Name: Modelo de tumor hepático murino Bioluminescent (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Aprenda a induzir tumores hepáticos bioluminescentes ortotópicos em camundongos usando técnica cirúrgica. Este modelo permite monitorar o crescimento tumoral por imagem luminescente em tempo real para pesquisa oncológica.

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Este trabalho foi financiado através da Enfermaria Cork South Victoria University Hospital fundo do peito, a Sociedade do Câncer irlandês (CRI07TAN) e do Centro de Cork Cancer Research. Lewis linha de pulmão de células expressando estavelmente luciferase foi um presente amável do Dr. Karin Jooss, Cell Genesys, Inc., San Francisco, EUA.

Introdução O fígado é geralmente o primeiro local de doença metastática e pode ser o único local de disseminação em até 30 40% dos pacientes com doença avançada. No entanto opções para o tratamento de tumores hepáticos metastáticos são poucos com uma minoria de pacientes adequados para a ressecção e apenas 23% responderam importante para quimioterápicos. Pesquisa pré-clínica neste campo tem sido limitada pela ausência de um modelo de camundongo adequado para estudar a doença de fígado isolado. Descrevemos uma abordagem baseada em baço, que pode ser usado para definir com fiabilidade uniforme, metástases hepáticas difusas. Ressecção da metade do baço evita as conseqüências do crescimento do tumor esplênico ea outra metade do baço é devolvido com uma circulação portal para manter intacta esplênica imune propriedades protetoras. O modelo que descreve é ​​bastante simples de executar e pode ser feito rapidamente através de uma incisão única. As propriedades bioluminescente da linha celular do tumor permite a quantificação precisa da resposta ao tratamento, sem sacrifício de animais. Protocolo I. Preparação celular <ol><li> Células de carcinoma de pulmão Lewis são cultivadas Médio Modified Dulbecco Essential suplementado com soro bovino fetal 10% a 37 ° C, 5% CO 2 e colhido por trypsinisation quando sub-confluentes. </li><li> As células foram contadas utilizando um Nucleocounter (Quimio-Metec, Dinamarca) e uma suspensão única célula de 1 X 10 6 células em 200 mL foi preparada em soro de mídia livre. </li></ol> II. Preparação do mouse Nota: Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade College Cork. Em nosso laboratório usamos anestésicos injetáveis ​​para anestesiar o rato, alternativamente, pode-se usar anestésicos inalatórios para conseguir o mesmo efeito. A tensão do rato que usamos é o hairless MF1 tensão nu / nu obtido a partir de Harlan Laboratories (Oxfordshire, Inglaterra). MF1 feminino nu / nu camundongos pesando 16-22 g e de 6-8 semanas de idade foram incluídos neste experimento. Outras cepas, como o C57 e Balb / c também pode ser usado com linhagens de células tumorais apropriado. <ol><li> A anestesia foi entregue por injeção intraperitoneal de ketamina 100ul de 1,5 mg e 300 ug xilazina. </li><li> A profundidade da anestesia é avaliada através de pinch dedo do pé. Não deve haver reflexo de retirada com pinça dedo do pé. </li><li> O rato anestesiado está corretamente posicionada e fixada sobre uma almofada de aquecimento. </li><li> O abdômen é preparado com uma solução de betadine 10%. </li><li> Do abdômen e do sítio cirúrgico é coberto de forma estéril. </li></ol> III. Incisão abdominal <ol><li> Uma pequena incisão subcostal é feita na pele. </li><li> A incisão é estendida a 2-3 cm. </li><li> A musculatura da parede abdominal foram divididos e cavidade peritoneal entrou. </li></ol> IV. Exposição e Divisão de Spleen <ol><li> O baço é mobilizado e gentilmente exteriorizado em uma gaze estéril pré-cortados. </li><li> Duas ligaduras vicryl 4-0 são amarrados em torno do corpo meados do baço. </li><li> Baço é dividido entre as duas ligaduras a criação de dois hemi-baço. </li></ol> V. A injeção de células para o baço Hemi- <ol><li> A G 27 é usada para injetar um volume de 100 L de células em um hemi-baço. </li><li> As células tumorais são permitidos para drenar para o fígado para 10 minutos dando tempo suficiente para a maioria das células injetadas para chegar ao fígado. </li></ol> VI. Excisão do baço Hemi-fechamento, Abdominal e Recuperação <ol><li> A injeção hemi-baço é extirpado. </li><li> A outra hemi-baço é retornado para a cavidade abdominal. </li><li> A camada muscular é fechada com sutura PDS 4-0 com um ponto simples execução. </li><li> A pele abdominal é fechada com Prolene 4-0 com pontos interrompidos. </li><li> Bolus de fluido é administrado e analgesia pós-operatória, Carpofen (5 mg / kg) é administrado por injecção IP por 24 h após a cirurgia. </li><li> O mouse é permitido recuperar da anestesia </li></ol> VII. IVIS Corpo Inteiro Bioluminescent Imagem <ol><li> Mouse é anestesiados com anestésico injetável. </li><li> Substrato luciferina é dada por injeção intra-peritoneal de dez minutos antes de imagem </li><li> Os ratos são colocados no palco e fotografada por 3 min usando IVIS sistema de imagem de corpo inteiro </li><li> Luminescência do fígado pode ser medida usando uma região de interesse ferramenta </li></ol> VIII. Exposição de fígado de rato <ol><li> Mouse é anestesiados com anestésico injetável. </li><li> A incisão abdominal telhado permite a visualização de metástase hepática difusa in vivo. </li><li> O rato é sacrificados por deslocamento cervical e no fígado pode ser retirado para análise posterior. </li></ol>_upload/1977/1977fig1.jpg "alt =" Figura 1 "/&gt; Figura 1. Freshly excisadas não tratada murino e tumor infiltrou-fígados. <img src="/files/ftp_upload/1977/1977fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cinética de crescimento do tumor hepático como evidenciado por IVIS imagens de corpo inteiro.

<ol><li>Kasuya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+subcutaneous+spleen+reservoir+for+multiple+portal+venous+injections+to+treat+liver+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse models of subcutaneous spleen reservoir for multiple portal venous injections to treat liver malignancies.</a> Cancer Res. 65, 3823-3827 (2005).</li>
<li>Liu, Q. Z., Tuo, C. W., Wang, B., Wu, B. Q., Zhang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+metastasis+models+of+human+colorectal+carcinoma+established+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+and+their+biologic+characteristic%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Liver metastasis models of human colorectal carcinoma established in nude mice by orthotopic transplantation and their biologic characteristic.</a> World J Gastroenterol. 4, 409-411 (1998).</li>
<li>Li, Z. Y., Ni, S., Yang, X., Kiviat, N., Lieber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenograft+models+for+liver+metastasis%3A+Relationship+between+tumor+morphology+and+adenovirus+vector+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Xenograft models for liver metastasis: Relationship between tumor morphology and adenovirus vector transduction.</a> Mol Ther. 9, 650-657 (2004).</li>
<li>Cashman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+gene+therapy+as+a+neoadjuvant+to+surgical+excision+to+control+metastatic+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Immune gene therapy as a neoadjuvant to surgical excision to control metastatic cancers.</a> Cancer Lett. , (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O desenvolvimento da confiança em modelos in vivo para o estudo da metástase hepática está se tornando cada vez mais importante com o advento de novas estratégias terapêuticas. Para o estudo precisa de novas estratégias, modelos animais deveria ser relativamente fácil de executar, formam um número significativo de metástase, envolvem todas as etapas da cascata metastática e têm um sistema repórter que permite a detecção e contagem de um número limitado de células metastáticas. A abordagem baseada em ba...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videne</td><td>Ecolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura Vicryl 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura PDS 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura Prolene 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferina de vagalume</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelo de tumor hepático murino bioluminescent

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

Este vídeo descreve o estabelecimento de metástases hepáticas em um modelo de mouse que pode ser posteriormente analisados ​​por imagens bioluminescente. As células tumorais são administrados especificamente para o fígado para induzir um tumor do fígado localizada, por meio da mobilização do baço e dividir em duas, deixando intacto o pedículo vascular para cada metade do baço. Lewis células de carcinoma de pulmão que constitutivamente expressam o gene luciferase do firefly (luc1) são inoculados em um hemi-baço, que é então ressecado 10 minutos depois. A outra hemi-baço é deixada intacta e voltou para o abdômen. O crescimento do tumor do fígado pode ser monitorado por imagem de bioluminescência usando o IVIS sistema de imagem de corpo inteiro. Imagens quantitativas do crescimento tumoral utilizando IVIS fornece a quantificação precisa das células tumorais viáveis. Morte celular e necrose do tumor devido ao tratamento medicamentoso é indicado no início por uma redução no sinal bioluminescente. Este modelo do rato permite investigar os mecanismos subjacentes a sobrevivência das células tumorais metastáticos e crescimento e pode ser usado para a avaliação da terapêutica das metástases hepáticas.

Este artigo descreve um procedimento para a indução de tumores de fígado ortotópico bioluminescentes em camundongos, e posterior análise do crescimento do tumor confinado ao fígado usando imagens de luminescência ao vivo de todo o corpo.

Modelo de tumor hepático murino Bioluminescent

Este vídeo descreve o estabelecimento de metástases hepáticas em um modelo murino que pode ser subsequentemente analisado por imagem bioluminescente. As células tumorais são ...

Olá a todos. Meu nome é Simon Regenron. Sou um dos médicos residentes em cirurgia no centro de pesquisa sobre câncer de cabeça e pescoço aqui na Irlanda.Hoje vou mostrar a vocês uma técnica cirúrgica para induzir metástases hepáticas. Em um modelo de câncer, o fígado é um local comum de disseminação metastática e uma causa importante de mortalidade relacionada ao câncer. Apenas um pequeno percentual de pacientes é elegível para ressecção cirúrgica em casos de doença hepática avançada.Portanto, são necessários terapêuticos inovadores para o tratamento dessa condição. Muitos modelos animais de metástases hepáticas não resultam em doenças semelhantes ao quadro clínico. O modelo que estou mostrando a vocês hoje é um modelo clinicamente relevante e é relativamente fácil de aprender, com taxas de sucesso muito boas.Este modelo envolve dividir o baço em dois hemibaços. Um hemibaço é utilizado para a inoculação de células tumorais. Essas células tumorais viajam pela circulação porta até o fígado.O outro baço hemi é deixado intacto, mantendo suas propriedades imunológicas. A linhagem celular que estou utilizando expressa estavelmente luciferase, permitindo a análise bioluminescente do crescimento tumoral in vivo. Portanto, este modelo permitirá o monitoramento não invasivo de terapêuticas para doenças hepáticas.Ok, vamos em frente e iniciemos este procedimento hoje. Os instrumentos de que precisamos são tesoura de dissecação, porta-agulha, duas pinças pequenas, lâmina de bisturi tamanho 10, sutura de polipropileno 5-0 para fechamento da pele, sutura de poliglactina 4-0 para fechamento da camada peritoneal, laços de Vicryl 3-0 para divisão do baço, solução salina, agulha de insulina 29 gauge para injeção anestésica, agulha de insulina 26 gauge para injeção da suspensão tumoral, suspensão de células tumorais em meio livre de soro, anestésico injetável, marcador de pele e compressas estéreis pré-cortadas. O modelo murino que utilizarei hoje é o camundongo nu Athymic MF1.Outros modelos, como o C57 e o BC, podem ser utilizados com linhagens celulares tumorais apropriadas. Uma placa aquecedora é usada e um anestésico geral injetável é administrado em um laboratório. A profundidade da anestesia é avaliada por meio da compressão do dedo do pé.Não deve haver reflexo de retirada do dedo do pé ao apertar o dedo. O rato do tamanho de um joelho está adequadamente posicionado e fixado com fita adesiva, e o abdômen é preparado com Betadine e coberto de forma asséptica. É feita uma incisão subcostal, entra-se na cavidade abdominal, identifica-se o baço e exterioriza-se o mesmo.O baço é isolado do restante do camundongo utilizando uma gaze estéril pré-cortada. Dois laços verticais são passados entre os dois pedículos vasculares e amarrados suavemente. O baço é dividido em dois hemibaços iguais.Um hemiespleno é utilizado para a inoculação de células tumorais. As células tumorais são injetadas lentamente no hemiespleno para evitar vazamento. As células tumorais viajam pela circulação porta e chegam ao fígado.Após 10 minutos de incubação, o hemiesplênio injetado é ressecado e o outro hemiesplênio é retornado à cavidade abdominal. Suturas absorvíveis e um ponto contínuo são utilizados para fechar a cavidade peritoneal, e sutura de polipropileno 5-0 não absorvível é usada para o fechamento da pele. A recuperação é realizada de forma rotineira.O desenvolvimento da doença hepática pode ser avaliado ao longo do tempo utilizando imagem ivus 2D. O camundongo é anestesiado como anteriormente e o substrato Lucifer é administrado por via intraperitoneal. O camundongo é colocado sobre a platina na câmara a 37 graus.A imagem é obtida durante três minutos e é produzida uma imagem sobreposta do camundongo com a luminescência detectada. Três semanas após o tratamento, o abdômen é aberto e é identificada uma doença hepática difusa. Em conclusão, esta técnica permite a indução do crescimento de células tumorais metastáticas localizadas no fígado, e a imagem por luminescência possibilita a visualização e quantificação do crescimento tumoral, bem como a aplicação na avaliação de respostas terapêuticas.

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Research

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Medicine

Medicina

Luciferase modificados xenotransplantes tumorais humanos cerebral intracraniana pode ser estabelecida em camundongos atímicos, com posterior acompanhamento do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem de bioluminescência. Em combinação com a análise de sobrevivência, o monitoramento bioluminescência é uma ferramenta de pesquisa essencial para ensaios pré-clínicos de terapias sendo considerado para o tratamento de tumores cerebrais.

Estabelecer xenoenxertos tumor intracraniano Cérebro com posterior análise do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem Bioluminescência

Imagem de bioluminescência de hipóxia induzida a atividade do fator-1α é aplicada para monitorar o desenvolvimento hipóxia intracraniana tumor em um câncer de mama modelo de cérebro de rato metástase.

Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

Este vídeo demonstra um modelo ortotópico de câncer de pâncreas que utiliza Matrigel para entrega celular localizada e imagens de bioluminescência in vivo para monitoramento não invasivo da progressão do tumor. O modelo ortotópico é adequado para modelos singênicos e de xenoenxerto e pode ser usado em ensaios pré-clínicos para investigar o impacto de novas terapias anticâncer no crescimento do tumor pancreático primário e metástase.

Modelo de camundongo com câncer de pâncreas ortotópico bioluminescente: uma técnica não invasiva para monitorar a progressão do câncer em camundongos

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Imagem bioluminescente da progressão do tumor de mama em um modelo de camundongo fêmea

Fonte: Clark, A.J., et al. Imagem de bioluminescência de um modelo animal imunocompetente para glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra imagens de bioluminescência para rastrear a progressão do glioblastoma em um modelo de camundongo imunocompetente, usando células tumorais que expressam luciferase e luciferina para quantificar o crescimento do tumor de forma não invasiva.

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Uma melhor compreensão da biologia do câncer de pâncreas é criticamente necessário para permitir o desenvolvimento de melhores opções terapêuticas para o tratamento de câncer no pâncreas. Para atender a essa necessidade, nós demonstramos um modelo ortotópico de câncer pancreático que permite o monitoramento não-invasivo de progressão do câncer...

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imagem de bioluminescência é uma ferramenta bem conhecida para localizar tumores e metástases, mas a quantificação dessas imagens muitas vezes requer cálculos complexos e instrumentos particulares. Nós descrevemos o método luminoscore de usar fácil, com base nas condições de aquisição precisas, sem necessidade de cálculos, e permitindo que a carga tumoral e resposta ao tratamento a ser monitorado em modelos do rato.

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