In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

É particularmente importante desvendar a rede de interações de moléculas em células vivas para compreender os mecanismos que regulam o metabolismo e a função celular. Um número crescente de metodologias que fornecem informações qualitativas e quantitativas constitui a força motriz em nosso caminho para obter imagens abrangentes da função celular. Ensaios de co-imunoprecipitação, marcação TAP ou reticulação fotoquímica permitem a purificação de pré-moléculas in vitro.

Além disso, diversas abordagens foram desenvolvidas para a análise de interações proteicas em células vivas. Essas incluem ensaios de duplo híbrido ou complementação de proteínas fluorescentes. Além disso, algumas abordagens espectroscópicas, como FRET ou FCS, e também métodos não espectroscópicos foram estabelecidos para abordar essa questão.

As técnicas supracitadas foram desenvolvidas para registrar grandes populações de células, mas sofrem por serem bastante indiretas e, portanto, pouco quantitativas. Em contraste, algumas abordagens quantitativas de alto desempenho foram introduzidas. No entanto, estender o alto rendimento é difícil de combinar com a possibilidade de extrair informações quantitativas.

Desenvolvemos recentemente um novo conceito para identificar interações entre proteínas. A técnica de microrevestimento aqui apresentada é uma ilustração esquemática das grades de SA microrevestidas de BSA Sci cinco impressas em lamínulas de vidro funcionalizadas, cujos espaços intersticiais são preenchidos com estreptavidina, seguidos por ligantes biotinilados. Na maioria dos casos, anticorpos contra a membrana.

Isca proteica em células cultivadas em chips de microbioma como estes. A isca será organizada na membrana plasmática de acordo com o micro padrão de anticorpo. Interações com uma segunda proteína presa marcada fluorescentemente são investigadas mediante a medição do grau de co-padrão usando um carimbo de PDMS com matriz de quadrados em um molde de silício, com tamanho e profundidade definidos.

Os três micrômetros são produzidos a partir de um gel e recortados. Os carimbos são lavados com etanol a 100% e água bidestilada e secos com nitrogênio previamente. Eles são incubados com 0,67 miligramas por mililitro de sci-fi.

Solução de BSA marcada durante 30 minutos em temperatura ambiente durante a incubação; ao mesmo tempo, lamínulas de vidro modificadas com epóxi são limpas da mesma maneira. Da mesma forma, após a tintagem, os carimbos são lavados com PBS e água. Para a transferência de BSA sci cinco.

Um carimbo é seco com nitrogênio e, imediatamente após, colocado sob seu próprio peso sob uma lamínula de vidro por 30 minutos. A localização do campo de microdesenho é marcada no verso da lamínula. Após a remoção dos carimbos, as lamínulas são seladas com máscaras de silicone adesivo.

As câmaras são carregadas com uma solução de estreptavidina a 50 microgramas por mililitro, incubada por uma hora e lavada com um mililitro de PBS em seguida. Posteriormente, os padrões de estreptavidina são incubados com anticorpo biotinilado a 10 microgramas por mililitro por uma hora e, após a lavagem com PBS, as células são carregadas na câmara. Quando as células se aderirem à superfície, a amostra estará pronta para as medições.

O único requisito para a leitura é um microscópio de fluorescência capaz de iluminar a amostra em configuração de reflexão interna total. Tais sistemas estão comercialmente disponíveis de diferentes fornecedores e tornaram-se fáceis de operar para o usuário nos últimos anos. Nosso sistema de detecção está montado em um microscópio de fluorescência em epifluorescência.

Os lasers de íons de argônio e criptônio são utilizados para excitação seletiva de fluorescência das amostras marcadas com fluoróforos. As quatro amostras são iluminadas em uma configuração de reflexão interna total baseada em objetiva, utilizando uma objetiva de imersão a óleo com alta abertura numérica e ampliação de 100 vezes. Após filtragem apropriada com conjuntos de filtros padrão, a fluorescência é projetada em uma câmera CCD com iluminação traseira. A leitura é realizada em modo de integração com atraso temporal, o que permite a varredura de grandes áreas da amostra. Para isso, as amostras são deslocadas utilizando uma platina motorizada XY sincronizada com o deslocamento da linha da câmera.

O feixe a laser refletido é projetado em um fotodiodo de dois segmentos e o sinal diferencial é usado para controlar um piezo em Z para refocagem rápida. O leitor é equipado com um sistema automatizado de manutenção de foco que opera durante o processo de varredura, com uma varredura em 488 nanômetros para excitação seletiva de GFP e uma segunda varredura em 647 nanômetros para excitação seletiva de PS Five. Para análise de dados, utilizamos um programa de cálculo de contraste escrito em MATLAB com base na intensidade de fluorescência dentro e fora da região capturada pelo anticorpo.

O nível de contraste e, consequentemente, o grau de interação proteica são analisados para análise rápida de um grande número de células. Também pode ser utilizado software automatizado comercialmente disponível. Por exemplo, o software de imagem scan R oferecido pela Olympus foi testado com sucesso para a avaliação de contraste em experimentos de micropadrinagem.

Analisamos a interação bem conhecida entre CD4 e a proteína LCK em vias de sinalização precoce em linfócitos T, conforme mostrado aqui. A LCK fluorescente redistribui-se claramente nas regiões revestidas com anticorpos anti-CD4. A interrupção da estrutura do grampo de zinco, que é o principal sítio de interação entre essas duas proteínas, mediante a adição de um quelante de zinco, reduz o contraste dos micros padrões de LCK.

Em resumo, as principais vantagens da técnica de micro-padrinagem são as seguintes: quantificação de interações proteicas locais com resolução espacial. Além disso, a detecção de interações fracas também na membrana plasmática de células vivas, a detecção de interações entre isca e presa moduladas, análise do estado de repouso e a aplicabilidade da abordagem para alto rendimento.