao DNA...

Olá, sou Ian Ma do Laboratório de Medicina Epigenômica chefiado pelo Dr. Tom Caris no Baker Eye, DI Heart and Diabetes Institute. Atualmente estou realizando meu doutorado, que tem forte foco nos efeitos da radiação sobre a Gamma H two A X, que é o marcador molecular de quebras de dupla fita. Hoje demonstrarei um experimento sobre a quantificação da Gamma H two A X em resposta à radiação gama em células-tronco humanas.Este protocolo de imunomarcação pode ser usado para monitorar tanto os danos iniciais no DNA quanto o reparo do DNA. Este método também é útil para avaliar a eficácia de compostos modificadores da radiação potenciais. Por exemplo, radio-sensibilizadores, que se espera aumentarem os danos ao DNA, resultarão em números mais elevados de gama H dois A X quatro lado, enquanto radio-protetores teriam o efeito oposto, com menores números de ForSight detectados devido à redução nas quebras de dupla fita do DNA.Agora vamos iniciar o experimento. As células utilizadas neste experimento são citos humanos, que são preparadas em lâminas com câmara contendo 10.000 células acomodadas em cada poço. As lâminas são incubadas a 37 graus em 5% de dióxido de carbono durante três dias ante

quantification-of-h2ax-foci-in-response-to-ionising-radiation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Quantificação de DNA dupla fita-breaks, com base em γH2AX focos tem se tornado uma ferramenta valiosa, especialmente na biologia da radiação, para a avaliação da radiossensibilidade de tecidos e os efeitos de compostos de radiação modificando. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para quantificação de γH2AX focos em amostras de tecido.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

Análise microscópica de γH2AX focos, que formam após a fosforilação de H2AX em Ser-139 em resposta ao DNA dupla fita-breaks, tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui usamos um anticorpo mono-metilado histona H3 em lisina 4 como um marcador epigenético ativamente de eucromatina transcrever, para avaliar a distribuição espacial da radiação induzida por formação γH2AX dentro do núcleo.

Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

Um protocolo para avaliar alterações nos níveis de dano ao DNA e na capacidade de reparo do DNA que podem ser induzidas por irradiação crônica in vivo de baixa dose em linfócitos do baço de camundongo, medindo a histona fosforilada H2AX, um marcador de quebras de fita dupla de DNA, usando citometria de fluxo é apresentado.

Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica<em&gt; In Vivo</em&gt; A exposição a doses muito baixas de beta e gama-radiação

Este manuscrito fornece um protocolo de análise de quebras de DNA dobro-costa pela microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

O método apresentado combina a análise quantitativa das rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs), a distribuição do ciclo de pilha e o apoptose para permitir a avaliação ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB assim como as conseqüências da falha do reparo.

Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo

A resposta de dano de DNA induzida por radiação ativada pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT) não foi totalmente estabelecida. Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para detectar focos induzidos por radiação (RIF) de proteínas de reparação por manchas de imunofluorescência em linhas de células cancerígenas de cólon humano após a irradiação com o feixe misturado de nêutrons.

Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Este protocolo apresenta a preparação do slide e a pontuação automatizada do ensaio de focos γ-H2AX em linfócitos sanguíneos periféricos. Para ilustrar o método e a sensibilidade do ensaio, linfócitos isolados foram irradiados in vitro. Este método automatizado de detecção de DSB de DNA é útil para aplicações de dosimetria biológica rápida e de alto rendimento.

Um método automatizado de pontuação microscópica para o ensaio de γ-H2AX Foci em Linfócitos de Sangue Periféricos Humanos

Este protocolo apresenta um método para avaliar a formação e o reparo de quebras de dupla fita de DNA através da detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 em núcleos interfásicos de linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina.

Imunofluorescência Dupla de γH2AX e 53BP1 em Linfócitos Periféricos Humanos

Aqui, apresentamos um protocolo simples e rápido para a detecção de interação proteica em locais de dano ao DNA.

Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA

Aprenda a quantificar focos de γH2AX em células humanas expostas à radiação ionizante usando ensaio de imunofluorescência. Este método permite avaliar danos ao DNA e reparo celular em biologia da radiação.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

Explorar mais vídeos