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Biologia
0 vistas • 2:59 min • April 30th, 2023
- Sob um microscópio de dissecção e em meio suplementado com soro, remova o trato reprodutivo de cada mosca com uma pinça. Primeiro, remova partes do trato digestivo que podem ter acompanhado o trato reprodutivo. Para isolar as glândulas acessórias e o ducto ejaculatório, remova os testículos, o bulbo ejaculatório e os terminalia. Lave o tecido por um a dois minutos em PBS para remover o soro. Em seguida, transfira-o para a solução de dissociação.
Para expor as células dentro das glândulas à solução de dissociação, segure o centro de cada glândula com uma pinça e corte a glândula com uma pinça afiada. Remova a porção proximal da glândula e o ducto ejaculatório para deixar para trás a extremidade distal das glândulas contendo a rara população de células secundárias responsáveis pela secreção de proteínas envolvidas no acasalamento. Por fim, transfira as pontas das glândulas acessórias para um tubo de microcentrífuga em preparação para a digestão. No protocolo a seguir, dissecaremos as glândulas acessórias para isolar células secundárias para análise do transcriptoma.
- Antes de iniciar o procedimento, corte e chame pontas redondas e largas de 200 microlitros para manusear as glândulas e passe a abertura da ponta de várias pontas de 1000 microlitros perto de uma chama por menos de um segundo para estreitar as aberturas. Em seguida, classifique as pontas modificadas de mais estreitas para mais largas com base em sua velocidade de aspiração. Para a dissecção da glândula acessória, coloque 20 a 25 drosófilas machos em um prato de vidro sobre gelo e use uma pinça e um microscópio de dissecção para remover o trato reprodutivo de uma mosca macho.
Limpe o par de glândulas acessórias de todos os outros tecidos, incluindo os testículos e o bulbo ejaculatório, e transfira as glândulas acessórias para uma placa de vidro contendo meio suplementado com soro à temperatura ambiente. Quando 20 pares de glândulas acessórias forem coletados, lave as glândulas em um prato de PBS por um a dois minutos em temperatura ambiente. No final da lavagem, transfira as glândulas para uma solução de dissociação recém-preparada e use uma pinça afiada sob um microscópio de dissecação para apertar firmemente o meio de um lobo glandular.
Usando um segundo par de pinças, corte o tecido com a ponta afiada para separar a região proximal da glândula acessória e o ducto ejaculatório da porção da glândula que contém células secundárias. Em seguida, use uma ponta de pipeta de 200 microlitros arredondada de chama pré-úmida para transferir as glândulas para um tubo de 1,5 mililitro.
Este artigo detalha um protocolo para dissecar as glândulas acessórias de Drosophila macho a fim de isolar células secundárias para análise de transcriptoma. O método envolve a remoção cuidadosa de tecidos reprodutivos e digestivos para obter as glândulas necessárias para estudos posteriores.
O dissecção precisa e o isolamento das células secundárias da glândula acessória masculina de Drosophila permitem um perfil transcriptômico de alta fidelidade em um modelo geneticamente manipulável. Este fluxo de trabalho apoia a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pesquisas de biologia reprodutiva e vias secretoras. A reprodutibilidade e a especificidade por tipo celular do método aumentam a confiança preditiva para aplicações genômicas funcionais e triagens subsequentes.
Este protocolo de dissecção e isolamento situa-se na interface entre a descoberta inicial e a identificação de alvos, permitindo análises robustas específicas de tipo celular que orientam a seleção de alvos e estudos mecanicistas.
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Última atualização: 29 agosto 2026