Name: In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a técnica de micropadrão para quantificar interações proteína-proteína em células vivas. Este método de alta vazia permite detectar interações fracas e analisar processos celulares dinâmicos.

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Gostaríamos de agradecer Quentina Beatty, da Universidade de Linz, na Áustria, por sua ajuda tipo, Katharina Strub, Universidade de Genebra, na Suíça, para a construção hCD71-GFP, e Legler Daniel, Universidade de Konstanz, na Suíça, para o GPI-GFP DAF-construir. Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Ciência Austríaco (FWF; projeto Y250-B03) eo projeto GEN-AU do Ministério Federal Austríaco da Ciência e Investigação.

Impressão microcontact: <ol><li> Cortar campo de micropattern do selo PDMS utilizando um bisturi </li><li> Lave o campo que contém o micropattern através de lavagem com etanol (100%) e água destilada. </li><li> Seque o selo PDMS com nitrogênio ou gás argônio. </li><li> Pipetar 50 ul BSA-Cy5 solução de trabalho (0,67 mg / ml) para o selo de PDMS para que o campo micropattern inteiro é coberto com a solução. Incubar por 30 min em temperatura ambiente. </li><li> Lavar o campo micropattern através de lavagem com Tampão fosfato salino (PBS) e água destilada. </li><li> Seque o PDMS com nitrogênio ou gás argônio. </li><li> Coloque o selo PDMS sob seu próprio peso sobre o centro de uma lamela epoxy revestido e incubar por 30 min à temperatura ambiente numa placa de Petri. </li><li> Rotular a posição do carimbo PDMS na parte traseira da lamela e tira o selo do slide com uma pinça. </li><li> Vara uma câmara de hibridação Seguro Selo sobre o campo microcontact-impresso na lamela. O rótulo de ajuda para localizar o centro do campo. </li><li> Pipetar 60 mL de solução de trabalho estreptavidina (50 mcg / ml) para a câmara de reação e incubar a amostra por 60 min em temperatura ambiente. </li><li> Lavar a amostra com 1 ml de PBS, adicionando o buffer em uma porta da câmara e removê-lo simultaneamente a segunda porta com uma bomba. </li><li> Pipetar 60 mL de solução de trabalho biotinilado anticorpo (10 mg / ml em PBS suplementado com 0,1% Tween 20; "PBST") para a câmara de reação e incubar por 60 min em temperatura ambiente. </li><li> Lavar a amostra com 1 ml PBST e, posteriormente, 1 ml de PBS, adicionando o buffer em uma porta da câmara e removê-lo novamente na segunda porta com uma bomba. </li><li> Armazenar as superfícies micropatterned em PBS no escuro à temperatura ambiente até que as células estão prontos para a semeadura. </li></ol> Incubação de células na superfície micropatterned: <ol><li> Cultivar células aderentes à confluência de 50% em um 3 centímetros placa de cultura de tecidos. </li><li> Separar células que expressam a isca presa e proteínas de interesse, com solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e centrifugar 5 min a 1.000 rpm. </li><li> Desprezar o sobrenadante e dissolver o celular em meio de crescimento de acordo. </li><li> Centrifugar 5 min a 1.000 rpm. </li><li> Desprezar o sobrenadante e dissolver o pellet celular em meio de crescimento adequado. </li><li> Trocar o PBS da câmara de reação na lamela micropatterned em 60 mL da suspensão de células. </li><li> Criar uma câmara úmida por imersão uma almofada em água destilada estéril e colocá-lo na placa de Petri para evitar que a amostra de funcionamento a seco. </li><li> Incubar as células ao longo da noite a 37 ° C em uma atmosfera de 5% CO 2 na superfície micropatterned. </li><li> Antes de analisar as células no microscópio, a troca do meio de solução de Hank s sal tamponado incluindo Ca 2 + e Mg 2 +. </li></ol> Microscopia: <ol><li> A lamínula é colocada sobre um suporte adequado ea morfologia das células é verificada em branco-luz. </li><li> A qualidade da BSA-Cy5 é marcada por padrões de excitação em 647 nm. </li><li> Micropadrões de proteína presa fluorescente (GFP ou YFP) são registrados a 488 ou 514 nm sob Total Internal Reflection excitação (TIR). </li></ol> Resultados representativos: Se não houver interação entre as proteínas-alvo em células cultivadas em uma superfície micropatterned, a presa vai seguir a redistribuição isca. O micropattern resultante pode ser visualizado pelo rótulo de fluorescência da proteína presa. Importante é que o contraste obtido fornece uma medida direta da força de interação (ver Figura 1). Portanto, uma simples avaliação da interação de duas proteínas torna-se possível - sem a necessidade de continuar a processar os dados medidos primária. <img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rearranjo da isca na membrana plasmática de células vivas em dosagens diferentes de interação. Imagens TIR de células transfectadas com T24 (a) CD71-GFP em anticorpos CD71, (b) CD4 e YFP citosólica em CD4-anticorpo e (c) GPI-GFP-DAF em anticorpos CD59 microbiochips são mostrados. Os dados são característicos para a forte (a), não (b) ou interação fraca (c). (A) é reproduzida a partir de (Weghuber et al., No prelo), (b) a partir de (Schwarzenbacher et al., 2008).

<ol><li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+%22Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li>
<li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li>
<li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+screening%3A+a+technology+in+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li>
<li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li>
<li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

O vídeo contém imagens que foram fornecidos pela Olympus, a partir da homepage do Laboratório de Pesquisa Visualization, da Universidade Brown ou reproduzidas a partir de (Kim et al., 2003).

O vídeo que acompanha demonstra um método para a detecção de interações proteína-proteína na membrana plasmática de células vivas (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). Em princípio, qualquer plataforma de microscopia TIRF baseada pode ser usado como sistema de leitura. Somente quando de alta sensibilidade é desejada (por exemplo, para a detecção de moléculas simples), microscópios avançados serão necessários. Para alcançar melhores resultados os seguintes pontos críticos durante o processo de preparação requerem uma atenção especial: <ol class="lroman"><li> Solução de loja Cy5 estoque em condições escuras, para evitar o branqueamento do fluoróforo e preparar o BSA-Cy5 solução de trabalho imediatamente antes da impressão microcontact. </li><li> Tenha cuidado para não arranhar a micropattern no PDMS com a ponta da pipeta e incube a amostra em condições escuras, para evitar o branqueamento do fluoróforo. </li><li> Coloque a lamínula sobre uma almofada esterilizada para evitar que grudem da lâmina de vidro para a placa de Petri. Uma vez que o carimbo de PDMS se adere à lâmina de vidro, não movê-lo. </li><li> Evite bolhas de ar na câmara de reação e incubar a amostra em condições escuras, para evitar o branqueamento do fluoróforo. </li><li> Não deixe que a amostra seca por mais de 2 minutos para evitar a formação de cristais de sal. </li><li> Para o desprendimento das células não utilizar de tripsina, uma vez que irá unir o domínio extracelular de proteínas da membrana, até agora manifestado. Evitando tripsina será útil para proteínas com baixo índice de rotatividade para formar micropadrões imediatamente após fixação das células na superfície. </li><li> Controlar o número de células incubadas em um microscópio e certifique-se que as células não alcançam mais do que 30-50% confluência. Certifique-se que as células excessivo são removidos imediatamente, devido à fixação rápida de células na superfície revestidos com anticorpo. </li><li> Slides apenas com alta qualidade BSA-Cy5 padrões podem ser usados ​​para análise posterior. </li><li> Expressão estável da proteína fluorescente presa é preferível devido à maior número de células que podem ser analisados ​​por varredura. </li><li> Ajuste TIRF adequada é indispensável para visualizar padrões devido ao fundo citosólica. </li></ol> A técnica de micro-padronização oferece diversas possibilidades para a análise das interações proteína-proteína. Em primeiro lugar, juntamente com a quantificação do local, espacialmente resolvidos interações proteína-proteína também a detecção de interações fracas ou indirecta é possível sem a desvantagem de dar um elevado número de falsos positivos ou negativos. Em segundo lugar, permite ao pesquisador analisar interações proteína-proteína na membrana plasmática de células vivas, que é difícil de conseguir por abordagens bioquímicas como a tela de 2 híbridos. Em terceiro lugar a abordagem permite a detecção de isca presa interações que são modulados por mudanças ambientais, como a temperatura, a presença de diferentes proteínas ou outras moléculas ou modificações pós-translacionais. Assim, o ensaio permite a moduladores de triagem de um par de interação dada no contexto de células vivas. Além disso, ao reduzir a densidade de superfície do ligante captura ou o uso de ligantes monovalentes, a análise do estado de repouso se torna possível. Finalmente, se adequado plataformas de digitalização são utilizados, o número de células analisadas é alta o suficiente para atender as demandas de alto rendimento das empresas farmacêuticas para a triagem de drogas (Ramm, 2005).

in vivo detecção de interações proteína-proteína em micro-padrão superfícies

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Desvendar a rede de interação de moléculas<em&gt; In-vivo</em&gt; É a chave para a compreensão dos mecanismos que regulam a função celular e metabolismo. Uma multidão de opções metodológicas para tratar as interações moleculares nas células têm sido desenvolvidas, mas a maioria destes métodos sofrem de ser bastante indireta e, portanto, dificilmente quantitativa. Pelo contrário, alguns high-end abordagens quantitativas foram introduzidas, que no entanto são difíceis de estender a alta taxa de transferência. Para combinar as capacidades de alto rendimento com a possibilidade de extrair informações quantitativas, que recentemente desenvolveu um novo conceito para a identificação de interações proteína-proteína (Schwarzenbacher<em&gt; Et al</em&gt;., 2008). Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a concepção e construção deste sistema que permite analisar as interações entre um fluoróforo marcado com proteína (&quot;presa&quot;) e uma proteína de membrana (&quot;isca&quot;)<em&gt; In-vivo</em&gt;. Células são semeadas em superfícies micropatterned funcionalizados com anticorpos contra o domínio isca exoplasmic. Isca presa interações são analisadas através da redistribuição da presa fluorescente. O método é caracterizado pela alta sensibilidade para o nível de moléculas individuais, a capacidade de detectar interações fracas, e capacidade de produção elevada, tornando-o aplicável como ferramenta de triagem.

Este vídeo mostra experimentos com posterior análise de interações proteína-proteína através da utilização de micro-padrão superfícies. A abordagem oferece a possibilidade de detectar as interações de proteínas em células vivas e combina alta capacidade de processamento com a possibilidade de extrair informações quantitativas.

In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

Desvendar a rede de interação de moléculas in-vivo é fundamental para compreender os mecanismos que regulam a função e o metabolismo celular. Uma multitude de...

É particularmente importante desvendar a rede de interações de moléculas em células vivas para compreender os mecanismos que regulam o metabolismo e a função celular. Um número crescente de metodologias que fornecem informações qualitativas e quantitativas constitui a força motriz em nosso caminho para obter imagens abrangentes da função celular. Ensaios de co-imunoprecipitação, marcação TAP ou reticulação fotoquímica permitem a purificação de pré-moléculas in vitro.Além disso, diversas abordagens foram desenvolvidas para a análise de interações proteicas em células vivas. Essas incluem ensaios de duplo híbrido ou complementação de proteínas fluorescentes. Além disso, algumas abordagens espectroscópicas, como FRET ou FCS, e também métodos não espectroscópicos foram estabelecidos para abordar essa questão.As técnicas supracitadas foram desenvolvidas para registrar grandes populações de células, mas sofrem por serem bastante indiretas e, portanto, pouco quantitativas. Em contraste, algumas abordagens quantitativas de alto desempenho foram introduzidas. No entanto, estender o alto rendimento é difícil de combinar com a possibilidade de extrair informações quantitativas.Desenvolvemos recentemente um novo conceito para identificar interações entre proteínas. A técnica de microrevestimento aqui apresentada é uma ilustração esquemática das grades de SA microrevestidas de BSA Sci cinco impressas em lamínulas de vidro funcionalizadas, cujos espaços intersticiais são preenchidos com estreptavidina, seguidos por ligantes biotinilados. Na maioria dos casos, anticorpos contra a membrana.Isca proteica em células cultivadas em chips de microbioma como estes. A isca será organizada na membrana plasmática de acordo com o micro padrão de anticorpo. Interações com uma segunda proteína presa marcada fluorescentemente são investigadas mediante a medição do grau de co-padrão usando um carimbo de PDMS com matriz de quadrados em um molde de silício, com tamanho e profundidade definidos.Os três micrômetros são produzidos a partir de um gel e recortados. Os carimbos são lavados com etanol a 100% e água bidestilada e secos com nitrogênio previamente. Eles são incubados com 0,67 miligramas por mililitro de sci-fi.Solução de BSA marcada durante 30 minutos em temperatura ambiente durante a incubação; ao mesmo tempo, lamínulas de vidro modificadas com epóxi são limpas da mesma maneira. Da mesma forma, após a tintagem, os carimbos são lavados com PBS e água. Para a transferência de BSA sci cinco.Um carimbo é seco com nitrogênio e, imediatamente após, colocado sob seu próprio peso sob uma lamínula de vidro por 30 minutos. A localização do campo de microdesenho é marcada no verso da lamínula. Após a remoção dos carimbos, as lamínulas são seladas com máscaras de silicone adesivo.As câmaras são carregadas com uma solução de estreptavidina a 50 microgramas por mililitro, incubada por uma hora e lavada com um mililitro de PBS em seguida. Posteriormente, os padrões de estreptavidina são incubados com anticorpo biotinilado a 10 microgramas por mililitro por uma hora e, após a lavagem com PBS, as células são carregadas na câmara. Quando as células se aderirem à superfície, a amostra estará pronta para as medições.O único requisito para a leitura é um microscópio de fluorescência capaz de iluminar a amostra em configuração de reflexão interna total. Tais sistemas estão comercialmente disponíveis de diferentes fornecedores e tornaram-se fáceis de operar para o usuário nos últimos anos. Nosso sistema de detecção está montado em um microscópio de fluorescência em epifluorescência.Os lasers de íons de argônio e criptônio são utilizados para excitação seletiva de fluorescência das amostras marcadas com fluoróforos. As quatro amostras são iluminadas em uma configuração de reflexão interna total baseada em objetiva, utilizando uma objetiva de imersão a óleo com alta abertura numérica e ampliação de 100 vezes. Após filtragem apropriada com conjuntos de filtros padrão, a fluorescência é projetada em uma câmera CCD com iluminação traseira. A leitura é realizada em modo de integração com atraso temporal, o que permite a varredura de grandes áreas da amostra. Para isso, as amostras são deslocadas utilizando uma platina motorizada XY sincronizada com o deslocamento da linha da câmera.O feixe a laser refletido é projetado em um fotodiodo de dois segmentos e o sinal diferencial é usado para controlar um piezo em Z para refocagem rápida. O leitor é equipado com um sistema automatizado de manutenção de foco que opera durante o processo de varredura, com uma varredura em 488 nanômetros para excitação seletiva de GFP e uma segunda varredura em 647 nanômetros para excitação seletiva de PS Five. Para análise de dados, utilizamos um programa de cálculo de contraste escrito em MATLAB com base na intensidade de fluorescência dentro e fora da região capturada pelo anticorpo.O nível de contraste e, consequentemente, o grau de interação proteica são analisados para análise rápida de um grande número de células. Também pode ser utilizado software automatizado comercialmente disponível. Por exemplo, o software de imagem scan R oferecido pela Olympus foi testado com sucesso para a avaliação de contraste em experimentos de micropadrinagem.Analisamos a interação bem conhecida entre CD4 e a proteína LCK em vias de sinalização precoce em linfócitos T, conforme mostrado aqui. A LCK fluorescente redistribui-se claramente nas regiões revestidas com anticorpos anti-CD4. A interrupção da estrutura do grampo de zinco, que é o principal sítio de interação entre essas duas proteínas, mediante a adição de um quelante de zinco, reduz o contraste dos micros padrões de LCK.Em resumo, as principais vantagens da técnica de micro-padrinagem são as seguintes: quantificação de interações proteicas locais com resolução espacial. Além disso, a detecção de interações fracas também na membrana plasmática de células vivas, a detecção de interações entre isca e presa moduladas, análise do estado de repouso e a aplicabilidade da abordagem para alto rendimento.

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Biology

Biologia

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